蘋(píng)果醋活性成分總黃酮和總多酚生物活性機(jī)制研究

閆慧君，韓玉彬

(1.河南財(cái)政金融學(xué)院，鄭州 450046；2.河南理工大學(xué)，河南 焦作 454000)

在我國(guó)傳統(tǒng)的食醋中，醋類(lèi)產(chǎn)品的加工主要以糧食為主，其乳酸的含量高[1-2]，產(chǎn)出和投入的比例相對(duì)較小，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)每年消耗大量糧食用于生產(chǎn)食醋[3]。如果每年將剩余的大量蘋(píng)果均用于生產(chǎn)蘋(píng)果醋，那么蘋(píng)果醋不僅可以被當(dāng)作食用調(diào)味醋的一種替代品，而且能夠減少糧食的浪費(fèi)。

酚類(lèi)化合物是指芳香烴化合物的苯環(huán)上，一個(gè)氫原子被羥基所替代的化合物，根據(jù)所替換羥基的數(shù)量，酚類(lèi)化合物又可以分為一元酚和多元酚兩類(lèi)，由于酚類(lèi)物質(zhì)的生物學(xué)功效，越來(lái)越多的酚類(lèi)物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)和利用，而蘋(píng)果醋中粗提取的酚類(lèi)化合物也被統(tǒng)稱(chēng)為總多酚[4]。

黃酮類(lèi)化合物是指2個(gè)苯環(huán)通過(guò)3個(gè)碳原子連接之后形成的一系列化合物，這類(lèi)化合物的顏色一般都呈現(xiàn)黃色或者淡黃色，從蘋(píng)果醋中粗提取的總黃酮主要包括黃酮、異黃酮、花色素、二氫黃酮和黃酮醇等多種酮類(lèi)化合物[5]。

發(fā)達(dá)國(guó)家的蘋(píng)果醋工業(yè)發(fā)展相對(duì)較為迅速，在歐美地區(qū)，平均每人每年消耗2 L的醋類(lèi)產(chǎn)品[6]。而我國(guó)的蘋(píng)果醋產(chǎn)業(yè)起步相對(duì)較晚，主要集中于研究蘋(píng)果醋制作過(guò)程中的菌種篩選、成分測(cè)定和工藝優(yōu)化。在蘋(píng)果醋產(chǎn)品的研究和開(kāi)發(fā)方面尚存在很多不足[7-8]。

為了研究蘋(píng)果醋作為功能飲品所發(fā)揮的作用，通過(guò)粗提取蘋(píng)果醋中總多酚和總黃酮，研究蘋(píng)果醋中總多酚和總黃酮的抗疲勞功效，旨在為蘋(píng)果醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑盒材料

蘋(píng)果醋、大孔吸附樹(shù)脂LS-46、XDA-8和HPD-600、無(wú)水乙醇、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、福林酚、碳酸鈉、鹽酸、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、三氧化鐵、三氧化鋁、冰醋酸、鈉石灰、肌糖原和肝糖原試劑盒歧化酶。

1.2 試驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)、電子稱(chēng)、精密pH計(jì)、粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機(jī)、烘箱、真空泵、電子天平、萬(wàn)能爐。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋(píng)果醋加工工藝流程

蘋(píng)果→洗凈→粉碎→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→加熱→過(guò)濾→離心→調(diào)味→精細(xì)過(guò)濾→灌裝→殺菌。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液體的制作

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品放于烘箱中干燥，一直到重量不減少為止，之后準(zhǔn)確稱(chēng)取109.1 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，放于100 mL的容量瓶中，加入濃度為30%的乙醇溶液，使蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，放置5 min，待溶液的溫度降至室溫，再加入30%的乙醇溶液，將其搖勻，制成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用[9-10]。

為了獲得最佳吸收波長(zhǎng)的吸光度，準(zhǔn)備350～700 nm的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，將最大吸收峰的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。將蘋(píng)果醋樣品取10 mL放于燒杯中，添加少量濃度為30%的無(wú)水乙醇，將其移動(dòng)至50 mL的容量瓶中，按照上述方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)方程中的總黃酮進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.3.3 總多酚含量測(cè)定

將沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品放于烘箱中烘干至恒定重量，然后稱(chēng)取沒(méi)食子酸0.11 g，將其放置于100 mL的容量瓶中，再添加水至容量瓶中，將沒(méi)食子酸溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑩u勻后待用[12-13]。

