牛源腸聚集性大腸桿菌的分離鑒定

劉伯承，王 慧，劉俊琦，杜麗飛，2，周望平，陳一峰，馮小花，楊 俊

(1. 湖南省畜牧獸醫研究所，湖南 長沙 410131 ； 2. 湖南鑫廣安農牧股份有限公司，湖南 長沙410100)

腸聚集性大腸桿菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)是致瀉性大腸桿菌(DiarrheagenicEscherichiacoli，DEC)的亞群之一[1]，是近年新出現的一種病原體，與發展中國家和發達國家的地方性腹瀉有關，可引起兒童和成人急性和持續性腹瀉[2-4]。研究發現，EAEC在兒童致腹瀉大腸桿菌中占52.4%(85/162)[5]。EAEC是犢牛腹瀉的主要病原菌之一，Awad等[6]研究顯示，在犢牛腹瀉致病性大腸桿菌分離菌的表型中，EAEC占7.37%(11株)。大部分大腸桿菌菌株具有可運動性，可以通過食品、水源、空氣等多種方式傳播，引發疫情[7-8]。盡管近年來養牛業呈規模化、標準化、智能數字化迅速發展，養殖管理水平不斷提高，而新生犢牛腹瀉仍然是影響養殖生產水平的一個主要問題，幼犢的高死亡率和發病率給養殖場造成了重大的經濟損失。

EAEC致病機制與產生的毒素和黏附素有關，由質粒編碼的束狀菌毛(Bundle forming pili，BFP)和聚集黏附性菌毛(Aggrete ahesive fimbria,AAF)/Ⅰ和AAF/Ⅱ使EAEC能在感染細胞表面自動聚集排列成“磚狀”。耐熱聚集黏附性腸毒素Ⅰ(Enteroaggregative adherent heat stable toxin 1,EAST-1)由質粒上astA基因編碼[9]。aggR基因能調控聚集黏附菌毛、分散素、分散素轉運體Aat和Aai VI型分泌系統，在EAEC的黏附和致病過程中起著重要作用，攜帶aggR基因的菌株都被認為是典型的EAEC(tEAEC)菌株[1，10]。目前，我國有關牛腹瀉的典型EAEC菌株的研究甚少，本試驗采集死亡犢牛胸腔液、肝臟組織、腸組織和糞便樣品進行了細菌分離培養與鑒定，以1株肝臟樣品分離的純化菌為供試菌株進行了小鼠致病性試驗、腸聚集性大腸桿菌毒力基因astA、aggR及其他相關毒力因子檢測和藥物敏感性試驗，并用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹，為腸聚集性大腸桿菌流行監控及致病機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品 2020年11月從湖南省常德市某規模牛場無菌采集死亡犢牛胸腔液、肝臟組織、腸組織和糞便樣品，共4份。

1.2 主要試劑 血瓊脂培養基，購自貝瑞特生物科技有限公司；LB肉湯培養基、麥康凱培養基、伊紅美藍培養基，均購自杭州百思生物科技有限公司；大腸桿菌生化鑒定管，購自招遠拓普生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒，購自張家口賽諾生物科技有限公司；PCR Magic Mix 3.0，購自北京天恩澤基因科技有限公司；DL2 000 Marker，購自杭州博日科技股份有限公司；藥敏紙片，購自廣州譽維生物科技儀器有限公司。

1.3 主要儀器 伯樂PCR儀，購自南京伊諾達儀器設備有限公司；無菌操作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；恒溫培養箱，購自上海坤天儀器有限責任公司；高速冷凍離心機，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；凝膠成像系統，購自上海天能科技有限公司；其他材料均由本實驗室提供。

1.4 實驗動物 20日齡昆明小鼠，購自湖南斯來克景達實驗動物有限公司,生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004。

1.5 試驗方法

1.5.1 病原菌分離與染色鏡檢 用無菌棉簽采集死亡犢牛體內胸腔液、肝臟組織、腸組織和糞便樣品，置EP管中，回實驗室后加入滅菌水1 mL，浸泡3～5 min，接種于血瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養18～20 h。挑取優勢菌落劃線接種于麥康凱培養基、伊紅美藍培養基上，培養18～20 h，挑取單個菌落進行革蘭染色，顯微鏡觀察。同時轉接于LB液體培養基，搖床37 ℃恒溫培養30 h后冷藏保存，用于后續試驗。菌種加30%甘油和滅菌水各200 μL，-80 ℃保存。

1.5.2 生化鑒定 挑取純化培養的菌落接種于大腸桿菌微量生化反應管中，37 ℃恒溫培養24 h觀察結果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[11]進行鑒定。

1.5.3 DNA提取與PCR擴增 根據細菌基因組提取試劑盒說明書步驟進行操作，提取后標記為模板DNA；參照參考文獻[12]使用細菌16S rDNA通用引物擴增目的片段，大小約1 500 bp，引物序列為上游引物5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系(25 μL)：Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補水至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，54 ℃復性45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。采用1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，凝膠電泳攝像儀檢測目的條帶，PCR擴增產物送深圳華大基因科技有限公司雙向測序。

