南寧地區豬場豬等孢球蟲病的流行病學調查與分析

顏 勇

(廣西職業技術學院農業工程學院，廣西 南寧 530226)

豬腸道寄生蟲病是養豬業中常見寄生蟲病之一，臨床中豬的腸道內寄生蟲以線蟲類和原蟲類較常見，腸道寄生蟲病主要引起不同階段豬的厭食、消瘦、腹瀉、腸炎等一系列癥狀，嚴重者貧血、脫水、生長發育不良等，甚至直接導致動物死亡[1-2]。豬球蟲病主要是由等孢球蟲和艾美爾球蟲等寄生于仔豬小腸上皮細胞內引起的一種多發寄生原蟲病，該病呈世界性分布，尤其在集約化豬場、散養豬場更為常見，引起豬球蟲病的病原有17種，我國就有13種，其中以等孢球蟲感染最為常見[3-4]。豬等孢球蟲(Isosporasuis，I.suis)主要引起仔豬的腹瀉，主要危害8～15日齡仔豬，感染日齡越小的仔豬病情越嚴重，死亡率越高，是引起哺乳仔豬患球蟲病的主要病原，給養豬業造成嚴重的經濟損失[5-7]。因此，在豬養殖過程中應該引起重視。

本試驗于2019—2020年采集南寧地區不同規模化豬場、散養戶中不同日齡的患腹瀉豬的糞便樣品1 319份，采用飽和鹽水漂浮法、顯微鏡觀察法和PCR方法進行豬等孢球蟲檢測，分析其流行情況，為該地區豬場豬等孢球蟲病綜合防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018—2020年，采集南寧地區不同規模化豬場、散養戶中不同日齡的患腹瀉豬的糞便樣品1 319份(表1)。

表1 2018—2020年豬場病料采集情況

1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；DL-2 000 Marker、ExTaqDNA聚合酶,均購自寶生物工程(大連)有限公司。顯微鏡、載玻片、飽和糖-鹽水溶液、過濾網等常規儀器及試劑由廣西職業技術學院畜牧獸醫系動物疾病實驗室提供。

1.3 樣品采集與處理 采集患腹瀉豬的新鮮糞便50～100 g，裝入無菌的樣品管中，標注樣品信息，糞便樣品分成2份，置于4 ℃冰箱保存。

1.4 顯微鏡觀察 參照參考文獻[8]的方法進行操作。對收集的卵囊進行顯微鏡觀察，顯微鏡觀察到蟲卵的糞便樣品，用飽和糖-鹽水溶液漂浮法收集球蟲卵囊，對收集的卵囊液采用飽和糖水溶液漂浮法和梯度離心法進行卵囊純化，濃集的卵囊置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.5 糞便中基因組DNA提取 顯微鏡觀察到蟲卵的糞便樣品，參照糞便 DNA 提取試劑盒說明書提取糞便中基因組 DNA，-80 ℃保存備用。

1.6 PCR鑒定與測序 參照參考文獻[9]，按GenBank中I.suis18S rRNA 基因全序列(U97523)設計特異性引物(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的糞便中基因組DNA為模板，用I.suis18S rRNA引物進行PCR鑒定，回收PCR 產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對，應用 DNASTAR軟件構建系統發育樹。

表2 引物信息

1.7 數據統計與處理 統計豬等孢球蟲感染陽性數、陽性率、總陽性率，分析其流行情況。陽性率/%=陽性樣品數/總樣品數×100%；總陽性率/%=總陽性樣品數/總樣品數×100%。

2 結果

2.1 顯微鏡觀察 采集的樣品經過4～5次純化后得到濃集的球蟲卵囊，將濃集的球蟲卵囊進行稀釋，在顯微鏡下可以觀察到卵囊呈球形或卵圓形，無色或黃褐色，壁光滑且較薄，個別出現孢子化(圖1)，與劉光輝等[10]報道的豬等孢球蟲形態基本上一致。

圖1 豬等孢球蟲卵囊顯微鏡觀察(40×)

2.2 豬等孢球蟲18S rRNA基因 PCR鑒定與測序 提取采集的1 319份糞便樣品的基因組DNA，對I.suis18S rRNA基因進行PCR檢測。結果顯示，344份擴增出大約為1 178 bp的目的條帶，與預期大小一致(圖2)。通過序列分析及 BLAST比對，陽性樣品與GenBank中I.suis18S rRNA同源性在98%～100%。選擇代表株(Isolates株)，應用DNASTAR軟件構建系統進化樹，與NCBI中登錄的豬球蟲序列同源性為100%(圖3)。

圖2 病原的PCR檢測結果

圖3 I.suis Isolates株的18S rRNA基因進化樹分析

2.3 不同年份的豬等孢球蟲檢測數據統計與分析 對采集的1 319份糞便樣品進行I.suis綜合檢測，結果如表3所示，2018—2020年規模化豬場、散養豬場I.suis陽性率為26.1%，其中規模豬場、散養豬場I.suis陽性率分別為10.0%和15.5%。規模化豬場I.suis陽性率呈現逐年下降的趨勢，散養豬場I.suis陽性率呈現逐年上升的趨勢。

表3 不同年份的I.suis檢測結果

2.4 不同階段豬感染豬等孢球蟲檢測數據統計與分析 對采集的1 319份糞便樣品進行I.suis綜合檢測，結果如表4所示，2018—2020年規模化豬場、散養豬場主要以哺乳仔豬、斷奶仔豬感染I.suis為主，分別占總樣品數的8.6%和7.4%。

表4 不同階段豬感染I.suis檢測結果

3 討論

國內多項研究表明，豬等孢球蟲感染以隱性感染為主，不易診斷，對該病的隱性感染重視不夠，在發生疫情以后才進行治療，豬場中定期對相關寄生蟲的檢測具有重要意義[10-11]。I.suis多數以隱性感染為主，不會直接造成豬的死亡，但可以導致豬的抵抗力、免疫力下降，引發其他疾病，并形成混合感染，加速豬的死亡，給養殖業造成嚴重的經濟損失[12]。因此，規模化豬場應該注重該病的防控。

豬等孢球蟲檢測可通過飽和鹽水漂浮法、顯微鏡觀察法進行檢查，但是容易漏檢且時間較長，而PCR檢測方法則可以快速檢測出是否感染豬等孢球蟲，具有一定時效性，被廣泛應用[7-8]。本試驗通過飽和鹽水漂浮法、顯微鏡觀察法和PCR方法對患腹瀉豬的1 319份糞便樣品進行豬等孢球蟲檢測。結果顯示，2018—2020年I.suis總陽性率為26.1%(344/1 319)，其中規模化豬場I.suis總陽性率為10.0%，呈現逐年下降的趨勢，散養豬場豬等孢球蟲總陽性率為15.5%，呈現逐年上升的趨勢。說明南寧地區Isosporasuis在規模化豬場、散養豬場中流行，且散養豬場陽性率高于規模化豬場，說明散養豬場對該病的防控意識有待提高。規模化豬場、散養豬場主要以哺乳仔豬、斷奶仔豬感染豬等孢球蟲為主，說明該病主要危害哺乳仔豬、斷奶仔豬，應該注意定期給哺乳仔豬、斷奶仔豬進行合理的驅蟲，同時注意環境衛生及消毒，進行綜合防控。本調查與郭建超等[4]、藍養金[5]、盛祖勛等[8]報道的豬等孢球蟲流行情況有一定的差異性，可能與地區、養殖環境和綜合防控有關。本調查為南寧地區豬場豬等孢球蟲病防控提供參考依據。