IgA腎病患者血清Klotho水平與氧化應激及腎功能指標的相關性

梁 艷 孫蔚楠 張 宏 朱 清

（河南省人民醫院腎內科，河南省腎病重點實驗室，鄭州大學人民醫院，鄭州 450003）

IgA 腎病（IgA nephropathy，IgAN）是一種以系膜區IgA 沉積為主要病理特征的原發性腎小球疾病，也是導致終末期腎功能衰竭的主要病因之一，其發病率約占原發性腎小球疾病的47.50%~52.66%，且有明顯升高的趨勢［1-2］；IgAN 雖然呈慢性進行性進展，但約有1/3患者在10~20年后發展至終末期腎臟病，嚴重威脅著人們的身體健康［3］。目前，IgAN 診斷仍以腎穿刺活檢為“金標準”，但腎活檢作為有創性操作，存在著各種禁忌證和并發癥風險；因此，尋找高敏感度和特異度的生物標志物對IgAN 早期診斷和監測治療具有重要意義。Klotho 是一種在腎臟、腦組織和甲狀旁腺中廣泛表達的抗衰老基因，其編碼的分泌型蛋白可以激素樣物質進入血液而發揮抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用［4-5］。研究顯示，血清Klotho水平降低與糖尿病腎病和慢性腎臟病等疾病發生發展有關，且其表達水平與氧化應激和腎功能指標有一定的相關性［6-7］；但在IgAN 患者中該方面的研究較少。本研究擬分析血清Klotho 與IgAN 患者氧化應激及腎功能指標的相關性，旨在為血清Klotho用于IgAN診療提供新的參考依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集2019 年5 月至2020 年10月河南省人民醫院腎病內科收治的86例IgAN 患者，納入標準：①IgAN 患者均經腎穿刺活檢后診斷為IgAN；②對參與本研究知情同意。排除標準：①妊娠者；②患有糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、肝炎、高血壓和惡性腫瘤等疾病者；③近3 個月服用激素或免疫抑制劑者。86例患者中男47例、女39例，年齡（37.45±10.02）歲，體重指數（24.17±1.84）kg/m2；按照Lee 氏病理分級標準［8］將其分為輕度組（Ⅰ~Ⅱ級，共36例）、中度組（Ⅲ級，共32例）和重度組（Ⅳ~Ⅴ級，共18例）。另外選取同期77例健康體檢者作為對照組，其中，男40例、女37例，平均年齡（35.26±8.85）歲，體重指數（23.32±2.10）kg/m2。IgAN 組和對照組在性別、年齡和體重指數方面差異均無統計學意義（P＞0.05）。該實驗獲得河南省人民醫院倫理委員會的批準同意。

1.1.2 試劑與儀器 ELISA 試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）；BK-600全自動生化儀（山東博科再生醫學有限公司）。

1.2 方法 所有研究對象采集5 ml 晨起靜脈血，1 000 r/min 離心5 min 收集血清；留取所有研究對象的24 h 尿液。參照ELISA 試劑盒說明書檢測血清Klotho 和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，BK-600全自動生化儀檢測腎功能指標血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平和 24 h 尿蛋白，并以MDRD方程計算腎小球濾過率（eGFR）。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0 進行分析，對照組和IgAN 組之間采用獨立樣本t檢驗進行比較，而輕度組、中度組和重度組采用單因素方差分析進行比較；血清Klotho 與IgAN 患者氧化應激、腎功能指標的相關性則采用Pearson 法進行分析。P＜0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IgAN 組和對照組間血清Klotho 水平比較 如表1結果顯示，IgAN組患者血清Klotho、SOD和eGFR水平明顯低于對照組，而 MDA、Scr、BUN 和 24 h 尿蛋白水平明顯高于對照組（P＜0.05）。

表1 IgAN組與對照組間血清Klotho、氧化應激指標和腎功能指標水平的比較（）Tab.1 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN group and control group（）

表1 IgAN組與對照組間血清Klotho、氧化應激指標和腎功能指標水平的比較（）Tab.1 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN group and control group（）

Groups Control（n=77）IgAN（n=86）t P Klotho/（U·L-1）118.77±10.48 91.49±8.99 17.89＜0.001 SOD/（U·L-1）82.72±6.59 67.54±7.39 13.78＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）6.25±0.48 8.46±1.55 12.00＜0.001 Scr/（μmol·L-1）55.91±4.64 108.08±29.26 15.47＜0.001 BUN/（mmol·L-1）6.30±1.42 11.58±3.61 12.03＜0.001 24 h urine protein/g 0.05±0.03 1.17±0.49 20.02＜0.001 eGFR/［ml/（min·1.732）］122.60±16.36 80.43±16.67 16.27＜0.001

