PEDV變異株的分離鑒定和S1基因序列分析

張 江，馬晶晶，高俊鋒，韓相敏，吳漢宇，李凱亮，奉中花，賴 志

(1.上海農林職業技術學院，上海 松江 201699 ； 2. 上海創宏生物科技有限公司，上海 松江 201619)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)，所有日齡的豬均易感，其中哺乳仔豬最易感，1周齡以內的仔豬感染后臨床表現為嘔吐和水樣腹瀉，3～4 d后因脫水而死，病死率平均可達50%，嚴重者接近100%，日齡較大的豬通常表現為一過性的水樣腹瀉，持續1周后可自行康復，母豬臨床也有僅表現為發熱、精神沉郁、乳汁減少和厭食的情況[1-2]。

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為帶囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為28 000 bp。其中編碼的S結構蛋白可以識別并結合宿主細胞受體，是產生中和抗體的主要靶標蛋白，與病毒入侵宿主細胞和毒力相關[3]。S蛋白是由S1(1～730 aa)亞基和 S2亞基(731～1 383 aa)共1 383個氨基酸組成，其中S1亞基與受體的結合有關，也是誘導產生中和抗體的主要區域。PEDVS基因是PEDV重要的毒力基因，不同毒株之間S1基因高度易變，表現為堿基突變、插入或缺失，其遺傳變異性可造成PEDV毒力的改變[4-5]，所以PEDV變異毒株和經典毒株的變異主要集中在S1區域，根據PEDVS1基因遺傳進化樹比對分析可將PEDV分為GⅠ和GⅡ兩大分支，GⅠ分支主要由經典株G1和S-INDEL毒株組成，GⅡ分支主要由中國流行變異株G2b及美國、加拿大毒株G2a組成，可以通過對S1基因的鑒別診斷和測序分析判斷PEDV屬于經典株還是流行變異株，因此臨床多以PEDVS1區域比對特征作為疫苗選擇的理論依據[6]。

雖然國內發病豬場已經進行了PED疫苗的免疫，但PED仍持續發生且危害嚴重，說明現階段僅通過使用疫苗還無法保證豬場的持續穩定，疫苗毒株對不斷變異的新流行PEDV毒株存在保護力不足的情況[7-8]。本實驗室于2021年7月在江蘇某豬場因腹瀉死亡的哺乳仔豬群的腸道中分離鑒定出2株PEDV，并對其S1基因進行了擴增和序列分析，希望獲得流行毒株PEDV分子變異趨勢，為進一步鑒別PEDV疫苗株和野毒株提供理論依據，為豐富PEDV的分子流行病學和疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 Vero細胞，購自上海創宏生物科技有限公司；DMEM培養液，購自蘇州旭太生物工程有限公司，貨號：22001；胰蛋白酶，購自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：A003702；RT-PCR一步法檢測試劑，購自北京全式金生物技術股份有限公司，貨號：AH411；核酸提取試劑盒(吸附柱法)，購自龍闊(蘇州)生物工程有限公司，貨號：SJH9-2；豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重實時熒光定量PCR試劑盒，購自龍闊(蘇州)生物工程有限公司，貨號：SJH60。

1.2 主要儀器 Autopure32A核酸提取儀，杭州奧盛儀器有限公司產品；FQA-48熒光定量PCR儀，杭州博日科技股份有限公司產品；JX-FSTPRP全自動樣品組織研磨儀，上海凈信實業發展有限公司產品；37XC型光學顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司產品。

1.3 試驗動物 15頭3日齡健康哺乳仔豬，經豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重實時熒光定量PCR試劑盒檢測結果為PEDV陰性，購自廣州市某豬場。

1.4 病料處理 從江蘇省2個豬場疑似PEDV發病死亡的仔豬中分別無菌操作各采集1份腸組織，使用組織研磨儀研磨，用DMEM培養液進行5倍稀釋制成懸液，-70 ℃反復凍融3次。6 000 r/min離心20 min，分別各取5 mL上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，加入適量雙抗，-70 ℃保存作為接種材料。

1.5 病毒分離 將1.4中處理的2個樣品各1 mL接種液分別接種于已長成單層的Vero細胞(10 mL培養液)，置于37 ℃ CO2培養箱中吸附1 h，然后倒掉接毒液，新加入含4 μg胰酶的DMEM培養液10 mL，另設1瓶正常細胞作為對照。培養72 h，盲傳3代，觀察有細胞病變效應(Cytopathic effect，CPE)的繼續傳代，直至穩定。顯微鏡觀察接毒細胞CPE情況。

1.6 病毒實時熒光定量PCR鑒定 分別將病毒分離液使用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重實時熒光定量PCR試劑盒進行鑒定，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.7 病毒含量測定 按《中華人民共和國獸藥典》附錄3402中病毒半數致死感染量測定法(Reed-Muench法)測定所分離病毒在Vero細胞上的病毒含量。

1.8 PEDVS1基因檢測和分析 取在Vero細胞適應的病毒液，采用反轉錄PCR(RT-PCR)方法擴增PEDVS1基因進行鑒別診斷和測序分析。

1.8.1 引物合成 利用PEDVS1基因段鑒別引物[9]對分離毒株進行鑒別診斷，獲得的擴增片段大小為726 bp時鑒定為PEDV流行變異毒株，擴增片段大小為581 bp時鑒定為PEDV經典毒株，引物由安徽通用生物工程有限公司合成，信息見表1。

