酪蛋白/海藻酸鈉可溶膜制備工藝研究*

張雙明 ,梁雅楠 ,陳莉芝 ,徐文龍 ,祁居壽 ,楊 敏△

（1.甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅臨澤工業園區管理委員會凹凸棒石產業發展中心,甘肅 張掖 734200）

1 前言

牛乳中主要蛋白質為酪蛋白（Casein，CN）和乳清蛋白（Whey Protein，WP）。酪蛋白是一大類蛋白質的總稱，由αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN 4種單體組成，約占乳蛋白的80%。在乳中酪蛋白以膠束態存在，稱為酪蛋白膠束（Casein micelles，CM）。酪蛋白膠束不僅性能優良、營養價值高，而且形態特殊，具有天然的多孔狀特征，具有良好的吸附、包埋、脂肪結合等特性，可在蛋白類高端保健品中作為功能基料，用于負載營養成分[1]。

化學合成塑料制品因成本低廉、性質優良而被廣泛用于食品包裝和保鮮，但是使用后遺棄在環境中不易分解，造成嚴重的“白色污染”。隨著人們對食品品質和保藏期要求的提高，以及環保意識的增強，迫切需要一種綠色、無污染、可降解的食品包裝膜，以減小對生態環境的污染。因此，以天然可降解大分子為原料的可降解包裝已成為食品包裝領域的研究熱點[2]。可降解包裝膜制備常用原料為天然大分子化合物，如多糖、蛋白質。上述兩種物質不僅來源廣泛，而且安全無毒、可降解，還兼具一些生物活性，如營養補充和強化、抑菌等，是可降解包裝膜制備的首選原料。以天然大分子為原料經過適宜的構建和復配，制備的可降解包裝膜不僅性能優異，而且具備可食特性，備受研究者關注。

海藻酸鈉是一種親水性多糖，來源于褐藻，在食品工業常用作增稠劑、膠凝劑等。因天然無毒、可降解，海藻酸鈉常作為優良的成膜基質。研究表明，添加量蘋果多酚的海藻酸鈉/κ-卡拉膠基復合可食膜不僅機械性能和阻隔性較高，而且具有抗氧化性，能有效抑制腰果仁的氧化酸敗[3]。李慧等[4]用溶液共混法制備了海藻酸鈉/羧甲基纖維素鈉/明膠可食性包裝膜，其性能優良。除了多糖，蛋白質也是常用的成膜基質，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、小麥蛋白、玉米醇溶蛋白、膠原蛋白等[5-7]。陳野等[8]用玉米醇溶蛋白成功制備了具有一定耐水性的可生物降解性膜。甘釗生等[9]用魚鱗膠原蛋白制備了可食性復合膜，其對圣女果具有保鮮效果。Tien等[10]評價了酪蛋白鈣和乳清蛋白的成膜性及其對蘋果和馬鈴薯切片的保鮮效果，發現二者均可有效延緩切片的褐變。綜上所述，多糖和蛋白質材料不僅具有優異的成膜性，而且具有一定的保鮮效果，是食品包裝可降解及可食膜的首選基質。

本研究以海藻酸鈉、酪蛋白為基材，通過優化二者配比，以及甘油、二氧化鈦（TiO2）、凹凸棒土等用量，獲得了酪蛋白/海藻酸鈉可降解膜的制備工藝，并負載了姜黃素和花青素，評價了膜的溶解性、透光性和水蒸氣透過率。研究結果可為蛋白質基可降解膜的制備提供參考依據。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

酪蛋白（化學純）、姜黃素（分析純）、花青素（分析純）、海藻酸鈉（分析純）、TiO2（優級品），上海麥克林生化科技有限公司；甘油（分析純），天津市光復科技發展有限公司；凹凸棒土，由甘肅臨澤工業園區管理委員會凹凸棒石產業發展中心提供。其他試劑均為分析純。