1.5.4 小鼠致病性試驗 取純化培養的單個菌落接種于5 mL的肉湯試管中，搖床恒溫(37 ℃)培養24 h，采用平板涂抹法進行細菌菌落計數，確定細菌濃度，按10倍倍比稀釋成5個梯度作為接種濃度；把30只小鼠隨機分成6個組，分別為A、B、C、D、E組和對照組，每組5只，A～E組按照濃度由高至低的順序分別注射上述5個梯度的稀釋菌液0.2 mL/只，對照組注射同劑量LB。每組加入50 g飼料，6～8 h觀察1次，試驗期為4 d，記錄小鼠精神狀況、采食量和死亡情況。用改良寇氏法計算最低死亡劑量(Minimum lethal dose，MLD)和半數致死劑量(Lethal dose 50%，LD50)。

LD50=log(-1)[XM-i(Σp-0.5)]

其中XM為最大稀釋度的對數，i為相鄰兩組稀釋度對數之差，ΣP為各組動物死亡率之和。

解剖死亡小鼠，觀察內臟組織病變，同時解剖對照組小鼠，記錄結果。用剪刀分別于小鼠心、肝、脾、腎、腸剪開一小口，用接種環在小口內來回攪動后接種于麥康凱平皿，此操作均應在無菌工作臺中完成，恒溫箱培養18～20 h，革蘭染色，顯微鏡觀察。

1.5.5 大腸桿菌毒力基因檢測 參照參考文獻[13-17]中的引物序列，用NCBI中的BLAST分析引物特異性，引物由深圳華大基因科技有限公司合成。引物序列、目的片段大小見表1。PCR反應總體系(25 μL)：Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補水至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s，退火45 s(根據不同引物的熔解溫度適當調整)，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。凝膠電泳檢測產物，產物送深圳華大基因科技有限公司雙向測序。

表1 大腸桿菌毒力基因引物信息

1.5.6 藥物敏感性試驗 用紙片法(K-B)對分離鑒定菌的純化物進行藥物敏感性試驗，參照美國臨床與實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)文件(M100-S21)判定結果。

1.5.7 生物系統進化樹 將分離菌16S rDNA序列與NCBI中下載的10個大腸桿菌代表株序列上傳至MEGA 6.0軟件，對齊序列后選擇鄰近法構建系統進化樹。

2 結果

2.1 病原菌分離與染色鏡檢 樣品接種在血瓊脂平板上呈中等大小、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、中間凸起的灰白色菌落，在麥康凱培養基上呈粉紅色菌落(圖1A)，在伊紅美藍培養基上呈紫黑色、金屬光澤菌落，形態與血瓊脂培養基上一致。分離菌革蘭染色呈陰性，顯微鏡下可見兩端鈍圓、成對或單獨排列的粉紅色短桿菌(圖1B)。4個樣品共分離出4株上述形態菌落，分離率為100%，將肝臟樣品分離株命名為HCDE/17-1，其他3株分別命名為18-1、19-1、20-1。

圖1 病原菌分離與染色鏡檢

2.2 生化鑒定 4株分離菌在麥芽糖、木膠糖、甘露糖、山梨醇、鳥氨酸及賴氨酸脫氫酶試劑管中反應均呈陽性，在硫化氫、側盞金花醇、尿素、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、苯丙氨酸試劑管中反應均呈陰性，見表2。根據大腸桿菌生化反應試劑管說明書及參考文獻[11]判定方法，分離菌與大腸桿菌生化特性一致，初步確定4株分離菌均為大腸桿菌。

表2 分離菌生化鑒定

2.3 16S rDNA基因序列分析 4株分離菌經PCR擴增，凝膠電泳成像結果顯示，目的條帶大小約為1 500 bp(圖2)，與預期大小一致。將PCR擴增產物序列上傳GenBank，用BLAST進行比對，與大腸桿菌(登錄號：MN208165.1)序列同源性為98%，確定4株分離菌均為大腸桿菌。

圖2 分離菌16S rDNA的PCR擴增

2.4 小鼠致病試驗 分離株HCDE/17-1接種小鼠32 h內，除對照組外，A、B、C、D、E組小鼠均出現精神不振、呼吸急促、弓背、蜷縮、被毛蓬松、食欲下降等癥狀，部分小鼠死亡前出現蛋花水樣腹瀉。由表3可見，A、B、C、D組中小鼠出現不同程度的死亡，死亡率分別為100%、80%、40%、20%，死亡率曲線呈正態分布，E組和對照組沒有小鼠死亡。其中A組小鼠在12 h內全部死亡，B、C、D、E組中未死亡的小鼠在32～38 h精神狀態和采食量逐漸恢復正常。用改良寇氏法計算LD50為1.38×107CFU/mL，MLD為1.1×106CFU/mL。對死亡小鼠進行解剖發現，心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟無明顯病變，胃和小腸內有大量黏液積蓄、腸壁變薄，對照組小鼠正常。從死亡小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腸分離培養的細菌生長形態和鏡檢結果與2.1一致，未分離到其他形態的細菌。試驗表明，分離株HCDE/17-1為強毒力致病性大腸桿菌。

