熒光分光光度法測定蜜餞食品中二氧化硫殘留量研究

李長濱，王釗，劉文靜，吳圣江

(1.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046；2.河南華測檢測技術有限公司，鄭州 453100)

亞硫酸鹽是食品工業中廣泛使用的一種食品添加劑，可作為食品漂白劑、防腐劑和抗菌劑，也可抑制非酶褐變和酶促褐變，常用于食品的護色、防腐、漂白、抗氧化以及延長食品貨架期等方面[1]。亞硫酸鹽可以與食品中的水生成亞硫酸、硫酸、二氧化硫等物質，其中二氧化硫可以參與人體血液循環，破壞細胞酶活力，引起體內碳水化合物和蛋白質的代謝異常，人體在二氧化硫中毒后，機體的免疫功能嚴重受損。二氧化硫還會刺激呼吸道平滑肌發生收縮，從而引起一系列呼吸道疾病[2-3]。

蜜餞是以果蔬為原料，經糖、蜂蜜或食鹽腌制而成的傳統食品，其制作過程大都添加亞硫酸鹽類物質以防止蜜餞發生褐變，保持產品色澤鮮艷，延長其貨架期[4]。蜜餞類休閑食品，諸如芒果干、草莓干、楊梅干、藍莓干、半梅等其配料表中均明確標注了焦亞硫酸鈉，因此蜜餞類食品中二氧化硫殘留量的檢測是保障其安全的重要手段。國標GB 5009.34—2016《食品安全國家標準 食品中二氧化硫的測定》中規定了二氧化硫的測定方法為滴定法[5]，該方法存在滴定終點不靈敏、重現性與準確性較差的劣勢，而且樣品處理需要蒸餾，操作過程較為繁瑣，不適合批量樣品的檢測。另有研究報道，高效液相色譜法、氣相色譜法、蒸餾碘量法等用于二氧化硫殘留的量測定[6]，色譜法具有重現性好、靈敏度高等優點，但是存在儀器昂貴、檢測費用較高等缺點。顧娉婷[7]使用全自動蛋白測定儀對國標法進行改進，簡化了蒸餾過程，但是試驗結果表明使用改進后的方法與國標法并沒有顯著差別。此外，還有利用比色法、表面增強拉曼光譜法、電化學法、熒光探針法以及試劑盒等快檢法對二氧化硫進行測定和分析[8-14]。比色法準確度低、容易受周圍環境影響且試驗過程需使用有毒試劑，拉曼光譜法和電化學法具有重復性差的缺點，熒光探針法使用范圍受限，試劑盒等快檢方法具有準確度低的劣勢[15]。尋求一種簡單、快捷且同時適合大批量樣品測定的方法意義重大。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強、操作簡便、測定樣品使用量少等優點，因而被廣泛應用于微量元素、重金屬元素、特異性熒光化合物等的定性及定量分析[16-17]，通過熒光分光光度法試驗條件的優化，建立一種蜜餞食品中二氧化硫殘留量的檢測方法，為蜜餞類產品的質量控制以及產品檢測提供了更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍莓干：鄭州市丹尼斯超市；亞硫酸鈉(分析純)：天津市德恩化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛(分析純)：上海易恩化學技術有限公司；乙酸銨(分析純)：廣東光華化學廠有限公司；十二水合磷酸氫二鈉(分析純)：西隴化工股份有限公司；磷酸二氫鉀(分析純)：天津市恒興化學試劑制造有限公司；無水乙醇(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 試驗儀器

F380熒光分光光度計 天津港東科技股份有限公司；FA1004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋 上海高致精密儀器有限公司；ZL22-500A超聲波振蕩儀 上海左樂儀器有限公司；JJ-2BS破壁機 美的科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

分別將蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍莓干用破壁機粉碎成小塊，再準確稱量5.0000 g，加入0.5%的氫氧化鈉溶液100 mL，超聲提取 30 min后以8000 r/min 離心5 min，取上清液1.0 mL 用水稀釋至10 mL，待用。

