聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料對燙傷大鼠創面菌群、膠質細胞活性及TGFβ1 蛋白的影響

王成楓，王金海

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州，350004；2.福建衛生職業技術學院藥學系，福建 福州，350028）

皮膚組織是人體面積最大的器官，對人體有著非常重要的保護作用。燙傷是臨床治療及日常生活中較為常見的意外傷害，多由光、電、熱等高溫液體/固體/蒸氣等導致的人體皮膚、黏膜、皮下組織等遭到破壞。現階段，對于燙傷的處理措施主要以抗菌、消炎等藥物進行干預。聚賴氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）作為一類天然的微生物代謝產物，形態表現為淡黃/白色粉末，溶于水，具有廣譜抑菌性，可對病原體、革蘭氏陽性/陰性菌、真菌等產生抑制效能，目前，許多研究也將聚賴氨酸應用于醫藥等領域。細菌纖維素又為細菌納米纖維素（Bacterial Nano-Cellulose，BNC），是經木醋桿菌等微生物分泌形成的天然高分子葡聚糖，具有纖維素的結構與化學性質[1]。BNC和植物或海藻產生的纖維素在化學性質上是相同的，均是經β-D-葡萄糖通過β-1,4-葡萄苷鍵結合成的直鏈，而其作為一種新型生物材料，具有較高的彈性模量、水結合性、生物適應性以及可降解性[2-6]。溶菌酶作為可存在于微生物細胞壁的一類水解酶，是體內重要的非特異體液免疫因子，又稱細胞壁溶解酶，廣泛存在于機體組織、體液和分泌物內，也是構成機體表面多種防御因素之一，具有一定的抗炎和抗免疫功能[7]。膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)為分泌型蛋白，由神經膠質細胞合成分泌,并在中樞與外周神經膠質細胞外以及外周皮膚組織中均有所表達，影響組織重建[8]。在燙傷創口愈合過程中，生長因子可參與其調控的整個過程，而在眾多肽類生長因子中，轉化生長因子β1(TGFβ1)對創傷愈合具有較明顯的干預作用[9]。本文通過對大鼠進行燙傷實驗，討論PLL/BNC對其皮膚創傷愈合的作用，并分別從創面菌群、膠質細胞活性及TGFβ1蛋白的影響等來揭示其在燙傷治療中的作用機理，意在為聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料的開發及臨床應用提供更多技術支持。

1.材料與方法

1.1 實驗大鼠

選取SPF級健康成年雄性SD大鼠40只，周齡10～12，體質量為180-250g，購于上海斯萊克實驗動物公司，許可證號：SYXK(閩)2018-035中進行，本動物實驗均在福建衛生職業技術學院實驗中心進行。

1.2 藥物、試劑與儀器

ε-聚賴氨酸（南京軒凱生物科技有限公司）,細菌纖維素由本實驗室制備,皮膚創面無機誘導活性敷料（深圳市華生元基因工程發展有限公司，批準文號：100126），戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：30037517），0.9%生理鹽水、檸檬酸緩沖液（山東威高股份有限公司,批號1207121、1901025），蘇木素-伊紅（福建中醫藥大學醫學實驗中心），一抗I、Ⅱ型膠原蛋白抗體（美國，Abcam），山羊抗鼠 GFAP 抗體(Santa Cruz 公司)，蛋白定量試劑盒（美國Bio-Rad公司），切片機（上海醫用儀器廠），顯微鏡（德國，Leica DMI 4000B/DFC425C）。

1.3 分組、模型建立

40只大鼠隨機分為健康組、燙傷組、PLL/BNC組、藥物對照組，平均每組10只。除10只健康大鼠外其余均依據文獻[10]建立燙傷動物模型。將大鼠用40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉后四肢展開取仰臥位，將小鼠背部皮膚毛發剔除，蘸取質量分數8%的硫化鈉溶液，均勻涂抹在剃毛處，將該部位擦拭干凈并暴露皮膚，把2cm直徑的空心塑料管立在大鼠剃毛后位置，將管與皮膚進行密切接觸，在管內灌入約為100℃的沸水，位于管高1/3位置，沸水管與皮膚接觸20s后結束，此時大鼠皮膚即形成了直徑約2cm且深Ⅱ度的燙傷區，且每只大鼠背部均在相同建立燙傷區。

1.4 PLL/BNC 抗菌敷料制備

依據文獻[11]將制備的BNC膜片在100mL濃度為(0、0.5%、1.0%)的PLL溶液中進行浸泡，并將其放進超聲清洗器中進行超聲震蕩，將聚賴氨酸與細菌纖維素均勻融合并充分吸附，時間為1h,進行3次重復震蕩，每次時間間隔為為10min，并將吸附后的膜片浸泡在15%甘油內，3s后將其取出,將表面殘余液體晾干，于烘箱中進行烘干，直至恒重，完成后以備后續實驗。