表3 小鼠致病試驗結果

2.5 毒力基因檢測 分離株HCDE/17-1經PCR擴增13種毒力基因，凝膠電泳成像結果顯示，astA、aggR基因條帶大小為分別為110 bp、253 bp，與預期大小一致(圖3和圖4)。將產物序列上傳GenBank，用BLAST進行比對，結果顯示，astA基因核苷酸序列與GenBank中大腸桿菌O182∶H21(NCBI登錄號:CPO24249.1)的產熱穩定腸毒素編碼基因astA核苷酸序列同源性達99%；aggR基因核苷酸序列與GenBank中大腸桿菌MOR12(NCBI登錄號：MT471349.1)的聚集黏附轉錄調節因子aggR核苷酸序列同源性達98%。分離株HCDE/17-1未檢測出stx2e、sepA、sta、lt、eaeA及黏附素K88、K99毒力因子，試驗表明，該菌株為典型腸聚集性大腸桿菌。

圖3 astA毒力基因的PCR檢測

圖4 aggR毒力基因的PCR檢測

2.6 藥物敏感性試驗 藥敏試驗結果(表4)顯示，分離株HCDE/17-1對慶大霉素、新霉素、多西環素、頭孢唑林、頭孢噻呋、苯唑西林、青霉素、復方新諾明、恩諾沙星、諾氟沙星、克林霉素、林可霉素共12種抗菌藥均耐藥，對阿米卡星、四環素和泰樂菌素中介敏感，對氯霉素和紅霉素敏感。

表4 藥敏感性試驗結果

2.7 生物系統進化樹 將從死亡犢牛肝臟中分離出的菌株HCDE/17-1的16S rDNA序列與NCBI中的10個大腸桿菌代表株16S rDNA序列建立系統進化樹，結果顯示，分離株HCDE/17-1與大腸桿菌O112ab∶H8株(登錄號：CP062910.1)、NCTC9033株(登錄號：LR134081.1)在同一分支上，親緣關系較近(圖5)。

圖5 16S rDNA核苷酸序列系統進化樹

3 討論

EAEC是引起人和動物腹瀉的重要病原菌，其致病機制與攜帶的毒力因子包括菌毛和黏附素等有著密切的關系[1，13]。研究表明，死亡犢牛體內肝臟組織分離菌株攜帶腸聚集性大腸桿菌的主要毒力基因：astA和aggR[18]，根據劉伯承等[19]前期對發病牛場病例的實驗室檢測結果(牛病毒性腹瀉、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒檢測均呈陰性)分析，EAEC可能是引起犢牛腹瀉死亡的主要原因。小鼠致病試驗結果顯示，A組小鼠在12 h內全部死亡，LD50為1.38×107CFU/mL，這與成大榮等[20]分離的致腹瀉大腸桿菌毒力最強表型S462234株LD50為1.504×107CFU/mL及元振杰等[21]分離的牛腹瀉大腸桿菌最強毒力株LD50為1.88×107CFU/mL相比，致病力表現更強。解剖結果顯示，小鼠小腸內出現大量黏液，其他體內器官組織未有明顯病變，說明腸聚集性大腸桿菌對小腸上皮細胞定植能力非常強，可能與EAEC定植因子有關。致病性大腸桿菌常與某些特定的血清型有關，本試驗發現，分離株HCDE/17-1 16S rDNA核苷酸序列與其他10個大腸桿菌代表株同源性達99.34%，生物系統進化樹顯示，分離株HCDE/17-1與 O112ab∶H8株(登錄號：CP062910.1)在同一分支上，表明分離株HCDE/17-1與致病性大腸桿菌O112血清型親緣關系最近。

細菌耐藥性給人類和世界公共衛生帶來了巨大挑戰，抗菌藥的使用可能導致一些新的菌株出現，如2010年德國志賀素腸聚集性大腸桿菌O104∶H4暴發菌株的毒素產生是由喹諾酮類抗生素引起[22]。藥敏試驗結果顯示，分離株HCDE/17-1對常用的12種抗菌藥表現出嚴重多重耐藥，僅對氯霉素和紅霉素2種藥物敏感，提示臨床應適當調整抗菌藥的使用，避免耐藥株傳播擴散。2019年我國農業農村部194號文件規定，至2020年7月1日起將全面禁止飼料中添加(除中草藥類)藥物添加劑品種，這意味著抗菌藥使用將在一定程度上得到控制。然而，近年來由于我國養殖業的迅速發展，細菌耐藥率持續增高，在短時期內細菌耐藥現象仍然很難消除。因此，仍然需加強對病原菌的監控及耐藥機制的研究。