1.3.2 最佳激發波長和發射波長的確定

吸取已配制好的相當于10 μg/mL二氧化硫的亞硫酸鈉標液1.0 mL置于50 mL容量瓶中，依次加入pH為6.6的緩沖溶液、1.0 mmol/L鄰苯二甲醛溶液、5.0 mmol/L乙酸銨溶液各2.0 mL，定容混勻，置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱反應10 min后取出，放入冷水中終止反應，靜置30 min后取出，使用熒光分光光度計掃描吸收光譜和發射光譜，由此得出最佳激發波長和發射波長。

1.3.3 亞硫酸鈉標準溶液的配制

將濃度為100 μg/mL的亞硫酸鈉標品稀釋成濃度為1 μg/mL的亞硫酸鈉儲備液，使用時移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL亞硫酸鈉儲備液分別置于50 mL容量瓶中，依次加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液、1.0 mmol/L鄰苯二甲醛溶液和5.0 mmol/L乙酸銨溶液各2.0 mL，定容混勻，再將其置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min后立即取出，放入冷水中終止反應，靜置30 min后在激發波長為324 nm、發射波長為390 nm的條件下，以熒光強度為縱坐標、二氧化硫的濃度為橫坐標，繪制亞硫酸鈉標準曲線。

1.3.4 試驗條件對結果的影響

1.3.4.1 單因素試驗

分別探究緩沖液pH值(6.2，6.4，6.6，6.8，7.0)、緩沖液添加量(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL)、鄰苯二甲醛溶液用量(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL)、乙酸銨用量(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL)對熒光強度的影響。

1.3.4.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，探究緩沖液pH、鄰苯二甲醛溶液用量、乙酸銨溶液用量之間交互作用對反應產生熒光強度的影響，根據單因素試驗所得最優結果設計三因素四水平正交試驗，尋找優化方案并進行極差、方差分析。

1.3.5 二氧化硫殘留量計算

式中：X為二氧化硫含量，mg/kg；C為標曲計算得出的二氧化硫濃度，μg/mL；V提取為樣品提取時使用超純水體積，mL；V定容為反應定容體積，mL；V吸取為吸取樣品提取液體積，mL；M稱量為樣品稱量質量，g。

2 結果與分析

2.1 激發波長和發射波長的確定

設定儀器發射波長為386 nm，掃描激發波長，發現在324 nm處出現最大激發光譜峰，設定激發波長為324 nm，掃描發射波長，在390 nm處出現最大發射光譜峰，見圖1。

圖1 激發發射掃描光譜圖

根據掃描結果，設定熒光分光光度計參數：激發波長為324 nm，發射波長為390 nm，激發波長狹縫為5.0 nm，發射波長狹縫為5.0 nm，PMT電壓為400 V，增益指數為2，曝光時間為0.1 s，延遲0 s。

2.2 熒光化合物生成條件優化

2.2.1 緩沖液pH值及用量的影響

緩沖液pH值的大小及添加量對體系熒光強度的影響見圖2。

圖2 緩沖液pH值及添加量對熒光強度的影響

由圖2可知，pH范圍在6.0～6.2之間時，熒光強度增加幅度并不明顯，pH在6.2～6.4之間時，熒光強度呈指數性增加，緩沖溶液的pH為6.4時，體系熒光強度達到最大值322，pH在6.4～6.6之間時，熒光強度緩慢減小，pH再增加時，該數值加劇減小。方差分析結果顯示，緩沖液pH值為6.6與pH值為6.4和6.8對應的熒光強度大小有顯著性差異(P<0.05)，緩沖溶液的pH為6.4較適宜。