2.2 不同嚴重程度組間血清Klotho 水平比較 如表2 結果顯示，輕度組、中度組和重度組IgAN 患者血清 Klotho、SOD、MDA、Scr、BUN、24 h 尿蛋白、eGFR 水平整體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中重度組和中度組Klotho水平均低于輕度組，而重度組低于中度組。

表2 不同嚴重程度IgAN組間血清Klotho、氧化應激和腎功能指標水平的比較（）Tab.2 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN groups with different severity（）

表2 不同嚴重程度IgAN組間血清Klotho、氧化應激和腎功能指標水平的比較（）Tab.2 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN groups with different severity（）

Note：Compared with mild group，1）P＜0.05；compared with moderate group，2）P＜0.05.

eGFR［ml/（min·1.732）］98.33±6.46 74.68±5.131）56.89±3.651）2）373.92＜0.001 Groups Klotho/（U·L-1）SOD/（U·L-1）Scr/（μmol·L-1）Mild（n=36）Moderate（n=32）Severe（n=18）F P 98.56±7.02 91.13±5.251）82.07±6.151）2）42.99＜0.001 74.27±4.02 65.45±4.361）58.57±3.251）2）100.02＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）7.68±1.25 8.53±1.031）9.87±2.111）2）14.70＜0.001 83.35±10.26 117.84±15.391）146.18±21.241）2）113.34＜0.001 BUN/（mmol·L-1）8.82±1.52 12.65±3.021）15.42±3.481）2）41.98＜0.001 24 h urine protein/g 1.15±0.21 1.38±0.271）1.66±0.421）2）19.48＜0.001

2.3 IgAN 患者血清Klotho 與氧化應激及腎功能指標的相關性 如表3 結果顯示，IgAN 患者血清Klotho與SOD、eGFR呈正相關（P＜0.05），而與MDA、Scr、BUN和24 h尿蛋白呈負相關（P＜0.05）。

表3 Klotho與IgAN患者氧化應激、腎功能指標的相關性Tab.3 Correlation between Klotho and oxidative stress and renal function indicators in IgAN patients

2.4 血清Klotho 在IgAN 診斷中的價值 ROC 分析結果顯示，Klotho 診斷IgAN 的ROC 曲線下面積為0.975（95%CI為0.937~0.993），診斷敏感度和特異度分別為93.02%和92.21%，對應的最佳診斷臨界值為103.27 U/L，見圖1。

圖1 血清Klotho診斷IgAN的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum Klotho in diagnosis of IgAN

2.5 血清Klotho 在IgAN 病情診斷中的價值 ROC分析結果顯示，血清Klotho 鑒別診斷輕度和中度IgAN 的 ROC 曲線下面積為 0.735（95%CI為 0.614~0.835），敏感度和特異度分別為93.75% 和52.78%，診斷臨界值為97.01 U/L（圖2A）；鑒別診斷中度和重度IgAN 的ROC 曲線下面積為0.858（95%CI為0.730~0.940），敏感度和特異度分別為77.78% 和 84.37%，診斷臨界值為 85.81 U/L（圖2B）。

圖2 血清Klotho診斷IgAN嚴重程度的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum Klotho in diagnosis of IgAN severity