2.2 儀器與設備

微機控制電子拉力測試機（CMT2502），深圳市新三思計量技術有限公司；水蒸氣透過率測試儀（PERME W3/030），濟南蘭光機電技術有限公司；電子分析天平（ME204E/02），梅特勒-托利多儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S），鄭州貝楷設備有限公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9013A），上海一恒科學儀器有限公司；紫外-可見光分光光度計（TU-1901），北京普析通用儀器有限責任公司；高度分散均質機（AD500SH），上海昂尼儀器有限公司；離心機（H1850），長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司。

2.3 膜制備工藝

配制4%的酪蛋白水溶液和1%的海藻酸鈉水溶液，取適量酪蛋白溶液于100 mL燒杯中，加入適量海藻酸鈉溶液，總體積為30 mL，加入適量甘油，置于45℃恒溫水浴中加熱攪拌20 min；向混合液中加入適量凸凹棒土，在轉速為10 000 r/min下高速剪切1 min；再加入適量TiO2，在轉速為15 000 r/min下高速剪切2.5 min；之后，加入適量氯化鈣（CaCl2），于45℃的恒溫水浴中加熱并磁力攪拌10 min，獲得涂膜液。將涂膜液注入鋪有保鮮膜的表面皿中，平板延流，55 ℃下烘干4 h，小心揭下，即得酪蛋白/海藻酸鈉膜。為評價膜對活性分子的負載性能，增加膜的抗氧化性和保鮮性能，以優化后的制備工藝為基礎制備涂膜液，向其中加入適量姜黃素或花青素，磁力攪拌10 min，成膜，用以測定膜性能。

2.4 膜制備工藝優化

以拉伸強厚度和斷裂伸長率為指標，選取酪蛋白與海藻酸鈉的體積比、甘油用量、凹凸棒土用量、CaCl2用量、TiO2用量為變化因素，設置不同梯度，探究膜的機械強度，以獲得最佳制備工藝。

2.4.1 CaCl2用量優化

以0.05 mol/L的CaCl2溶液為原料，設置0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL為添加量梯度，按2.3的工藝流程制備膜，進行相關性能測試，確定最優結果。

2.4.2 甘油用量優化

分別設置甘油添加量1 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，按2.3的工藝流程制備膜，進行相關性能的測試，確定最優結果。

2.4.3 凸凹棒土用量優化

設置凹凸棒土添加量分別為0.00 g、0.15 g、0.30 g、0.45 g、0.60 g，按2.3的工藝流程制備膜，進行相關性能測試，確定最優結果。

2.4.4 酪蛋白與海藻酸鈉配比優化

以4%的酪蛋白和1%的海藻酸鈉溶液為原料，總體積設置為30 mL，分別設置二者體積比為30∶0、25∶5、20∶10、15∶15、10∶20、5∶25、0∶30，按2.3的工藝流程制備成酪蛋白膜，進行相關性能測試，確定最優結果。

2.4.5 TiO2用量優化

設置TiO2添加量為0.00 g、0.15 g、0.30 g、0.45 g、0.60 g，按2.3的工藝流程制備膜，進行相關性能測試，確定最優結果。

2.5 膜性能測試

2.5.1 機械性能測定

參照《塑料薄膜拉伸性能試驗方法》（GB/T 1040—2006），檢測薄膜的拉伸強度（TS）和斷裂伸長率（EAB）。將膜裁切成2.1 cm×1.0 cm的長方形條狀，將膜條的兩端平整地夾在微機控制電子萬能材料試驗機的兩個端口處，開啟萬能試驗機開始測定，設置初始距離為30 mm，拉伸速度為300 mm/s。每種規格分別做3組平行。TS、EAB 計算公式分別為：

