1株粗糙型布魯氏菌誘導株RB71的生物學特性研究

辛凌翔，馮 宇，徐 磊，任小俠，孫浩杰，丁家波，毛開榮，李曉寧，李俊平，王 楠

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性的兼性胞內寄生菌，主要寄生于巨噬細胞和胚胎滋養層細胞[1]。布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人獸共患傳染病，可導致多器官慢性損傷，在世界范圍內廣泛流行，嚴重威脅人類食品安全和公共衛生安全[2]。預防控制布魯氏菌病對畜牧業生產發展和人類健康至關重要[3]，為減輕布魯氏菌病對人類和動物種群的影響，提出并制定可預防的策略十分關鍵[4]。到目前為止，疫苗免疫仍是防控該病的重要手段[5]，目前主要應用的疫苗為光滑型疫苗，雖然具有良好的免疫效果，但安全性不高，并且容易產生陽性血清干擾診斷，無法區分免疫牛和自然感染牛[6]。由于粗糙型布魯氏菌毒力較弱，且能提供對光滑型布魯氏菌的免疫保護，不會干擾臨床檢測，因此，開發適宜的粗糙型疫苗具有重要的意義。本實驗室前期以布魯氏菌A19為親本株，利用op誘導劑成功誘導出布魯氏菌弱毒株，命名為誘導株RB71。由于wboA基因編碼光滑型布魯氏菌脂多糖O側鏈合成相關的糖基轉移酶，wboA基因的不完整性對布魯氏菌光滑表型存在重要影響[7]。通過結晶紫染色鑒定、熱凝集試驗、脂多糖完整性鑒定試驗等方法，結合測序等技術發現，誘導株缺失的基因中含有wboA基因，誘導株連續培養30代基因組未發生突變，說明誘導株RB71為具有遺傳穩定性的粗糙型布魯氏菌。為進一步驗證其安全性、免疫力與毒力，本實驗利用布魯氏菌病的小鼠感染模型[8]，模擬布魯氏菌的感染，通過分離確認感染等指標[9]，探究粗糙型布魯氏菌誘導株RB71的生物學特性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和試驗動物 牛種布魯氏菌誘導株RB71，由本實驗室誘導制備[10]；牛種布魯氏菌疫苗株A19，檢驗用布魯氏菌強毒株M28[11]，來自國家獸醫微生物菌種保藏中心；SPF級5～7周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，購買后飼養于生物安全三級實驗室的獨立送風負壓飼養系統。涉及布魯氏菌活菌的試驗操作及動物試驗均在中國獸醫藥品監察所BSL-3、ABSL-3實驗室內完成。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自BD公司；胰蛋白胨、酵母浸出膏購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養箱，游標卡尺。

1.2 藥敏試驗 藥敏紙片擴散法：將親本株A19和誘導株RB71分別以109CFU/mL涂布TSA平板，并在平板中央放置藥敏紙片，β-內酰胺類抗生素包括青霉素(penicillin)、氨芐青霉素(ampicillin)、羧芐青霉素(carbenicillin)；非β-內酰胺類抗生素包括環丙沙星(ciprofloxacin)、鏈霉素(streptomycin)、四環素(tetracycline)、多粘菌素(polymyxin)、利福平(rifampin)，37 ℃孵育72 h后用游標卡尺測量抑菌圈大小。

1.3 最小免疫劑量測定試驗 用TSA培養基復蘇保存于-80 ℃冰箱的誘導菌株RB71，并擴大培養至對數生長期，進行活菌計數，用生理鹽水稀釋至1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/只的免疫劑量。將60只5～7周齡BALB/c雌性小鼠，隨機分成6個免疫組，10只/組，同時設立PBS對照組。免疫45 d后，對6組小鼠進行布魯氏菌強毒株腹腔注射攻毒，攻毒后45 d剖殺小鼠，無菌采取脾臟，研磨，10倍比稀釋勻漿液，每只小鼠均取100 μL稀釋菌液涂抹到TSA平板上，37 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，進行菌落計數，確定誘導株的最小免疫劑量。