使用移液槍?zhuān)瑢?，2，3，4，5 mL的沒(méi)食子酸加入5個(gè)100 mL的容量瓶中，再添加去離子水，將水添加至刻度處，獲得不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，待用[14]。

為了在最佳的波長(zhǎng)條件下進(jìn)行吸光度的測(cè)定，準(zhǔn)備100 mL沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在測(cè)定波長(zhǎng)為500～900 nm條件下，尋找最大的吸收峰，將最大吸收峰的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)[15]。

取10 mL的蘋(píng)果醋溶液，將其移至燒杯中，加入10%的福林酚試劑5 mL，混勻，放置5～8 min，使其發(fā)生生化反應(yīng)，之后加入7%的碳酸鈉2 mL，將其稀釋至容量瓶的刻度，在波長(zhǎng)為500～900 nm的條件下測(cè)定其吸光值[16-17]。

1.3.4 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

將3種大孔吸附樹(shù)脂LS-46、XDA-8和HPD-600分別進(jìn)行裝柱。先用4%的氫氧化鈉溶液對(duì)樹(shù)脂柱進(jìn)行清洗，一般清洗液大致為樹(shù)脂柱的3倍，清洗時(shí)，大孔吸附樹(shù)脂柱的流速為1 BV/h。當(dāng)大孔吸附樹(shù)脂中的氫氧化鈉溶液全部通過(guò)樹(shù)脂柱時(shí)，一直到大孔吸附樹(shù)脂柱中的體積下降至20 mm高度，將其放置在環(huán)境中2 h，采用去離子水將氫氧化鈉沖洗干凈[18]。之后按照上述方法，用體積為3倍的鹽酸、濃度為4%的溶液對(duì)大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行沖洗，鹽酸的溶液面保持在大孔吸附樹(shù)脂上界面20 mm的高度，放置2 h，用純水將其沖洗干凈。最后使用3倍體積的95%無(wú)水乙醇按照上述方法對(duì)其進(jìn)行沖洗，乙醇保留20 mm，為了防止大孔吸附樹(shù)脂柱干涸，大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理完成。

1.3.5 大孔吸附樹(shù)脂的吸附率

將處理完成后的LS-46、XDA-8和HPD-600 3種吸附柱，準(zhǔn)確量取20 mL的蘋(píng)果醋溶液，將其裝入150 mL的錐形瓶中。將EUE配制成200 mg/mL的水溶液，將其作為吸附液使用。加入100 mL待測(cè)物質(zhì)于錐形瓶中，將其放置在25 ℃的水溫中，用搖床振蕩12 h，之后將其取出，然后測(cè)定吸附液中的總黃酮和總多酚[19]，根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

吸附率(%)=(x1-x2)/x1。

式中：x1表示樣品吸附前總多酚和總黃酮總質(zhì)量；x2表示樣品吸附后總多酚和總黃酮總質(zhì)量。

1.3.6 大孔吸附樹(shù)脂的解吸率

將3種經(jīng)過(guò)處理的LS-46、XDA-8和HPD-600吸附樹(shù)脂裝入層析柱中。將EUE配制成濃度為200 mg/mL的水溶液上柱液，計(jì)算上柱液中總黃酮和總多酚的含量。上柱液的體積控制在100 mL，以1 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，收集各個(gè)濃度的洗脫液，之后靜置。使用樹(shù)脂靜態(tài)吸附，調(diào)節(jié)吸附時(shí)間為10 h，然后測(cè)定吸附前樹(shù)脂中的粗提取物總黃酮和總多酚含量，再使用純凈水將其沖洗至無(wú)色。用濃度為20%、40%、60%和80%的無(wú)水乙醇對(duì)脫樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，收集各個(gè)濃度條件下的洗脫液，并測(cè)定洗脫液中總多酚和總黃酮的量。根據(jù)下式計(jì)算總黃酮和總多酚的解吸率。

解吸率(%)=M2/(M1-M)。

式中：M2為吸附前總黃酮和總多酚類(lèi)物質(zhì)的總量；M1為吸附后總黃酮和總多酚類(lèi)物質(zhì)的總量；M為洗脫液中總黃酮和總多酚的物質(zhì)總量。

1.3.7 試驗(yàn)動(dòng)物小鼠的飼養(yǎng)