在緩沖溶液添加量范圍在1.0～3.5 mL之間時，隨著緩沖溶液添加量的增加，熒光強度先增大后減小，當緩沖溶液的添加量為2.0 mL時，熒光強度達到最大值，隨后和pH值呈負相關。原因可能是在特定pH值條件下分子有穩定的結構和立體構像，pH值變大和變小均會導致熒光強度降低[18]。方差分析結果顯示，緩沖溶液添加量為2.0 mL與添加量為1.5，2.5 mL對熒光強度有顯著差異(P<0.05)，因此選擇緩沖溶液添加量為2.0 mL。

2.2.2 鄰苯二甲醛用量的影響

鄰苯二甲醛用量對體系熒光強度的影響見圖3。

圖3 鄰苯二甲醛添加量對熒光強度的影響

由圖3可知，隨著鄰苯二甲醛添加量的增加，體系熒光強度先增加后降低，鄰苯二甲醛添加量在0.5～2.0 mL之間時，其熒光強度基本呈線性增加，為鄰苯二甲醛添加量為2.0 mL時，熒光強度達最大值420.54。而鄰苯二甲醛添加量超過2.0 mL之后，熒光強度的數值迅速減小，原因可能是鄰苯二甲醛添加量過大，熒光物質分子易與溶劑分子相互作用發生熒光猝滅效應，或熒光物質在樣品池中分布不均勻發生內濾效應，從而導致熒光強度變低[19]。方差分析結果顯示，鄰苯二甲醛添加量為2.0 mL和添加量為1.5，2.5 mL有顯著性差異(P<0.05)，因此，鄰苯二甲醛加入量為2.0 mL較適宜。

2.2.3 乙酸銨用量的影響

乙酸銨用量對體系熒光強度的影響見圖4。

圖4 乙酸銨添加量對熒光強度的影響

由圖4可知，體系熒光強度隨著乙酸銨用量的增加呈現先增大后減小的趨勢，當乙酸銨加入量為1.5 mL時，熒光強度達最大值268.494。乙酸銨用量在0.5～1.5 mL時，體系的熒光強度逐漸增大，乙酸銨用量超過1.5 mL之后，熒光強度的數值呈減小趨勢。原因可能是乙酸銨屬于強電解質，易水解，添加量過大吸電子基團COO-會削弱電子共軛性，熒光強度減弱[20]。方差分析結果顯示，乙酸銨用量為1.5 mL和用量為1.0，2.0 mL有顯著性差異(P<0.05)，因此，乙酸銨加入量為1.5 mL較適宜。

2.2.4 正交優化試驗條件

2.2.4.1 正交試驗及結果

根據單因素試驗結果，為探究磷酸鹽緩沖溶液pH值、鄰苯二甲醛加入量、乙酸銨加入量之間的交互作用對生成熒光強度的影響，設計正交試驗，對反應條件進行優化。根據單因素試驗結果設計正交條件(見表1)，試驗結果見表2。

表1 三因素四水平正交試驗設計表

表2 正交試驗設計結果

由表2可知，在熒光化合物生成過程中，緩沖溶液pH(A)對熒光強度的影響最大，其次是乙酸銨加入量(C)，影響較小的是鄰苯二甲醛加入量(B)；從均值結果可以看出，最佳條件組合是A3B3C3，即緩沖液pH值為6.6，鄰苯二甲醛加入量為2.0 mL，乙酸銨加入量為2.0 mL時，熒光強度的效果最佳。

2.2.4.2 正交試驗方差分析

對反應條件三因素四水平正交試驗的結果使用SPSS進行方差分析，數據分析結果見表3，利用多因素方差分析研究緩沖液pH、鄰苯二甲醛用量、乙酸銨用量對熒光強度的差異影響，由顯著性分析可知緩沖液pH值會對熒光強度產生顯著性差異影響(P<0.05)，而鄰苯二甲醛用量(P=0.859)、乙酸銨用量(P=0.361)并不會對熒光強度產生差異影響。

表3 方差分析結果

2.3 亞硫酸鈉標準曲線繪制

對1.3.3中配制的溶液在激發波長324 nm、發射波長390 nm的條件下測定每個溶液的熒光強度，以亞硫酸鹽的濃度為橫坐標、熒光強度為縱坐標繪制標準曲線，見圖5。