式中：F為膜斷裂時承受的最大張力（N）；B為膜寬度（mm）；H為膜厚度（mm）；Lmax為膜斷裂時的最大長度（mm）；L為膜的初始長度（mm）。

2.5.2 透光度測定

根據Ramos 等[11]的方法略有修改，采用紫外-可見分光光度計在600 nm 處測量膜的透光率（T）。以空白為對照，透光率間接表示膜的透明度，透光率值越大，表示透明度越高。將膜裁取3.0 cm×1.0 cm的長方形條狀，用鑷子將其貼于比色皿內壁，置于紫外-可見光分光光度計中進行測定，每個樣品隨機選取3個位置進行測量，取平均值。T的計算公式：

式中：T是膜的透光度（%）；ABS600是復合膜樣品在600 nm處的吸光度值。

2.5.3 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）掃描

采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（ATRFTIR）對所用的主要原料和膜進行掃描，以空氣為空白背景，掃描次數為32，透射模式下對波數4 000～400 cm-1進行光譜掃描。

2.5.4 水溶性測定

將制得的膜裁切成3.0 cm×3.0 cm的長方形條狀，取φ=10 cm的蒸發皿分別編號后，將裁切下來的膜條同時浸泡于10 mL的去離子水中。每隔5 min取上清液于離心管中，放入離心機中以轉速10 000 r/min離心10 min。取離心上清液置于比色皿中，以去離子水作為參比溶液，采用紫外-可見光分光光度計進行全波長掃描，評價膜的溶解性。

2.5.5 水蒸氣透過率

參考美國材料與試驗協會制定的E 96-93標準[12]方法測定，采用水蒸氣透過率測試儀（PERME W3/030）測定水蒸氣透過率。將薄膜裁剪成適宜大小，放入試驗杯中，并在其中加入定量的去離子水，然后置于實驗濕度為90%、溫度38 ℃的條件下，測試間隔30 min，每個試樣做3組平行實驗。水蒸氣透過率計算公式為：

式中：WVP為試樣的水蒸氣透過率（g·mm）/（h·m2·kPa）；Δm為t時間內的質量增量（g）；d為膜的厚度（mm）；A為膜透過水蒸氣的面積（m2）；t為測試時間間隔（h）；Δp為膜兩側的水蒸氣壓差（kPa），38 ℃下純水的飽和蒸汽壓為6.629 8 kPa。

2.6 數據分析與處理

采用Excel 2016 計算平均值及相對誤差值，采用Origin 8.5 繪圖軟件繪圖。

3 結果與分析

3.1 膜制備工藝優化

3.1.1 CaCl2用量優化

酪蛋白是鈣離子敏感蛋白，添加CaCl2可在蛋白內部形成交聯位點，促使酪蛋白形成致密網絡結構[13]。另外，鈣離子可交聯海藻酸鈉，使其凝膠。由圖1（a）可知，CaCl2添加量對酪蛋白膜拉伸強度和斷裂伸長率有顯著影響。當CaCl2添加量為50 μL時，酪蛋白膜的斷裂伸長率最高，當繼續增加CaCl2至100 μL時，伸長率迅速下降，但拉伸強度達到最大值。李夢琴等[14]在研究小麥面筋蛋白可食性復合膜中發現，隨著CaCl2濃度的增大，膜的拉伸強度先上升后下降，與本研究結果一致。添加一定量的CaCl2，在酪蛋白和海藻酸鈉內部形成鈣離子交聯的網絡結構，大分子鏈因交聯而相互纏結，因此斷裂伸長率迅速升高，拉升強度也顯著增大。當繼續添加CaCl2時，由于鈣離子對酪蛋白和海藻酸鈉的進一步交聯，拉伸強度繼續增加。然而，過度交聯雖然使大分子網絡結構更加穩定，但過多的交聯位點使膜的韌性變差，剛性增強，因此伸長率降低。當CaCl2添加量超過100 μL后，膜的拉伸性能顯著變差，甚至低于未添加CaCl2的膜，這是因為過量CaCl2使酪蛋白沉淀，因此機械性能降低。綜上所述，選取CaCl250 μL為最優添加量。

