乳酸菌菌株分離及益生效果評價

張琳，荊海曉

(1.西安職業技術學院，西安 710077；2.西安理工大學，西安 710048)

乳酸菌胞內不含有過氧化氫酶，經過其發酵之后的糖類也能被轉化為其他酸性代謝產物[1-2]。目前乳酸菌一共包含45個屬，383個種和亞種。近年來，乳酸菌的已知物種每年都會增加[3]。乳酸菌根據形態特征，可被劃分為乳酸鏈球菌和桿菌[4]；根據對氧氣的需求，又可被分為厭氧菌和兼性厭氧菌[5]。

乳酸菌是生物體內十分重要的一類細菌，在生長過程中會分泌出一些酸性(乳酸和乙酸)活性成分[6]，這些活性成分能夠抑制腸道中有害微生物群落、調節機體免疫能力，在降血糖，降血脂、抗氧化和抗疲勞方面具有明顯的功效[7]。隨著人們生活水平的提高，人們對功能性食品的渴求日益增加，不同乳酸菌物種之間功效不同，所以，近些年不同物種的乳酸菌功能效果也成為研究熱點。

乳酸菌能夠將大分子物質蛋白質、脂肪、糖類等分解成為小分子物質，經過乳酸菌的協助，這些小分子物質易被人體吸收。食品在乳酸菌發酵的過程中，也會生成維生素、鈣、磷、鉀、鐵等多種微量元素，賦予食品更加豐富的營養成分[8]。此外，乳酸菌在乳制品加工、肉制品制作、果蔬和泡菜加工方面也被廣泛應用。

我國獨特的地理位置和生態氣候[9]造就了豐富的乳酸菌資源，越來越多的分類學學者逐漸開始對我國的乳酸菌資源進行調查和分析[10]。在我國傳統的酸奶和活性菌粉中就含有豐富的乳酸菌菌種資源[11]，本研究旨在從這些產品中分離出具有較高活性功效的乳酸菌，從而增加我國乳酸菌菌種資源[12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云南大理發酵的乳酸產品、乳酸菌菌粉：市售。

1.2 試驗試劑

葡萄糖、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、硫酸錳、牛肉膏、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、明膠、蛋白胨和瓊脂粉。

1.3 試驗儀器

高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、體視鏡、顯微鏡、高速離心機。

1.4 培養基的制備

MRS培養基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母粉3 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氫鉀2 g，瓊脂8 g，蒸餾水1000 mL。

淀粉培養基：蛋白胨10 g，淀粉2 g，牛肉膏5 g，瓊脂8 g，蒸餾水1000 mL。

1.5 乳酸菌自由基清除率的測定

取濃度為109CFU/mL和1010CFU/mL的5種乳酸菌各1 mL，在每個樣本中添加2 mL DPPH溶液[13]，并使用離心機在6000 r/min的條件下離心5 min，測定在波長為517 nm條件下的吸光值，使用無菌水代替乳酸菌作為空白對照組[14]，用乙醇溶液代替DPPH作為對照組，每組樣品選取3個平行。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(X1-X2)/X3]×100。

式中：X1為空白組的吸光值；X2為樣品的吸光值；X3為對照組的吸光值。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 乳酸菌形態學鑒定

從樣品中一共分離出23株乳酸桿菌。從傳統的酸奶中一共分離出10個菌株，菌株編號為CCSN-1～CCSN-10；從市場上購買的活性菌粉中分離獲得10個菌株，菌株編號為SSJF-1～SSJF-10；從市場上購買的酸奶中分離獲得3個菌株,菌株編號為SSSN-1～SSSN-3。經過革蘭氏染色，發現有11株顯示革蘭氏陽性，12株顯示革蘭氏陰性。菌落的形狀主要為白色、乳白色或者微白色。23株菌珠的形態特征結果見表1。

表1 菌株形態特征

2.1.2 分子生物鑒定

獲得菌株之后，在實驗室獲得DNA，并進行PCR擴增，將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果回來之后，將序列在NCBI數據庫中進行比對[15-16]，當菌株之間的相似度高于95%時，說明這些菌株屬于一個屬；當基因的相似率大于99%時，說明屬于一個物種。

由表2可知，一共分離出5個物種，分別是Lactobacillusplantarum，L.paracasei，L.rhamnosus，L.rhamnosus和L.casei[17]。

表2 菌株16S rDNA序列比對結果

2.2 乳酸菌功效評價

2.2.1 菌株產酸能力及酸度評價

5個種的乳酸菌生長及酸度檢測見表3。

表3 菌株生長和產酸能力比較

由表3可知，不同物種的乳酸菌在生長速度和增殖水平上具有很大差異，CCSN-2和CCSN-3在培養24 h之后，OD600 nm較其他菌株高，接近4.0；其他的3個菌株CCSN-1、CCSN-10和SSJF-8生長速率都較慢，培養24 h之后，生長速率(OD600 nm)仍然低于3.0。按照一般情況來看，生物量增高對應的pH值也會增高，本研究中的CCSN-1雖然生長速率最慢，但是產酸量卻不是最低的。