小鼠在飼養(yǎng)之前，均要對(duì)其進(jìn)行稱(chēng)重，體重差異不明顯的小鼠均被隨機(jī)分配，分為3個(gè)小組，每個(gè)小組10只小鼠。

1.3.8 血乳酸(LA)測(cè)定試驗(yàn)

胃灌小鼠1 h之后，每個(gè)小組隨機(jī)抽取5只小鼠，在小鼠的尾尖1 cm處，用棉繩系體重4%的橡皮泥。將小鼠放于水深30 cm，溫度為室溫(25 ℃左右)，讓其游泳30 min，之后立即在小鼠的眼球部位取血，利用LA試劑盒對(duì)小鼠中的乳酸進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用T-檢驗(yàn)法，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的吸附率

樹(shù)脂對(duì)某種成分的吸附率越高，則表示這種選擇性吸附的效果越高，吸收該種成分越有利，但是對(duì)于樹(shù)脂而言，并不是吸附效率越高越好，需要結(jié)合這種成分的洗脫效果進(jìn)行解吸率的分析，只有當(dāng)吸附率和解吸率均存在一個(gè)合適的范圍，才更有利于分離該成分。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂的解吸率

樹(shù)脂吸附成分之后，需要經(jīng)過(guò)洗脫的工序，對(duì)該成分的解吸率越好，則表示這種樹(shù)脂的解吸效果越好，更加有利于分離和解吸。只有當(dāng)吸附率達(dá)到一定的程度，才能更好地被樹(shù)脂吸收，此時(shí)的解吸才有一定的意義，需要同時(shí)研究樹(shù)脂的吸附率和解吸率，才能獲得最適合蘋(píng)果醋粗分離總黃酮和總多酚的條件。3種脂類(lèi)和不同乙醇濃度對(duì)蘋(píng)果醋中總黃酮和總多酚的吸附率的影響見(jiàn)表1和表2。

表1 吸附樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果醋中粗提取物總黃酮和總多酚吸附效果的影響

表2 不同乙醇濃度和不同樹(shù)脂類(lèi)型對(duì)蘋(píng)果醋中粗提取物總多酚和總黃酮解吸效果的影響

由表1和表2可知，不同的樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果醋中總黃酮和總多酚的吸附率和解吸率均存在一定的影響，綜合總黃酮和總多酚得率，選擇XDA-8樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果醋中的總多酚和多糖進(jìn)行分離。由表2可知，當(dāng)使用濃度較低的乙醇濃度進(jìn)行提純時(shí)，獲得的粗提取物主要以多酚類(lèi)為主；當(dāng)使用濃度較高的乙醇進(jìn)行提純時(shí)，獲得的粗提取物主要以黃酮類(lèi)為主。

2.3 不同酒精濃度對(duì)蘋(píng)果醋粗提取物總多酚和總黃酮的影響

由圖1可知，不同的酒精濃度對(duì)蘋(píng)果醋中粗提取物總黃酮和總多酚的影響不同。無(wú)論是黃酮類(lèi)還是多酚類(lèi)化合物，在提取的過(guò)程中，均隨著酒精濃度的升高而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酒精濃度達(dá)到20%時(shí)，蘋(píng)果醋中的黃酮類(lèi)化合物提取率最高。當(dāng)酒精濃度為0%～20%時(shí)，黃酮類(lèi)的提取率隨著酒精濃度的升高而升高，當(dāng)酒精的濃度大于20%時(shí)，蘋(píng)果醋中黃酮類(lèi)化合物隨著酒精濃度的升高而逐漸降低。對(duì)于總多酚而言，當(dāng)酒精濃度為60%時(shí)，蘋(píng)果醋中的總多酚提取量最高，為43%。當(dāng)酒精濃度小于60%時(shí)，總多酚的含量隨著酒精濃度的升高而逐漸增高。當(dāng)酒精濃度大于60%時(shí)，總多酚的含量隨著酒精濃度的升高而逐漸降低。而當(dāng)酒精濃度為20%時(shí)，總混合液中總多酚和總多糖的粗提取量相同。所以，對(duì)蘋(píng)果醋中多酚類(lèi)化合物采用60%的酒精濃度進(jìn)行洗脫，黃酮類(lèi)化合物采用20%的酒精進(jìn)行洗脫。