1.4 小鼠體內感染試驗 利用小鼠感染模型，對RB71誘導株的毒力和免疫保護力進行評價[12]。用TSB培養基將布魯氏菌A19株、RB71誘導株培養至穩定期，細菌計數并用生理鹽水將細菌稀釋至1×109CFU/mL。將5～7周齡雌性BALB/c小鼠27只，分組、每組9只，其中一組設為PBS對照組，其余兩組分別為親本株A19組和誘導株組，對小鼠腹股溝皮下注射免疫，每只100 μL(108CFU/只)。在免疫后2周、5周和8周解剖小鼠，無菌采取小鼠脾臟，研磨脾臟組織，10倍比稀釋后，涂布TSA平板，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養3～5 d，計算脾臟細菌載量[13]。

1.5 統計學分析 使用Graphpad Prism 5軟件對試驗數據進行分析。實驗結果以平均值和標準誤來表達，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 藥敏試驗結果 為探究缺失基因是否影響細菌對抗生素的耐受程度，本實驗通過藥敏紙片擴散法，分別以相同濃度涂布TSA平板，孵育后測量抑菌圈大小，來測定親本株A19、誘導株RB71對β-內酰胺類抗生素和非β-內酰胺類抗生素的敏感性。通過對包括青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、環丙沙星、鏈霉素、四環素、多粘菌素、利福平在內的8種抗生素進行檢測，結果如圖1所示，兩個菌株對8種抗生素的抑菌程度差異無統計學意義。因此，誘導株RB71相關基因的突變并沒有改變細菌對β-內酰胺類抗生素和非β-內酰胺類抗生素的敏感性。

2.2 誘導株RB71最小免疫劑量的測定試驗結果 誘導株RB71以1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/只的劑量腹股溝注射免疫小鼠45 d后，用強毒株M28 以1×103CFU/只的劑量進行攻毒試驗，45 d后，剖殺并無菌取脾臟，圖2為布魯氏菌誘導株RB71以不同劑量感染小鼠后脾臟的直觀圖。脾臟分菌結果如表1所示：對照組全部分離出細菌，保護率為0，對照成立；免疫試驗組在免疫劑量為109CFU/只時，50%(5/10)小鼠脾臟分離不到活菌，保護率達50%；免疫劑量為1010CFU/只時，30%(3/10)小鼠脾臟分離不到活菌，免疫保護率開始下降；免疫劑量為1011CFU/只時，20%(2/10)小鼠脾臟分離不到活菌，保護率降至20%。脾臟分菌結果顯示，當免疫劑量為1×109CFU/只時，免疫保護率最高，當免疫劑量達1×1011CFU/只時，感染小鼠后免疫保護程度反而降至與1×108CFU/只組相同，僅有20%的感染小鼠得到保護。因此，確定誘導株RB71對小鼠的最小免疫劑量為1×109CFU/只。

表1 誘導株RB71對感染小鼠的保護情況及感染小鼠的脾臟分離的活菌數量Tab.1 The protective effect of induced strain RB71 on infected mice and the status of bacteria shedding of infected mice

2.3 誘導株RB71的毒力測定試驗結果 為研究誘導株RB71在小鼠體內的毒力是否發生改變，將親本株A19和誘導株RB71以1×108CFU/只的劑量腹股溝皮下注射5～7周齡SPF級BALB/c小鼠，并在感染后2周、5周和8周剖殺小鼠，通過脾臟稱重和載菌量的方法評價細菌毒力，試驗結果如圖3和圖4所示。感染后2周、5周和8周，RB71感染組的小鼠脾臟重量均低于A19感染組，其中感染后2周和8周存在差異(P<0.05)，感染后5周存在差異(P<0.01)，A19感染組的小鼠脾臟主要表現為體積增大，RB71感染組與空白對照組小鼠脾臟大小無明顯差異(P>0.05)。感染后5周，33%(1/3)的RB71感染組小鼠體內細菌已被清除，A19感染組的脾臟載菌量仍維持高位；感染后8周，RB71感染組小鼠體內細菌已全部清除，A19感染組的脾臟載菌量仍保持較高水平。由此可知，誘導株RB71對小鼠的毒力較弱，且毒力顯著低于親本株A19。