圖1（a） CaCl2用量對膜機械性能的影響

3.1.2 甘油用量優化

甘油添加量對膜性能的影響如圖1（b）所示。由圖可以看出，當甘油添加量為1 mL時，膜的機械性能最佳。隨著甘油添加量的增加，膜的機械性能先降低后增加。單一的蛋白膜中，蛋白質分子鍵的作用是剛性的，膜較脆，往往需要添加增塑劑通過減少聚合物相鄰鏈間的分子內相互作用[15]。增塑劑混溶在酪蛋白膜結構中，破壞了高分子間的結合，蛋白質分子間或分子內的相互作用減弱，軟化了酪蛋白膜的剛性結構，使得膜有效地延展和松弛[16]。當甘油量過少時，酪蛋白膜極易干裂，塑性較差，因此無法測出拉伸強度和斷裂伸長率（圖中未給出空白對照組數據）。當甘油量過多時，甘油填充在酪蛋白和海藻酸鈉分子間，阻礙了致密網絡結構的形成，原料凝膠性變差，因此膜的機械性能變差。冉銳敏等[17]在大豆分離蛋白膜結構與配方優化研究中發現，隨著甘油添加量的增加，大豆分離蛋白膜的拉伸強度降低。綜上所述，甘油的最優添加量為1.0 mL。

圖1（b） 甘油用量對膜機械性能的影響

3.1.3 凸凹棒土用量優化

凹凸棒土添加量對酪蛋白膜的機械性能影響如圖1（c）所示。由圖可以看出，與未添加凹凸棒土的膜相比，添加量為0.15 g時膜的拉伸強度顯著增加。凹凸棒比表面積大，表面活性高，含有極性的羥基，可以與蛋白質和多糖形成氫鍵[18]，因此，具有加固膜網絡結構的作用，使其拉伸強度增加。但是，膜內部網絡結構越致密，其韌性越差，因此添加凹凸棒土后，膜的斷裂伸長率降低。綜上所述，選擇凹凸棒土添加量為0.15 g為最佳參數。

圖1（c） 凹凸棒土用量對膜機械性能的影響

3.1.4 酪蛋白與海藻酸鈉配比優化

海藻酸鈉和酪蛋白比例對膜機械性能的影響如圖1（d）所示。由圖可以看出，未添加海藻酸鈉的酪蛋白膜具有一定的拉伸強度，說明酪蛋白具有一定的成膜性，但膜的機械強度較差。當海藻酸鈉與酪蛋白體積比為5∶25時，膜的拉伸強度和斷裂伸長率顯著增大。之后，隨著酪蛋白比例的降低，膜的機械性能基本呈線性降低。王岱[19]在可食性海藻酸鈉/淀粉薄膜的制備與性能研究中發現，隨著海藻酸鈉溶液質量分數的增加，膜抗拉強度逐漸增大，在質量分數達到3%后增加不明顯；斷裂伸長率隨著質量分數的增加出現先增大后減小的趨勢，與本研究結果基本一致。海藻酸鈉具有較高的黏度，與酪蛋白混合后，可形成填充型復合物；加上鈣離子的交聯作用，二者形成較為致密又柔軟的網絡結構，表現出優異的成膜性和機械強度[20]。當海藻酸鈉比例繼續增加時，在鈣離子作用下海藻酸鈉形成凝膠，成膜性變差，膜的機械強度降低。由此可見，海藻酸鈉和酪蛋白比例為5∶25時膜性能最佳。

圖1（d） 酪蛋白和海藻酸鈉配比對膜機械性能的影響

3.1.5 TiO2用量優化

大分子可食膜中添加納米填充物能夠提高其機械、熱力學和阻隔等性能[21-23]。另外，由于TiO2具有光催化活性，在紫外光輻射的條件下具有抑菌功能[24]。為了進一步提升膜的機械強度，添加適量TiO2，其添加量對膜機械性能的影響如圖1（e）所示。添加0.20 g TiO2后，膜的拉伸強度和斷裂伸長率顯著增加，這是由于TiO2分散于膜網絡結構中，起到固定網絡結構的作用，能夠顯著提高膜對外界應力的抵抗能力。另一方面，膜的斷裂伸長率隨著TiO2添加量的提高而顯著降低，這表明TiO2的加入降低了膜的韌性。因此，選擇添加0.20 gTiO2為最優參數。

