2株嗜熱脂肪芽孢桿菌的基因組和耐藥性分析

呂 濤，孫志文，李 倩，畢言鋒，朱 奎

(1. 北京市獸藥監察所，北京 大興 102629 ; 2. 中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193 ;3. 北京英太格瑞檢測技術有限公司，北京 海淀 100095)

近年來，隨著人們對動物源食品安全關注度逐步提高，獸藥殘留檢測技術也飛速發展，高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法和酶聯免疫吸附法等都是常用的特異性強且靈敏度高的檢測方法。微生物抑制藥物殘留檢測方法對設備的要求比較低，且檢測成本較低，適用于對大批量樣本進行同時檢測。嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus,previouslyBacillusstearothermophilus)由于其培養條件穩定并且對多種抗生素敏感度較高，是被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)認可的、國際公認的最常用的抗生素殘留檢測指示菌株。國標 GB/T 4789.27—2008中規定了2種檢測鮮乳中抗生素殘留的方法，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法是其中之一[1-2]。此外，嗜熱脂肪芽孢桿菌由于其所產芽孢對壓力蒸汽抵抗力在大多微生物之上，被歐洲、美國等國家的藥典作為熱力滅菌生物指示劑的標準菌株[3-4]。我國衛生部也將該菌株作為壓力蒸汽滅菌效果標準檢測菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》(GB 15981—1995)。近年來，隨著對嗜熱芽孢桿菌的關注度越來越高，人們對其基因組研究也逐漸深入。已有研究表明，通過全基因組測序分析可知嗜熱芽孢桿菌中的次級代謝產物的種類，例如脂肽、多肽、脂肪酸、乳糖、聚合物、聚酮化合物、異香豆素類等[5]。但有關嗜熱脂肪芽孢桿菌中的質粒研究的較少，全基因組序列中蘊藏的信息還需要更深入地挖掘。

本試驗以2株分離所得的嗜熱脂肪芽孢桿菌為研究對象，基于基因組序列信息和耐藥性分析，探究2株嗜熱芽孢桿菌的生物特性，篩選可應用于獸藥殘留檢測的核心菌株，以期進一步擴充此菌種的基因信息，為開發此類菌株提供數據支持及研究依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PremixExTaqVersion 2.0 (Loading dye mix)，購自TaKaRa公司；GoodView核酸染料，購自北京賽百盛基因技術有限公司；標準菌株，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)；氨芐西林、頭孢噻肟、鏈霉素、氯霉素、四環素、紅霉素、慶大霉素、環丙沙星、萬古霉素、磺胺甲噁唑等，均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 主要儀器 PCR擴增儀，美國ABI公司產品；電泳成套設備，美國Bio-Rad公司產品；凝膠成像系統，Alpha Innotech Corporation公司產品；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 16S rRNA基因序列分析 16S rRNA基因PCR擴增引物分別為27F:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGA-CTT-3′[6]。PCR反應體系：2×TaqMix 10 μL；27F引物 0.4 μL；1492R引物 0.4 μL；2株分離菌株DNA模板1 μL，陽性對照組加入1 μL標準菌株DNA模板，陰性對照組加入1 μL ddH2O，最后以ddH2O補足20 μL，進行PCR擴增。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環;之后72 ℃延伸10 min，擴增結束。PCR產物的純化與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。使用NCBI數據庫中的Blastn工具，在GenBank中進行同源性序列檢索，挑選同源性最近的基因序列，運用MEGA 7.0鄰接法構建系統發育進化樹。

1.3.2 全基因組測序及核心基因組進化樹構建 使用細菌基因組提取試劑盒提取2株分離菌株的基因組DNA，使用NanoDrop對細菌基因組DNA濃度和質量進行檢測。將提取的基因組送至北京賽默百合公司在Pacbio平臺上進行三代測序。在NCBI數據庫中檢索并下載嗜熱脂肪芽孢桿菌全基因組，使用Harvest工作包內的Parsnp(version v1.2)工具提取各分離株的核心基因組構建系統發生樹。通過在線工具iTOL將構建的系統發生樹進行可視化展示。

1.3.3 質粒序列分析 通過北京賽默百合公司Pacbio平臺進行質粒測序，使用Snapgene軟件構建質粒的標識圖譜，使用Brig軟件對菌株攜帶的質粒以及NCBI上下載的報道過的同種屬的質粒進行比對，標注開放閱讀框的功能。

1.3.4 藥物敏感性試驗 采用美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laborary Standards Institute,CLSI)推薦的K-B紙片擴散法對芽孢桿菌臨床常見的10種抗菌藥物進行抑菌活性測定。10種抗菌藥物包括：氨芐西林、頭孢噻肟、鏈霉素、氯霉素、四環素、紅霉素、慶大霉素、環丙沙星、萬古霉素、磺胺甲噁唑[7-8]。藥敏試驗質控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)，判定標準主要依照《抗菌藥物藥敏紙片判斷標準》“非高(苛)營養細菌金黃色葡萄球菌的敏感標準”。