3 討 論

布魯氏菌脂多糖(LPS)是否具有完整的O鏈是區分粗糙型布魯氏菌與光滑型布魯氏菌的依據，光滑型布魯氏菌具有完整的O鏈，粗糙型布魯氏菌沒有O鏈或O鏈不完整[14]。光滑型布魯氏菌和粗糙型布魯氏菌在血清學試驗上無交叉反應，但可具有免疫交叉保護性。目前我國對牛布魯氏菌病應用的疫苗主要是A19疫苗，但由于A19疫苗株為光滑型布魯氏菌強毒株，使得免疫時易造成環境污染和人員感染，且無法用常規的血清學檢測方法鑒別診斷免疫動物和自然感染動物[15]。開發粗糙型布魯氏菌疫苗可有效解決光滑型疫苗免疫不能區分自然感染與疫苗免疫的問題。獲得粗糙型布魯氏菌突變體的方法主要包括，培養過程中自發變異、在不同培養基或體內中連續傳代變異、利用分子遺傳學的方法誘變等[16]。本實驗室前期以A19株為親本株，通過op誘導劑誘導的方法，已獲得了1株粗糙型的具有良好遺傳穩定性的牛種布魯氏菌誘導株[10]。相對于抗生素抗性培養基篩選獲得的菌株，該方法誘導效率更為高效，還可以避免由于抗生素抗性基因的存在而導致的菌株對抗生素不敏感的問題，更好地保證生物安全性[17-18]。

為探究缺失基因是否會影響或改變細菌對抗生素的耐受程度，本研究通過藥敏試驗發現，親本株A19與誘導株RB71對β-內酰胺類抗生素和非β-內酰胺類抗生素的敏感性無顯著差異。為驗證誘導株RB71作為疫苗候選株對動物的保護力，本研究通過動物試驗測定了誘導株RB71免疫小鼠后的攻毒保護率，結果顯示其最佳免疫劑量為109CFU/只，保護率可以達到50%。誘導株RB71最小免疫劑量測定試驗中發現，當免疫劑量高于1×109CFU/只時，免疫保護率逐漸下降，分析主要原因為誘導株RB71雖為毒力弱的菌株，但是活菌在體內仍具備繁殖能力及一定的致病性，當誘導株RB71免疫劑量較小時，無法抵抗強毒株的感染，免疫保護率較低。但當免疫劑量高于1×109CFU/只時，本實驗中免疫后90 d，小鼠脾臟可能無法清除感染的菌株。究竟脾臟分離的菌株是感染的強毒株還是免疫的RB71株，或是兩種菌株共同存在，仍需通過進一步毒力試驗進行驗證。通過測定感染小鼠脾臟的載菌數和脾臟大小來評價布魯氏菌誘導株RB71的毒力強弱[19]，證實誘導株RB71引起脾臟腫大程度遠低于親本株A19，其感染機體后能被逐漸清除，即毒力減弱后仍能引起一定的免疫反應，能對動物抗體產生一定保護力。通過對誘導株RB71的生物學特性研究，證明誘導株RB71對抗生素敏感、毒力小，具有良好的免疫原性。為研究制備一種低毒力、高安全性的布魯氏菌病疫苗株提供新的可能。

利益沖突：無

引用本文格式：辛凌翔，馮宇，徐磊，等. 1株粗糙型布魯氏菌誘導株RB71的生物學特性研究[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(8)：693-697. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.094