圖1（e） TiO2用量對酪蛋白膜機械性能的影響

3.2 最優工藝下膜的機械強度與伸長位移

優化指標在最佳條件下膜的拉伸曲線如圖2所示。由圖可以看出，每次優化對于膜的機械性能都有較明顯的改善。添加甘油后，膜拉伸位移得到了提高，但韌性不足，原因是甘油軟化了酪蛋白膜剛性結構的同時破壞了蛋白分子間及其與其他各物質之間的相互作用。添加一定量的凹凸棒土之后，膜的機械性能明顯得到了提升。經過海藻酸鈉和酪蛋白配比的優化，同時有效提升了膜拉伸位移和韌性。最后，添加一定量的TiO2再次顯著提升了膜的韌性。最佳工藝下制備的膜具有一定的機械強度和韌性，可用于食品包裝和保鮮。

圖2 膜機械強度與伸長位移

3.3 膜的透光度分析

對于膜研究中，透光度是一個衡量其性能的重要參數。在食品包裝中，包裝膜的透光情況是消費者對于產品好壞的第一感覺指標。從圖3可以看出，整體來說該酪蛋白/海藻酸鈉可溶解膜具有很好的防透光性能，CaCl2作為交聯劑使得蛋白分子間或與其他各物質之間的結合更為緊密；甘油在軟化了酪蛋白膜剛性結構的同時，破壞了蛋白分子間或與其他各物質之間的結合，使得透光度增強；凹凸棒土具有獨特的三維空間鏈式結構及特殊的針、棒狀晶體結構，因而有不同尋常的吸附性能，引起了透光率增大；海藻酸鈉具有增稠劑的效果，當其與Ca2+共存時，可以大大提高海藻酸鈉的黏度，項本平和陳亞萍[25]在氧化淀粉的黏度與透光率關系的研究中發現黏度與透光率成反比關系，故此時的透光度減弱；TiO2納米顆粒是一種惰性的、無毒的氧化物，并被證實具有吸收可見光的性能，已被用于功能性食品的開發。它的加入使得透光率進一步下降。

圖3 膜的透光度

3.4 傅里葉紅外變換分析

圖4為原料和負載花青素5 mL、負載姜黃素5 mL的膜紅外譜圖。膠束態酪蛋白在3 301 cm-1處存在-OH伸縮振動峰；1 640 cm-1對應C=O伸縮振動峰，即酰胺Ⅰ帶；1 480～1 200 cm-1區間對應C-H及N-H振動以及酰胺結構的異構體，其是蛋白質的指紋區。海藻酸鈉在1 600 cm-1處為-COO-羥基鹽的反對稱伸縮振動峰，在1 500～1 250 cm-1為-OH的面內彎曲振動，在1 070 cm-1為C-O-C拉伸峰。由于凹凸棒土晶體的每單元層間通過氧連接成孔道式結構使凹凸棒土具有強吸附性，其不僅吸附Cu2+、Pb2+等陽離子或大分子、極性有機分子,還可吸附潤滑油脂、醇、醛、芳香烴鏈等大分子或細菌、霉塊等物質[26]，故圖4中凹凸棒土的紅外峰有可能是制備過程中所吸附的有機物質所致。負載花青素5 mL、負載姜黃素5 mL的膜紅外譜圖具有相似特征，其中包含了原料物質的主要特征峰，但精細化結構出現了差異，這有可能與各個原料之間發生了一些分子間的化學反應有關，從而出現了差異。相比較之下，負載花青素5 mL、負載姜黃素5 mL的膜紅外譜圖也存在差異，這與其所負載的物質不同有關。

