河北省某野生動物園園養(yǎng)動物人五毛滴蟲感染調(diào)查

梅汝蕃，林小雨，孫通寶，潘素敏，陳麗鳳，張華英，王秋悅

(1. 河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)重點實驗室，河北 秦皇島 063000 ； 2. 河北省沙河市第一中學(xué)，河北 沙河 054100)

人五毛滴蟲是一種人獸共患寄生蟲，主要在人、犬、貓、靈長類和嚙齒類動物的消化道內(nèi)寄生[1]。過去通常認(rèn)為人五毛滴蟲是宿主腸道內(nèi)共生生物，但是近些年國內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)從腹瀉動物體內(nèi)分離到人五毛滴蟲的報道[2]，另有報道表明其可引起人類腹瀉、肺部感染、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[3]。人五毛滴蟲可能為一種新發(fā)的傳染性疾病病原，具有人獸共患和水源傳播的潛力，其公共衛(wèi)生學(xué)意義重大。然而，雖然已經(jīng)認(rèn)識到人五毛滴蟲作為哺乳動物病原體的潛在危險，但目前關(guān)于中國野生動物的人五毛滴蟲流行病學(xué)調(diào)查研究較少。因此，本試驗主要對河北省某野生動物園園養(yǎng)野生動物進(jìn)行人五毛滴蟲的感染情況調(diào)查，以更好地確定人和動物感染的風(fēng)險和動態(tài)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2019年12月—2020年4月從河北省某野生動物園收集了88份動物糞便樣品，共包含32種動物，其中草食動物70份(表1)，肉食動物18份(表2)。

1.2 主要材料 糞便基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；DL2 000 DNA Marker、dNTP Mix和Loading Buffer，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

1.3.1 直接涂片法 在潔凈的載玻片中央置1滴生理鹽水，用牙簽挑取米粒大小的糞便，在生理鹽水中涂抹均勻，去掉多余殘渣，蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余水分吸掉，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。首先通過形態(tài)學(xué)對糞便進(jìn)行初步篩選，收集并培養(yǎng)含有疑似毛滴蟲的樣品。

1.3.2 碘液染色法 置1滴碘液在載玻片上，用牙簽挑取少許糞便涂勻在碘液中，除去多余殘渣，最后加蓋玻片，置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 糞便基因組的提取及PCR檢測 使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中登錄的人五毛滴蟲18S rRNA基因序列(KX136894)設(shè)計引物，引物序列為RWMDC18S-F：5′-TGTAAACGATGCCGACAG-AG-3′，RWMDC18S-R：5′-CAACACTGAAGCCAATG-CGAGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系(20 μL)：2×EsTaqMaster Mix(Dye)10.0 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 人五毛滴蟲18S rRNA基因序列同源性及遺傳進(jìn)化分析 將PCR陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中登錄的人五毛滴蟲18S rRNA序列進(jìn)行同源性分析；利用MEGA 7.0構(gòu)建人五毛滴蟲18S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 直接涂片法結(jié)果如圖1A、1B所示，在低倍鏡下可觀察到大量快速游動的蟲體，高倍鏡下可見蟲體呈半透明卵圓形或梨形。當(dāng)蟲體活性良好時做原地旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，或呈螺旋狀前進(jìn)，游動迅速；當(dāng)培養(yǎng)基營養(yǎng)被大量繁殖的蟲體過度消耗時，蟲體活性減弱，鏡下可觀察到蟲體游動明顯減慢或停止，形狀近似變?yōu)閳A形。碘液染色法結(jié)果如圖1C所示，能清晰地看到蟲體鞭毛結(jié)構(gòu)，有時可見波狀膜。從鏡檢結(jié)果可初步判定蟲體為毛滴蟲，且蟲體活性較強(qiáng)。

圖1 毛滴蟲顯微鏡觀察

2.2 人五毛滴蟲18S rRNA的PCR擴(kuò)增 經(jīng)PCR檢測，88份糞便樣品中人五毛滴蟲18S rRNA基因陽性樣本共5份，總陽性率為5.7%。其中，70份草食動物(共15種)樣品中檢測出毛滴蟲3份，陽性率為4.3%(表1)；18份肉食動物(共7種)樣品中檢測出毛滴蟲2份，陽性率為11.1%(表2)。