1.5 給藥

造模結束后，所有大鼠于建模后第2天開始治療。將大鼠創面周圍用生理鹽水清潔擦干后，燙傷組大鼠用0.9%氯化鈉溶液清洗創面后用0.5%的碘伏消毒創面，用2層0.9%氯化鈉溶液紗布外敷包扎；藥物對照組用0.9%氯化鈉溶液清洗創面后使用0.5%碘伏消毒，將皮膚創面無機誘導活性敷料軟膏均勻涂敷在創面，厚度約2mm，最后以無菌紗布包扎；PLL/BNC組采用以上方法消毒處理后，采用聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料進行干預，將其敷于創口處，于每日更換一次，均連續干預14d。

1.6 方法與檢測

1.6.1 創面溶菌酶測定

依據文獻[12]分別于治療后第7d和第14d用注射器吸取生理鹽水1mL，反復沖洗創口分泌3次，收集沖洗液并注入試管中，以3000×g離心15min，取下20μL沉液，注入含菌瓊脂平板加樣小孔內，于37℃恒溫箱內觀察結果，測量小孔周圍溶菌環直徑，代入回歸方程計算出創面分泌物中含溶菌酶量。

1.6.2 創面愈合觀察

觀察各組大鼠治療7 d、14 d 后的創面愈合率，燙傷面積計算通過Meeh’s公式計算體表面積(Acm2)=K×W2/3，W體重(g)，K=10，燙傷部位體表面積(B)=π×r1×r2cm (r1：短軸半徑，r2：長軸半徑)，實際的燙傷面積=B/A，并依據損傷剩余面積計算創面愈合率=(損傷總面積-創面剩余面積)/總面積×100%

1.6.3 HE 染色

麻醉處死大鼠后，取大鼠創傷處皮膚，保留皮下組織，于生理鹽水中清洗后，平鋪于濾紙上，在固定液中固定24h，完成后，將組織修剪為0.5cm×0.5cm×0.2cm方塊，于包埋框中流水將固定液進行沖洗，脫水、透明、浸蠟，標本經脫水、常規石蠟包埋切片后，HE染色，二甲苯處理，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察皮膚組織變化。

1.6.4 免疫組化法檢測星形膠質細胞標志物膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)

干預14d后，經腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后,取創傷處皮膚及皮下組織,固定12h，加含20%蔗糖的磷酸緩沖液4℃過夜，沉淀后冷凍、切片20μm，漂片法在0.01mol/LPBS緩沖液中染色，切片置于0.25%TritonX-100溶液中，37℃溫箱孵育30min，兔抗大鼠GDNF一抗4℃孵育48h，加生物素化羊抗兔IgG二抗及過氧化物酶標記的鏈霉卵白素37℃孵育30min，均以0.01mol/LPBS洗滌3次,5min/次，二氨基聯苯胺顯色，裱片在涂有明膠的載玻片上，脫水、透明、封片，每組隨機選20張進行圖像分析,檢測GDNF陽性細胞的平均光密度與陽性面積百分比。

1.6.5 Western-blotting 檢測轉化生長因子β1(TGFβ1)、I 型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白

取大鼠皮膚組織剪碎后預冷，PBS洗滌后加入300uL的RIPA裂解液，于勻漿器中研磨裂解，冰浴中靜置20min后，在4℃、14000r/min下離心15min，取上清液至離心管中，依據BCA蛋白定量說明測定蛋白濃度，蛋白調整濃度后，電泳，條件為濃縮膠80V，分離膠120V，后進行轉膜，終止后PBS沖洗5min，麗春紅染膜并觀察，PBS沖洗，封閉液封閉1h，，加入稀釋的一抗I型膠原蛋白(1:5000)、Ⅱ型膠原蛋白(1:2000)、TGFβ1（1:1500）,4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5000），孵育1h后PBS洗滌，ECL化學發光試劑盒曝光顯影，計算與β-actin及蛋白的相對表達含量。

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組創面分泌物溶菌環直徑和溶菌酶含量表達

健康組皮膚組織良好；燙傷組大鼠在治療后7d、14d溶菌環直徑和溶菌酶含量均較低（P＜0.05）；與燙傷組大鼠比較，藥物對照組大鼠在治療后7d、14d溶菌環直徑和溶菌酶含量均升高（P＜0.05）；與藥物對照組比較，PLL/BNC組大鼠在治療后7d、14d溶菌環直徑和溶菌酶含量均升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組創面分泌物溶菌環直徑和溶菌酶含量表達（）