圖1 不同酒精濃度對(duì)蘋(píng)果醋粗提取物總多酚和總黃酮含量的影響

2.4 蘋(píng)果醋粗提取物的抗疲勞功效

2.4.1 蘋(píng)果醋粗提取物總多酚和總黃酮對(duì)小鼠體重的影響

飼喂小鼠前后對(duì)小鼠體重的影響見(jiàn)圖2。

圖2 蘋(píng)果醋粗提取物總黃酮和總多酚對(duì)小鼠體重的影響

由圖2可知，灌胃小鼠蘋(píng)果醋總黃酮、總多酚化合物和去離子水前后，小鼠體重增長(zhǎng)的程度一致。說(shuō)明無(wú)論是蘋(píng)果醋中的總多酚還是總黃酮對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)并沒(méi)有明顯影響，蘋(píng)果醋中的粗提取物總多酚和總黃酮并未以增加小鼠體重的方式來(lái)增強(qiáng)小鼠的抗疲勞作用。

2.4.2 蘋(píng)果醋粗提取物總多酚和總黃酮對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響

蘋(píng)果醋中粗提取物總多酚和總黃酮對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響見(jiàn)圖3。

圖3 蘋(píng)果醋粗提取物總多酚和總黃酮對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響

由圖3可知，無(wú)論是飼喂小鼠總多酚還是總多糖，小鼠的游泳時(shí)間均有增長(zhǎng)。當(dāng)飼喂小鼠蒸餾水作為空白對(duì)照時(shí)，小鼠的游泳時(shí)長(zhǎng)為40 min；當(dāng)飼喂小鼠總多酚時(shí)，小鼠的游泳時(shí)長(zhǎng)為70 min；當(dāng)飼喂小鼠總黃酮時(shí)，小鼠的游泳時(shí)間為55 min。說(shuō)明無(wú)論是飼喂小鼠蘋(píng)果醋中的總多酚還是總黃酮，對(duì)小鼠的游泳時(shí)間均有一定程度的提高。試驗(yàn)結(jié)果明顯表明飼喂小鼠蘋(píng)果醋中粗提取物總多酚和總黃酮都具有一定的抗疲勞功效，且飼喂總多酚的小鼠抗抗疲勞效果強(qiáng)于飼喂總黃酮的小鼠。

2.4.3 蘋(píng)果醋粗提取物總黃酮和總多酚對(duì)小鼠血LA的影響

蘋(píng)果醋中粗提取物總多酚和總多糖對(duì)小鼠血中LA含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 蘋(píng)果醋粗提取物對(duì)小鼠血中LA含量的影響

由圖4可知，飼喂小鼠總多酚和總多糖均能明顯降低小鼠體內(nèi)的血LA含量，差異性顯著性小于0.05，但是總黃酮的抗疲勞能力小于總多酚的抗疲勞能力。蘋(píng)果醋中的粗提取物總多酚和總多糖能夠降低小鼠體內(nèi)血清中的乳酸含量。小鼠在劇烈的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，蘋(píng)果醋中的多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物在無(wú)氧的條件下能夠進(jìn)行糖酵解代謝，從而產(chǎn)生大量的乳酸，這些乳酸在機(jī)體內(nèi)如果不能被及時(shí)清理干凈，則會(huì)堆積在機(jī)體內(nèi)，造成機(jī)體內(nèi)pH降低，從而引起機(jī)體各個(gè)方面的不協(xié)調(diào)和不平衡，引發(fā)機(jī)體的疲勞。蘋(píng)果醋中的粗提取物總多酚和總黃酮能夠減少機(jī)體內(nèi)乳酸的產(chǎn)生，加速機(jī)體的代謝，最終降低機(jī)體乳酸，減緩機(jī)體疲勞。

3 小結(jié)

近些年，我國(guó)對(duì)蘋(píng)果醋的研究越來(lái)越深入。同時(shí)，蘋(píng)果醋也是新一代的調(diào)味品，它富含鉀、鋅等多種微量元素、維生素、有機(jī)酸和人體必需的氨基酸。這些物質(zhì)具有降低人體膽固醇、血脂，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，促進(jìn)血液循環(huán)，抑制血糖能力和增強(qiáng)消化能力等多種生物活性功能。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果醋中的粗提取物總多酚和總黃酮的最佳提取工藝為：吸附樹(shù)脂為XDA-8，多酚類(lèi)化合物采用60%的酒精濃度進(jìn)行洗脫，黃酮類(lèi)化合物采用20%的酒精濃度進(jìn)行洗脫，為以后蘋(píng)果醋的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。