3 討論

IgAN 又名Berger's 病，是因糖基化異常的IgA1免疫復合物沉積于腎小球所引起的一系列病理改變，臨床主要表現包括血尿、蛋白尿和腎功能異常等。目前，有創性檢查腎穿刺活檢仍是IgAN診斷的“金標準”，不便反復操作且給患者帶來一定的傷害［9］，因此，亟需尋找一種特異性生物學標志物用于IgAN 診療。Klotho 是一種衰老抑制基因，其編碼的蛋白包括膜結合型和分泌型兩種，其中膜結合型Klotho 主要表達于腎臟遠曲小管中，可通過與成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）受體結合在鈣磷代謝等過程中發揮重要作用；而分泌型Klotho 是由組織分泌后釋放到胞外并進入體液循環，可于血液、尿液和腦脊液等體液中檢測到，具有唾液酸酶的作用［10］。本研究在外周血中檢測到的主要是分泌型Klotho。Klotho 已被報道在慢性腎臟病（chronic kidney diseases，CKD）、糖尿病腎病和急性腎損傷等腎臟疾病中呈低表達狀態，與腎損傷程度密切相關，增加Klotho 表達可發揮腎臟保護作用［11-12］。本研究比較了 86例 IgAN 患者和 77例健康體檢者血清中Klotho 表達水平，結果發現IgAN 患者血清Klotho 水平明顯降低；進一步分析發現，隨著IgAN 病情程度的加重，血清中Klotho 水平減低逐漸明顯，提示血清Klotho 與IgAN 病情進展密切有關。目前，關于IgAN 發病機制并不完全清楚，但已被證實與氧化應激反應密切相關［13］。含IgA 免疫復合物可刺激系膜細胞產生氧自由基，引起抗氧化物SOD和谷胱甘肽過氧化酶等減少，而氧化反應產物MDA和終末氧化蛋白產物等增多，打破原有的氧化-抗氧化平衡，激活氧化應激反應造成腎組織損傷，促進IgAN 的發生發展［14］。有學者探討了氧化應激指標SOD、MDA 等在 IgAN 中的異常變化［15］，但未見IgAN不同病情中這些指標的差異性研究。本研究進一步驗證了IgAN 患者中SOD 水平降低而MDA 升高的狀態，且隨著患者病情進展差異越明顯。有研究顯示，Klotho 對組織氧化應激反應具有一定抑制作用［15-16］。XING 等［17］研究發現，過表達糖尿病小鼠的Klotho 水平可以激活核因子-紅細胞2 相關因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路從而抑制糖尿病誘導的腎臟氧化應激損傷和足細胞凋亡，改善腎功能并降低腎小球硬化。Wnt 信號通路的激活是公認的腎臟氧化應激損傷和足細胞凋亡的主要機制［18］；KIM 等［19］研究發現 Klotho 表達可顯著影響Wnt信號轉導相關轉錄本和蛋白的表達水平，提高Klotho 蛋白表達水平可提高細胞的ATP 水平和抗氧化活性，因此推測Wnt 信號通路也是Klotho 介導氧化應激損傷的機制之一。此外，關于Klotho 與腎功能的相關性也已有許多報道，其主要機制在于 Klotho 與 FGF 的結合［20］；FGF23 在阻止CKD 磷酸鹽積累中發揮重要作用，而這一過程依賴于Klotho 對FGF 受體的激活，并通過抑制Wnt/βcatenin 通路調節腎損傷過程，腎功能指標也隨之發生改變［21］。因此，Klotho 水平與腎功能指標存在相關性。目前，雖然在IgAN 中已有關于Klotho 的研究，但多集中在Klotho 甲基化或多態性與IgAN 進展和腎功能方面［22-23］，而關于分泌型 Klotho 與 IgAN 患者氧化應激和腎功能相關性的研究未見報道。本研究進行Pearson 相關性分析發現，IgAN 患者血清Klotho 與 SOD、eGFR 呈正相關，而與 MDA 和腎功能相關指標Scr、BUN、24 h尿蛋白呈負相關，提示下降的Klotho 水平與IgAN 患者的氧化應激水平及腎功能密切相關，Klotho 可能通過調節抗氧化能力調節IgAN患者的腎功能。

有研究報道，血清Klotho 在急性腎損傷早期診斷方面具有潛在的臨床價值，其敏感度和特異性分別高達92%、94%［24］；另外，在2 型糖尿病腎臟病診斷方面，血清Klotho 的診斷敏感度和特異度分別為95.6%、84.5%［25］。可見，Klotho 在腎臟相關疾病方面具有潛在的診斷價值。目前部分研究報道了Klotho 在 CKD 診斷中的價值［26］，但關于其在 IgAN 中的意義尚無報道。本研究對血清Klotho 在IgAN 患者中的診斷價值進行ROC 曲線分析結果發現，當血清Klotho 診斷IgAN 的曲線下面積為0.975，其診斷臨界值對應的敏感度和特異度分別為93.02%和92.21%；此外，其診斷輕中度、中重度IgAN 的曲線下面積分別為0.735和0.858，診斷臨界值的敏感度分別為93.75%和77.78%，特異度分別為52.78%和84.37%，提示血清Klotho 水平對于IgAN 的診斷以及嚴重程度的判斷均有一定價值，有望成為在臨床推廣的IgAN生物標志物。值得注意的是，本研究未進行膜結合型Klotho 表達水平的檢測，因此不能給出膜結合型Klotho 與IgAN 診斷的明確結論；而由于膜結合型Klotho 主要表達于腎臟組織，其檢測需要借助于組織穿刺后的免疫組化實驗，因此該指標的研究及在臨床上的應用有一定局限性。因此，外周血中分泌型Klotho 可作為未來IgAN 診斷和靶向指標的主要研究方向。

綜上所述，IgAN 患者血清Klotho 水平顯著低于對照組，且病情越嚴重血清Klotho 水平越低；血清Klotho 與IgAN 患者氧化應激水平及腎功能指標均有明顯相關性；血清Klotho 可用于IgAN 診斷和嚴重程度的評估。該結果為后續深入探討Klotho 參與IgAN 病情進展的分子機制以及將血清Klotho 作為監測指標診斷和評估IgAN 病情提供了新的參考依據。