乳酸菌能夠產生多種有機酸，從而改善食物中的味道顏色和品質，通過檢測食品中的酸度來指導乳酸菌的發酵程度。先前的研究數據表明，發酵24 h后，乳酸菌產生的酸度為80～90 °T時，人們感覺到的酸度值較為適宜，可以得出，除了SSJF-8菌株，其他菌株均有較為適宜的酸度和口感。

2.2.2 菌株對膽鹽的耐受性

膽汁中含有75%的甘氨膽酸鈉和25%的牛磺酸鈉。高濃度的膽鹽會造成微生物中的細胞膜和DNA中的細胞結構損傷或者死亡[18-19]。腸道中含有較高的膽鹽濃度，本研究通過對菌株中膽鹽耐受性進行評價，人們剛剛進食之后，消化道內的膽鹽濃度大致為15 g/L，4 h后的膽鹽濃度大致降為3 g/L。設置膽鹽濃度為0.5%、1%和1.5%，研究5個菌株在不同的膽鹽濃度下的存活率。

由表4可知，CCSN-3在高濃度的膽鹽中具有較高的存活率，菌株還出現了生長的情況，這表明CCSN-3菌株具有較高的膽鹽耐受性，且在高鹽濃度下能夠進行生長發育[20]。先前的研究結果表明CCSN-3菌株的膽鹽耐受性高于鼠李糖乳酸桿菌的耐受性，具有較高的使用和研究價值。

表4 菌株在高膽鹽條件下的存活情況

2.2.3 菌株低溫耐受性評價

在低溫的環境條件下，乳酸桿菌的代謝反應速度較慢，代謝功能容易喪失甚至出現死亡的情況。在4 ℃的條件下，乳酸菌內的酶活性會降低，影響酶活性，進而改變代謝產物。當溫度低于-20 ℃時，低溫會造成乳酸菌孢內形成冰體，從而影響細胞膜流動性。乳酸菌需要長期保存在-20 ℃，所以，選取-20 ℃作為低溫脅迫處理，并檢測冷卻過程中乳酸菌活性的變化。

由圖1可知，隨著存放時間的增長，乳酸菌的活菌數逐漸減少。在-20 ℃的條件下存放10 d，CCSN-3的乳酸菌活菌數保持了較高的活性，CCSN-2和CCSN-10的菌株失活較為明顯。根據試驗結果可以看出，在-20 ℃條件下，不同的菌株存活率存在顯著的區別，存活率較高的菌株對低溫存在明顯的脅迫抗性。

圖1 不同的乳酸桿菌在-20 ℃條件下存活率的變化

2.2.4 菌株抗氧化能力評價

乳酸菌的代謝產物具有較強的抗氧化活性，作為一種新型的抗氧化劑，乳酸菌本身具有安全、無副作用的優點。乳酸菌不僅能清除游離基，次生代謝物也具有一定的抗氧化作用。本試驗中采用乳酸菌對DPPH自由基清除率作為指標來檢測不同的菌株對DPPH自由基的清除能力。

由圖2可知，不同的菌株抗氧化能力不同，且同一個菌株中，菌液的濃度越大，則抗氧化能力越強。在測試的5個菌株中，CCSN-1無論是在菌液濃度109CFU/mL還是1010CFU/mL條件下，DPPH自由基清除率都是5個菌株中最高的(65%)。CCSN-2和SSJF-8受菌液濃度影響最大，菌液濃度從109CFU/mL增大至1010CFU/mL時，DPPH自由基清除率也明顯增大。

圖2 不同濃度、不同菌株的乳酸菌的DPPH自由基清除率比較

3 小結

隨著生活水平的提高，人們對健康食品的要求也逐漸增高，為了滿足目前市場的要求，乳酸菌的開發和應用在我們的生活中也開啟了新的篇章。乳酸菌普遍存在于我們生活中，是一類對人體有益的微生物，食品中添加乳酸菌，不僅能夠延長食品的保質時間，也能讓食物擁有更高的營養價值。

當代的生活和乳酸菌存在著密不可分的聯系，乳酸菌是生物體內重要的細菌群落，在人體的健康方面發揮著重要的生理功能，在增強機體免疫能力、抗氧化、抑制病原真菌生長、減少心血管疾病、降低血脂等方面發揮著重要的作用。近些年，隨著人們生活水平的提高，乳酸菌的功能性差異顯得更加重要，不同菌株之間的差異和怎樣有效地利用乳酸菌的益生功能逐漸成為研究重點。