圖5 亞硫酸鈉標準曲線

由圖5可知，亞硫酸鈉標準曲線回歸方程為y=290.92x+89.163，線性相關系數R2=0.9993，其擬合程度高，可以用于二氧化硫含量的計算。

2.4 樣品二氧化硫含量檢測

按1.3.1步驟處理樣品，然后按照1.3.3添加相應的衍生化試劑后測定蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍莓干中二氧化硫殘留量。每個樣品平行測定5次，結果見表4。

表4 5種樣品中二氧化硫殘留量測定結果

由表4可知，在優化后的條件下測定蜜棗二氧化硫平均殘留量為35.731 mg/kg，藍莓干二氧化硫平均殘留量為13.087 mg/kg，話梅二氧化硫平均殘留量為300.542 mg/kg，葡萄干二氧化硫平均殘留量為127.092 mg/kg，芒果干二氧化硫平均殘留量為189.961 mg/kg，5種蜜餞樣品的相對標準偏差RSD介于0.83%～4.59%之間，結果表明該方法的精密度較好。根據3倍標準偏差計算可知，熒光分光光度法測定二氧化硫檢出限為0.644 mg/kg。

2.5 方法學驗證

2.5.1 回收率試驗

取各類樣品各3份，分別加入100 μg/mL亞硫酸鈉使用液1.0 mL，測定熒光強度，計算加標回收率以及平均回收率，結果見表5。

表5 加標回收結果

由表5可知，5組樣品的加標回收率在93.35%～106.50%之間，平均回收率在97.68%～102.71%之間，說明該檢測方法有良好的準確性。

2.5.2 穩定性試驗

分別取蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍莓干樣本待測液，按照測定二氧化硫的方法測定其在0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h的熒光強度值。結果發現2.5 h以內5種樣本的熒光強度穩定性好，RSD范圍在1.76%～2.64%之間，表明5種樣本的避光保存穩定時間為2.5 h。

2.5.3 國標檢測方法比對

國標GB 5009.34—2016《食品安全國家標準 食品中二氧化硫的測定》規定方法為滴定法，為了進一步驗證熒光光度法的準確性和適用性，同時將5個樣品用國標方法進行測定，每個樣品平行測定5次，并將結果進行對比和差異分析，結果見表6。

表6 熒光分光光度法與國標方法比較

由表6可知，熒光分光光度法和國標法測定二氧化硫的結果無顯著差異(P>0.05)，且熒光分光光度法建立的測定二氧化硫的分析方法精密度更好，結果準確可靠，適合蜜餞類食品中二氧化硫殘留量的測定。

3 結論

本研究使用熒光分光光度計建立一套測定蜜餞食品中二氧化硫殘留量的新方法，通過掃描光譜發現最佳激發波長為324 nm，最佳發射波長為390 nm。對熒光化合物生成過程中緩沖液pH和添加量、鄰苯二甲醛加入量、乙酸銨加入量4個因素進行優化。最終確定最佳因素條件為緩沖液pH為6.6，鄰苯二甲醛用量、乙酸銨用量均為2.0 mL。根據優化條件繪制亞硫酸鈉標準曲線，得到回歸方程為y=290.92x+89.163，線性相關系數R2=0.9993。對蜜棗、藍莓干、話梅、葡萄干、芒果干5個樣品進行二氧化硫殘留量檢測，二氧化硫殘留量均值分別為35.731，13.087，300.542，127.092，189.961 mg/kg，均未超過國標要求的350 mg/kg。5種樣品的相對標準偏差RSD介于0.83%～4.59%之間，加標回收率均值在97.68%～102.71%之間，說明該方法有較好的準確性和精密性。通過和國標方法檢測結果比對，結果證明熒光分光光度法的精密度更好，結果準確可靠，可用于測定蜜餞食品中二氧化硫殘留量的分析。