2 結果

2.1 16S rRNA基因序列分析 現有的2株嗜熱芽孢桿菌，1株分離于腎組織的抗生素殘留檢測測試KIS試管(Commercial isolate)，另1株為實驗室保存菌株(CAU475)。為了鑒定2株分離菌株的種屬，將分離菌株的16S rRNA進行測序并將序列提交至NCBI核酸數據庫進行比對分析。運用MEGA 7.0軟件，將8株不同嗜熱芽孢菌屬的16S rRNA序列與2株分離菌株的16S rRNA基因序列進行同源性對比，其系統發育進化樹如圖1所示，2株分離菌株與嗜熱脂肪芽孢桿菌同源性較高，可以將其確定為嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.2 核心基因組進化樹分析 為進一步了解2株嗜熱脂肪芽孢桿菌的生物特性，以及其與已報道菌株的親緣關系，從NCBI中檢索并下載4株嗜熱脂肪芽孢桿菌的全基因組序列進行核心基因組進化樹的構建，其中包括作為抗生素殘留檢測的標準指示菌株GeobacillusstearothermophilusATCC 7953[9]。結果如圖2所示，Commercial isolate與G.stearothermophilusATCC 7953的同源性極高，與CAU475的同源性也較高，證明其可能具有相似的生物學特性。

圖2 嗜熱脂肪芽孢桿菌系統進化樹

將G.stearothermophilusATCC 7953作為參考菌株，將Commercial isolate和CAU475全基因組進行相似度比較，結果如圖3所示，Commercial isolate與ATCC 7953相似度為98.85%，與CAU475相似度也高達98.67%，其差異區域為第240～300位堿基，但差異區域的具體功能還有待進一步研究。

圖3 分離菌株與參考菌株基因組相似度

2.3 質粒序列分析 將Commercial isolate和CAU475全基因組進行進一步分析發現，Commercial isolate中檢測到1個45 kb大小的質粒，命名為pCOML。有關嗜熱芽孢桿菌屬基因組中質粒的研究相對染色體的研究較少，所以本試驗對pCOML序列信息進行了比對和標注，以期豐富嗜熱芽孢桿菌質粒序列信息數據庫。pGS18質粒[10]來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌，全長63.8 kb，是NCBI收錄的序列信息較全的質粒，以pGS18質粒序列作為參考，將pCOML質粒與之進行比對，數據的計算分析顯示，pCOML全長44 814 bp，共有49個假定的開放閱讀框架(Open reading frames,ORFs)，共占82.2%。39個ORFs(79.6%)被指定為假定功能；22個ORFs(44.8%)的氨基酸序列與其他微生物蛋白的相似性較高，如圖4所示，介導質粒水平轉移的轉運蛋白(traC、topB、traG、mobA)、轉錄起始位點(repE)以及部分功能蛋白 (xerC、yxlF、yokF、soJ)與已報道的pGS18質粒相似度都在90%以上。

圖4 質粒圖譜及開放閱讀框標注

2.4 藥物敏感性試驗 為探究野生菌株是否可用于抗菌藥殘留檢測，選取了10種常見抗菌藥，根據生物抑制法檢測抗菌藥殘留的檢測限，進行紙片法藥敏試驗。結果顯示Commercial isolate和CAU475對絕大多數抗菌藥都敏感(表1)，證明其可以用于抗菌藥殘留檢測的指示菌株。

表1 抗菌藥對嗜熱脂肪芽孢桿菌的藥敏試驗

3 討論

隨著人們對動物源食品安全逐漸重視，微生物抑制法殘留檢測以其成本低及方法簡便等優點被關注[9]。嗜熱脂肪芽孢桿菌是良好的抗生素殘留檢測指示菌株，但目前能作為商品化使用的菌株數量有限。本試驗分離得到2株嗜熱芽孢桿菌分別為Commercial isolate和CAU475，經16S rRNA測序及序列進化樹分析，這2株芽孢桿菌與嗜熱脂肪芽孢桿菌的相似度為98.85%和98.67%。研究報道表明，G.stearothermophilusATCC 7953常作為抗菌藥殘留檢測的標準指示菌株[11-12]。基因組的相似性一定程度上顯示了生物學特性的相似性，本試驗所得2株分離菌株與G.stearothermophilusATCC 7953的基因組同源性和相似度很高，說明其具有成為抗菌藥殘留檢測候選菌株的潛力。為進一步探究其作為抗菌藥殘留檢測菌株的可能性，本試驗參考微生物抑制法的抗菌藥殘留檢測標準，對分離菌株進行藥物敏感性測試，結果發現分離菌株敏感性均低于檢測限，且不攜帶任何毒力基因與耐藥基因，與之前的報道一致[11]，符合生物抑制法的藥物殘留檢測標準[7]，可作為候選菌株用于藥物殘留檢測。

除此之外，Stuknyte等[10]曾在嗜熱脂肪芽孢桿菌中發現質粒pGS18，且該屬質粒具有作為基因工程工具的潛力。但該屬質粒信息目前報道較少，目前只有3種已經測序完全的質粒(pSTK1、pHTA426、pLW1071)。本試驗發現Commercial isolate攜帶大小為45 kb的質粒，并對質粒功能區域進行標注，以豐富嗜熱芽孢桿菌的基因組數據信息。與之前的研究一致，該屬質粒除轉移原件外，79%的開放閱讀框編碼的蛋白功能不清，探究其編碼的蛋白功能可更好地將該屬質粒用于基因工程。

本試驗將2株嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株進行全基因組的三代測序，基于核心基因組數據分析了解菌株特性。在此基礎上探究了嗜熱脂肪芽孢桿菌的質粒構成元件，豐富了此菌株的質粒基因組數據庫，為其作為工程性質粒奠定了基礎。藥物敏感性測定為2株分離菌株作為微生物抑制劑候選菌株提供數據支持。綜上，本試驗為嗜熱芽孢桿菌的應用及基因組數據庫的擴充提供前期理論依據。