表1 草食動物人五毛滴蟲感染情況

表2 肉食動物人五毛滴蟲感染情況

2.3 毛滴蟲18S rRNA基因序列同源性及遺傳進(jìn)化分析 將PCR擴(kuò)增的5份陽性樣品基于18S rRNA基因測序后所獲得的序列，通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示，5份陽性樣品(命名為TSMDC 1～TSMDC 5)18S rRNA基因與GenBank中登錄的人五毛滴蟲基因序列MH997492、MH997493、MF991102、KX833161、KM205213、KJ404269和KX136886處于同一分支，且相似性高達(dá)99%，因此本試驗在野生動物體內(nèi)檢測到的蟲體確定為人五毛滴蟲。該進(jìn)化分支中選用的人五毛滴蟲基因分別來源于動物豬、山羊、犬類、獼猴等，說明人五毛滴蟲感染動物種類的多樣性，草食動物和肉食動物均可感染人五毛滴蟲。本試驗所測得序列TSMDC 1～TSMDC 5均發(fā)生了輕微的等位基因突變，第96位堿基發(fā)生變化(C96T)。

圖2 基于人五毛滴蟲18S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論

近些年出現(xiàn)了越來越多的關(guān)于人五毛滴蟲感染動物的報道，包括豬、羊、牛、犬、貓、非人靈長類、嚙齒類等動物，說明人五毛滴蟲宿主范圍明顯在不斷擴(kuò)大。Dimasuay等發(fā)現(xiàn)，蟒蛇、角鸮、山羊均可作為人五毛滴蟲的感染宿主[4]。2014年Li等首次報道豬為人五毛滴蟲的新宿主[5]。Li等在水牛和黃牛體內(nèi)分離到人五毛滴蟲蟲株[6]。董兵等從東北的鹿腸道內(nèi)分離到人五毛滴蟲，而且感染率高達(dá)50%(34/68)[7]。王秋悅等從腹瀉貉子體內(nèi)分離得到人五毛滴蟲[8]。而且也有從人體分離到人五毛滴蟲蟲株的報道[9]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥患者中人五毛滴蟲感染率明顯多于健康人群，而且人五毛滴蟲導(dǎo)致胃腸道發(fā)生腫瘤的風(fēng)險增加了6.75倍[10]。人五毛滴蟲已成為人獸共患寄生蟲病的潛在重要病原體，且其具有較強(qiáng)的新宿主適應(yīng)力。相信隨著研究的深入，會發(fā)現(xiàn)越來越多的人五毛滴蟲新宿主。

本試驗對河北省某野生動物園園養(yǎng)野生動物中人五毛滴蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示，該野生動物園中野生動物存在人五毛滴蟲感染，草食動物感染率為4.3%，肉食動物感染率為11.1%，肉食動物的感染率要高于草食動物。總體來說，該園野生動物人五毛滴蟲感染率不高，主要是由于該動物園管理較為規(guī)范，且定期進(jìn)行驅(qū)蟲。根據(jù)我國的文獻(xiàn)報道，人五毛滴蟲在不同地區(qū)的不同物種中的感染率都不盡相同。Li等調(diào)查了吉林省野生動物(包括梅花鹿、獺兔、藍(lán)狐、銀狐、浣熊狗和水貂等動物)的人五毛滴蟲感染情況，感染率介于16.25%～53.33%，感染率最高的為浣熊狗[11]。Li等對中國中東部地區(qū)綿羊和山羊進(jìn)行了人五毛滴蟲流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率分別為6.0%和0.3%[12]。柳佳等對河北省毛皮動物貉子體內(nèi)人五毛滴蟲的感染情況進(jìn)行了初步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)腹瀉貉子中有30%以上均有人五毛滴蟲的感染[13]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，該動物園中的梅花鹿、黇鹿、驢和長臂猿存在人五毛滴蟲感染，這些動物雖未表現(xiàn)任何明顯臨床癥狀，但這些無癥狀感染動物體內(nèi)寄生蟲病的防控尤為重要，因其可將病原廣泛傳播而被忽視。在動物園中飼養(yǎng)員、管理員、獸醫(yī)工作者、游客等人員均有機(jī)會與野生動物密切接觸，由于人五毛滴蟲的人獸共患性和宿主廣泛性，應(yīng)積極檢測動物園中野生動物的人五毛滴蟲感染情況；定期對其生活環(huán)境進(jìn)行清理和消毒，對糞便、臟物進(jìn)行及時清除；關(guān)注動物健康狀態(tài)，對出現(xiàn)腹瀉癥狀的動物進(jìn)行隔離和治療；進(jìn)行預(yù)防性驅(qū)蟲，防止寄生蟲感染和傳播。