表1 各組創面分泌物溶菌環直徑和溶菌酶含量表達（）

注：與燙傷組比較bP＜0.05；與藥物對照組比較cP＜0.05。

2.2 各組大鼠創面愈合表達

與燙傷組比較，藥物對照組大鼠在治療后7d和治療后14d的創面愈合表達均增加（P＜0.05）；與藥物對照組比較，PLL/BNC組大鼠治療后7d和治療后14d的創面愈合表達增加（P＜0.05），見表2圖1。

圖1 創面愈合情況

表2 各組大鼠創面愈合表達（，%）

表2 各組大鼠創面愈合表達（，%）

注：與燙傷組比較bP＜0.05；與藥物對照組比較cP＜0.05

2.3 HE 染色

健康組大鼠皮膚組織良好，無損傷狀況；燙傷組壞死細胞較多，細胞排列紊亂，表層及毛囊壞死，血管擴張，炎癥細胞浸潤嚴重；藥物對照組血管部分增多，仍有壞死細胞及毛囊壞死；PLL/BNC組新生血管明顯增多，血管密度增大，且細胞排列較藥物對照組整齊，見圖2。

2.4 各組大鼠皮膚組織中GDNF 陽性細胞表達

與健康組比較，燙傷組大鼠GDNF陽性細胞平均光密度、陽性面積均升高（P＜0.05）；與燙傷組比較，藥物對照組大鼠GDNF陽性細胞平均光密度、陽性面積均降低（P＜0.05）；與藥物對照組比較，PLL/BNC組大鼠GDNF陽性細胞平均光密度、陽性面積均降低（P＜0.05），見表3圖2。

表3 各組大鼠皮膚組織中GDNF 陽性細胞表達（，%）

表3 各組大鼠皮膚組織中GDNF 陽性細胞表達（，%）

注：與健康組比較aP＜0.05；與燙傷組比較bP＜0.05；與藥物對照組比較cP＜0.05

圖2 HE 染色(蘇木精-伊紅染色×200)

圖2 免疫組織化學染色(×200)

2.5 各組大鼠皮膚組織中TGFβ1 及I 型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白表達

與健康組比較，模型組大鼠皮膚組織中TGFβ1、I型、Ⅱ型膠原蛋白降低（P＜0.05）；與燙傷組比較，藥物對照組大鼠TGFβ1、I型、Ⅱ型膠原蛋白升高（P＜0.05）；與藥物對照組比較，PLL/BNC組大鼠TGFβ1、I型、Ⅱ型膠原蛋白升高（P＜0.05），見表4圖3。

表4 各組大鼠皮膚組織中TGFβ1、Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白表達（）

表4 各組大鼠皮膚組織中TGFβ1、Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白表達（）

注：與健康組比較aP＜0.05；與燙傷組比較bP＜0.05；與藥物對照組比較cP＜0.05

圖3 TGFβ1 及Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白表達

3 討論

燙傷產生不僅可使皮膚造成創傷，還可造成機體皮膚軟組織部分缺損，并伴隨創面臨污染及感染等危險。因此，進行有效的創面清理、藥物治療及創面修復是現階段燙傷救治的關鍵。

溶菌酶可同時存在于嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞中，是關鍵的非特異體液免疫因子，且在機體正常防御及非特異免疫反應中均有所表現，其含量增加能夠使大量抗體、補體、滅菌因子、纖維素等增加，進而有利于炎癥消除和組織重建，加快創面愈合[13]。本文研究顯示，PLL/BNC組大鼠在治療后7d、14d溶菌環直徑和溶菌酶含量均有所升高，并優于同期治療的藥物對照組。當燙傷產生時局部凝血會發生障礙，導致機體炎癥反應出現，并伴隨細胞增殖、細胞外基質合成及重塑發生障礙，使溶菌酶的正常防御和非特異免疫遭到破壞，進而導致創傷處伴隨組織缺損性損傷。賴氨酸是機體中極其重要的氨基酸，能夠被機體合成組織所需的蛋白質并參與代謝反應，而PLL有著較高的抗菌性能，對多種革蘭氏陽性/陰性菌、真菌及病原體產生調控作用[14]。BNC作為一種優良的敷料基材，具有高純度、高持水性、高力學性能以及良好生物相容性等多項優點。BNC利于皮膚組織良好生長和限制感染。有學者在研究中發現，添加細菌纖維素對部分細菌生長具有顯著抑制作用[15]。同時，朱鴻偉等人在ε-聚賴氨酸及溶菌酶抑菌劑的開發及應用研究中發現，PLL與溶菌酶相協調可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等產生[16]。本文研究與之結果相類似。由此推測，在燙傷中進行PLL/BNC處理可能通過促進改善燙傷皮膚患處有益菌的形成，并通過增進再上皮化，提高機體防御功能，進而改善及新生血管重建，提高創面愈合時間及愈合質量。