表1 PEDV S1基因鑒別引物

1.8.2 病毒RNA提取及RT-PCR檢測 使用核酸提取試劑盒提取PEDV RNA，利用表1合成的引物，使用RT-PCR檢測試劑擴增PEDVS1基因。RT-PCR反應總體積20 μL：RNA模板2 μL，2×One-step Reaction Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，ddH2O補至20 μL。RT-PCR反應程序：50 ℃ 20 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.3S1基因的克隆與序列分析 將PCR擴增產物回收純化后與pUC57克隆載體連接，轉化大腸埃希菌(E.coli) DH5α感受態細胞，菌液經PCR鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。在NCBI網站上挑選并下載GenBank中不同年份的PEDV參考毒株，利用DNASTAR、MEGA生物信息軟件對分離株測得的S1基因序列與參考毒株S1基因序列進行比對分析并繪制遺傳進化樹。

1.9 動物毒力試驗 將試驗仔豬隨機分為3個組，A組、B組和C組，每組5頭。其中A組為對照組，B組和C組為攻毒組，每頭分別灌服接種分離培養的病毒液(107.0TCID50/mL)2 mL，攻毒后觀察仔豬臨床癥狀，統計發病率和死亡率。

2 結果

2.1 病毒分離 將經過除菌處理的腸組織懸液上清液接種于Vero細胞，傳至第5代，穩定在24 h時開始出現細胞病變，表現為細胞內形成空泡，變圓皺縮；在36 h時細胞間出現拉絲，間隙增大；48 h時細胞呈梭形，脫落細胞達到60%，表現為典型細胞病變，正常對照細胞沒有病變(圖1)。

圖1 Vero細胞的細胞病變 (200×)

2.2 病毒實時熒光定量PCR鑒定 使用豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒三重實時熒光定量PCR檢測試劑盒鑒定，2份病毒分離液樣品均為豬流行性腹瀉病毒陽性，Ct值分別為15.14和13.86，傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒均為陰性。將獲得的2株分離株分別命名為DJCY和DJYJ。

2.3 病毒含量測定 按Reed-Muench法測定所分離的DJCY和DJYJ病毒含量分別為107.80TCID50/mL和108.16TCID50/mL。

2.4 PEDVS1基因檢測與分析

2.4.1 PEDVS1基因RT-PCR檢測 對出現病變的細胞接毒液使用PEDVS1基因鑒別診斷引物進行RT-PCR檢測，出現720 bp左右的目的條帶(圖2)。

圖2 分離株S1 基因的RT-PCR鑒別

2.4.2 PEDVS1基因序列分析 將2株分離株S1基因測序結果與PEDV典型毒株S1基因核苷酸序列進行比對分析。結果顯示，DJCY分離株和DJYJ分離株的同源性為99.7%，與經典毒株(ZL29-2015、OH851、DR13、JS2008、CV777、SD-M)的同源性為85.9%～87.5%，與流行變異毒株(MN、AJ1102、CH-JX-JA、JSCZ1601等)的同源性為97.1%～99.2%(圖3)。DJCY分離株和DJYJ分離株在S1基因片段內相對于經典株分別有1個氨基酸(3個堿基)的插入和2個氨基酸(6個堿基)的缺失(圖4)，屬于PEDV變異株GⅡ分支G2b型(圖5)。

圖4 利用DNASTAR軟件對流行毒株S1基因與參考毒株S1基因序列部分片段的比較分析

2.5 動物毒力試驗 B組和C組攻毒24 h后仔豬全部出現腹瀉，發病率均為100%；攻毒后7 d內B組死亡4頭，死亡率為80%；C組死亡5頭，死亡率為100%；對死亡仔豬進行剖檢，小腸腸壁變薄充血、脹氣，內有黃色水樣糞便和未消化凝乳塊(圖6)，表明DJCY和DJYJ兩毒株毒力較強，可作為疫苗檢驗用強毒。

圖6 PEDV感染仔豬的臨床剖檢

3 討論

本試驗所得2株病毒分別分離于江蘇2個豬場，均可接種Vero細胞產生細胞病變，通過實時熒光定量PCR鑒定為豬流行性腹瀉病毒，用所分離的病毒接種哺乳仔豬均出現典型的豬流行性腹瀉癥狀，體外和體內試驗都證實分離毒株均為豬流行性腹瀉病毒毒株。

豬流行性腹瀉病毒DJCY分離株和DJYJ分離株在Vero細胞上測得的TCID50分別為107.80/mL和108.16/mL，將2個分離株稀釋為107.0TCID50/mL，分別接種5只哺乳仔豬均出現典型的豬流行性腹瀉癥狀，發病率均為100%，死亡率分別為80%(4/5)和100%(5/5)，發病仔豬的腸道均表現為小腸腸壁變薄、充血等病變。說明分離到的豬流行性腹瀉病毒野毒株毒力較強。

本試驗分析了江蘇省2個豬場2021年7月引起仔豬腹瀉的主要病毒性病原的感染情況，檢測表明當前引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原依然是PEDV，這可能與PEDV為RNA病毒，本身變異風險較大有關，因此本試驗基于PEDV分離株的高變區S1基因片段進行了遺傳進化樹和同源性的相關分析，確定當前江蘇省PEDV流行株均屬于變異毒株。氨基酸序列分析顯示，與經典株相比，變異毒株具有特征性的氨基酸插入和缺失。PEDV弱毒疫苗株，在S1基因片段內相對于常見PEDV毒株有4個氨基酸(12個堿基)的插入；經典株相對于變異株分別有1個氨基酸(3個堿基)的缺失和2個氨基酸(6個堿基)的插入，可以此為依據區分疫苗株和變異株[10-12]。

目前國內秋冬季節PEDV仍然高發，糞口傳播是主要的傳播方式，此外還有乳汁傳播、垂直傳播和空氣傳播，同時場內的飼養管理也應得到重視，用具和車輛合理科學的消毒管理、欄舍的干燥溫度控制以及員工定員定崗是預防此病必須做到的基礎工作。