圖4 膜的傅里葉紅外變換光譜

3.4 膜的水溶性分析

將負載原花青素和姜黃素的膜進行水溶性分析，結果如圖5所示。由圖可以看出，兩種膜均具有較好的水溶性，浸入水中5 min開始迅速溶解，在30 min溶解完全。另外，與姜黃素相比，原花青素在280 nm附近具有較強吸收，因此隨著溶解的進行，該處吸收強度逐漸增大，說明原花青素和姜黃素被均勻負載于膜內部，證實了涂膜液具有較好的成膜性，且成膜后原料中各物質分布均勻。

圖5（a） 負載原花青素膜的水溶性曲線

圖5（b) 負載原姜黃素膜的水溶性曲線

作為食品保鮮涂覆材料，需具有優異的成膜性，涂覆后可在食品表面形成保護膜，防止食品被環境中的微生物侵染而腐敗變質。另一方面，涂覆的膜需具有優良的可洗性能，即食用時可迅速將膜沖洗掉，不影響食品的外觀和口感。本研究制備的膜不但具有較好的成膜性，膜的機械強度也能使其抵抗一定程度的外界拉伸，而且膜易溶于水，即使浸泡于水中，5～15 min即可完全脫落。

3.5 膜的水蒸氣透過率分析

食品包裝的阻隔性是影響包裝對食品保護性能優劣的重要因素，不同的食品對其包裝的阻隔性要求也是不同的。食品包裝的阻隔性一方面保證外部環境中的各種細菌、塵埃、光、氣體、水分等不能進入包裝內的食品中，另一方面是保證食品中所含的水分、油脂、芳香成分等，對食品質量必不可少的成分不向外滲透，從而達到保證食品不變質的目的[27]。按2.5.5 的實驗方法及數據處理方式可得該膜在負載花青素和姜黃素時水蒸氣透過率分別為2.59（g·mm）/（h·m2·kPa）和2.66（g·mm）/（h·m2·kPa）。李夢琴在小麥面筋蛋白可食性復合膜的改性研究中所制得的膜水蒸氣透過率為0.503（g·mm）/（h·m2·kPa），通過對比發現其實驗主要材料為小麥面筋蛋白（谷朊粉）、大豆分離蛋白、氯化鈣、乙醇、甘油。由于麥谷蛋白具有彈性，麥醇蛋白具有延伸性，能與水形成網絡結構，從而具有優良的黏彈性、延伸性、吸水性、乳化性、成膜性等獨特的性能，故使其水蒸氣透過率較低。辛穎等[28]在酶法制備乳清蛋白可食性膜工藝的研究中所制得的膜水蒸氣透過率為1.21（g·mm）/（h·m2·kPa），其主要實驗材料為采用轉谷氨酰胺酶改性的乳清蛋白，由于轉谷胺酰胺酶（Transglutaminase，TG）是一種催化蛋白質分子間或分子內形成ε-（γ-谷氨酰基）賴氨酸共價鍵的酶，廣泛用于交聯酪蛋白、乳球蛋白、大豆蛋白、小麥麥谷蛋白等不同食品蛋白質，有助于蛋白質產生自我支持的網絡結構，增強成膜性能，故其水蒸氣透過率較低[29]。趙曉彤等[30]在超聲輔助提高大豆蛋白納米復合膜包裝性能研究及保鮮應用中所制得的膜水蒸氣透過率為6.22（g·mm）/（h·m2·kPa），其主要材料為大豆分離蛋白、聚乙烯醇、納米纖維素，由于材料差異，膜的水蒸氣透過率與本文實驗結果具有一定差異。

4 結論

以拉伸強度和斷裂伸長率為指標，通過優化獲得酪蛋白/海藻酸鈉膜的最佳制備工藝為CaCl2（濃度為0.05 mol/L）用量50 μL、甘油用量1 mL、凹凸棒土用量0.15 g、酪蛋白與海藻酸鈉體積比5∶25、TiO2用量0.20 g。在最佳工藝下，膜的機械性能優良，具有較好的水溶性，可用于食品包裝和保鮮。