燙傷中創面愈合的關鍵病理機制為，創傷處局部組織和周圍細胞的免疫功能降低，致使炎癥發生反復性，最終導致創面表皮修復困難，影響疾病進程。本文研究顯示，PLL/BNC組大鼠治療后7d、14d的創面愈合率增加，并優于同期治療的藥物對照組。當燙傷產生時，常形成創面組織水腫、皮膚充血及局部皮膚組織損傷現象，因此，在治療時應以降低感染率、維持創面穩定、降低皮膚壞死概率為研究重點。

經研究，BNC因其有良好的超細納米纖維多孔構造，在透氣、透水、吸濕以及阻擋外界微生物感染等方面具有較高的安全性，也因其具有較強的機械度在對創面包扎時通過適當施壓可提高滲液引流，進而消除水腫，促進創面愈合[17-18]。有學者在研究中發現，有PLL參與的復合物制備有望作為理想的醫用敷料，在慢性傷口護理、傷口感染治療和傷口愈合過程中具有極其重要意義[19]。由此推測，PLL/BNC在燙傷中可能通過改善創面微環境，發揮其對創面消炎殺菌的效用，在防止創面細菌滋生引發感染及創面粘連的同時，加速肉芽生長、促進表皮形成提高創面愈合。

星形膠質是中樞神經系統內數量最多的一種膠質細胞，而GDNF作為膠質細胞的關鍵因子具有神經營養作用。本文研究發現，PLL/BNC組大鼠的GDNF陽性細胞平均光密度、陽性面積降低較顯著，并優于同期治療的藥物對照組。當燙傷發生時，胞漿內含有的膠質原纖維GFAP在這一過程中可發揮調控作用。GFAP可使增生的星形膠質細胞在釋放軸突再生抑制因子的同時重構了干擾髓鞘和軸索的再生，進而參與組織修復進程。PLL作為陽離子殺菌劑，對細菌細胞膜和動物細胞膜具有高度的選擇性，在質量濃度為2mg/mL時對人真皮成纖維細胞無毒性，且生物相容性佳[20]。而BNC可通過增加毛細血管和成纖維細胞減輕創面炎癥、促進創面閉合及肉芽組織形成、增強膠原沉積及血管生成，使創傷組織加速完成修復[21]。Liu S等人在研究中表示，PLL能夠與靜電產生反應，吸附到細菌表面，并通過打破細胞壁和細胞膜的整體性使內容物外滲、殺滅細菌，過程中可通過調節星形膠質細胞活性從而促進創面愈合[22]。由此推測，PLL/BNC在燙傷治療中，可能通過干預膠質細胞內GDNF合成與分解，在發揮降低局部炎癥皮膚及皮下組織的同時調節GDNF免疫反應陽性細胞,并通過參與創面修復，進而發揮燙傷皮膚組織保護作用。

I型和Ⅱ型膠原蛋白作為皮膚組成的關鍵因素，對燙傷后的創面愈合具有極其重要意義。TGFβ1作為細胞生長中的多功能調節因子，能夠增進成纖維細胞與外基質的生長，誘導細胞因子釋放，促進傷口愈合。本文研究中，PLL/BNC組大鼠TGFβ1、I型、Ⅱ型膠原蛋白升高較顯著，并優于同期治療的藥物對照組。燙傷可在一定程度上造成創面皮膚中膠原沉積與創面收縮發生阻礙，導致TGF-β1向肌成纖維細胞轉化困難，進而使得皮膚新生組織形成發生阻滯。BNC作為皮膚創面的活性敷料，能明顯抑制細菌形成，對難愈合性創面具有顯著有效性，可通過增加結締組織、成纖維細胞及膠原蛋白含量改善創面損傷。PLL在創面產生殺菌作用的同時為組織修復提供良好環境，促進組織膠原蛋白在血管損傷中的修復和形成。莊兢等人在對皮膚損傷治療中使用無機誘導活性敷料進行干預，發現其對難愈型皮膚損傷中相關膠原蛋白的合成具有良好促進效果[23]。提示，PLL/BNC可能在持續誘導細胞自身膠原蛋白與相關上皮生長因子結合的同時，使TGFβ1通過促進膠原的合成，誘導新生組織形成，提高創面愈合，加速創面愈合。

綜上所述，聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料可對燙傷大鼠產生治療效果，可顯著抑制燙傷創面菌群，調節膠質細胞活性，研究研究與調節TGFβ1蛋白相關。但由于本次研究對于聚賴氨酸/細菌纖維素在膠質細胞中的研究及敷料的用量上仍存在一定不足，會在日后實驗中通過擴大樣本量進一步使其完善。