粒細胞集落刺激因子對腦小血管病大鼠神經元活性、血管超微結構及神經元核抗原陽性表達的影響

席自中，宋彥，宋元貞，張依璐

腦小血管?。–SVD）是由顱內小血管（包括小動脈、微動脈、毛細血管、小靜脈和微靜脈）發生病理改變而引起的一組疾病。CSVD 的病理生理改變包括血管壁改變、血-腦脊液屏障功能受損、腦灌注下降、血管運動反應性降低、水腫、缺血、神經纖維脫髓鞘和小膠質增生等［1-2］。在影像學上，CSVD 可表現為腔隙性腦梗死、腦白質病變及腦微出血。卒中、癡呆、老齡化被認為是最常見的CSVD 發病危險因素，CSVD 會對血管壁造成一定的損傷，在腦室周圍有大量的血漿蛋白進入，血-腦屏障發生障礙，進而導致腔隙性腦梗死等疾病的發生［3］。和其他類型的腦卒中相比，CSVD 所致的腦卒中雖然較輕，但長期的預后效果較其他類型的腦卒中相對較差。目前CSVD的發病率逐年增加，但治療CSVD還沒有更為有效的辦法，因此治療CSVD 的有效方法是當今臨床上研究的熱點。粒細胞集落刺激因子（G-CSF）是一種調節骨髓粒系造血細胞的細胞因子，其造血功能在中樞神經系統內尤為重要，G-CSF 及其受體在腦組織中大量存在［4-5］。有文獻證實G-CSF 對缺血再灌注損傷大鼠的腦組織具有一定的保護作用，其作用機制是通過對血管內皮增生修復的有效促進來實現［6］。神經元核抗原（NeuN）是一種特異性蛋白質，存在脊椎動物神經系統中，主要表達于神經與細胞核和細胞漿中［7］。有學者研究發現，NeuN存在人早期胚胎的中樞神經系統中，在神經元大部分NeuN 呈高表達，少部分為低表達和陰性表達［8］。有關NeuN 在CSVD 中的分布未見報道，因此本研究于2020 年1 月至2021 年1 月探究G-CSF 對CSVD 大鼠神經元活性、血管超微結構和NeuN 陽性表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本實驗所用大鼠均從北京斯貝福實驗動物可以有限公司購買，許可證號SCXK（京）2016-0002。SD 雄性大鼠40 只，24 周齡，清潔級，體質量范圍為300～350 g。所有大鼠飼養在20～25 ℃的環境中，相對濕度保持在50%～65%，保持環境相對安靜，12 h光照晝夜交替，大鼠自由進食攝水。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 試劑和儀器本實驗所有試劑和儀器分別為杭州九源基因工程有限公司生產的G-CSF 注射液；美國Vector 公司生產的小鼠抗大鼠NeuN 單克隆抗體；武漢塞維爾生物科技有限公司生產的兔抗GAPDH 抗體；艾比瑪特德國LEICA 公司生產的LEICA CRYCUT1800 型冰凍切片機；日本奧林巴斯公司生產的FV1000 型熒光顯微鏡；武漢博士德生物公司生產的免疫組織化學試劑盒和蘇木精-伊紅染色（HE染色）試劑盒。

1.3 動物分組和CSVD 模型的制備采用隨機數字表法將40 只大鼠分為假手術組10 只和模型組大鼠30只。將模型組大鼠制備CSVD大鼠模型。制備自體血漿：采取大鼠左心室血液，將血液經80 ℃高溫干燥后研磨，在200 μm 的篩孔中過濾，制備成栓子，在造模時將栓子和鹽水混合為混懸液。麻醉大鼠后，大鼠仰臥位固定于手術臺，剔除頸部毛發后消毒，在正中位置切一小口，將左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈鈍性分離后暴露在外，在頸總動脈的近心端用動脈夾暫時夾閉，把頸外動脈遠心端的位置結扎，將制備好的栓子混懸液由頸外動脈逆近心端逆向推注0.3 mL。將頸總動脈處夾子打開，恢復頸部血流讓栓子從頸內動脈通過，進入到大腦前動脈、中動脈及大腦側枝，將頸外動脈近心端結扎后縫合切口、消毒。造模成功標準：利用激光散斑成像技術檢測假手術組和模型組腦血流量，模型組腦血流量較假手術組明顯減少，表示造模成功［9］，同時記錄大鼠死亡數量。在造模過程中模型組大鼠在手術過程中死亡6 只，在術后有4 只大鼠死亡，剩余20只造模成功。假手術組大鼠僅分離頸總、頸內和頸外動脈，不進行結扎，其余手術步驟同模型組相同。將20 只CSVD 造模成功大鼠平均分為CSVD模型組（CSVD 組）和CSVD 模型大鼠給予G-CSF 干預治療組（G-CSF 組），每組10 只。造模成功后，將G-CSF 組大鼠經皮下注射G-CSF 50 μg/kg，1天1次；假手術組和CSVD 組大鼠均經皮下注射等量的生理鹽水干預，1天1次，三組大鼠均連續注射7 d。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學圖片（蘇木精-伊紅染色×400）

圖2 各組大鼠神經元細胞凋亡情況（TUNEL檢測×400）

1.4 標本取材麻醉各組大鼠，將大鼠仰臥位固定手術臺，打開胸腔將心臟充分暴露在外，將灌注針頭經心尖緩慢插入到主動脈，止血鉗夾緊后用生理鹽水灌注，將大鼠右心耳剪開，發現流出的液體呈清涼時停止灌注；停止后將多聚甲醛注入，當發現大鼠的四肢變白、身體僵硬時斷頭處死大鼠，立即取出大鼠腦組織，分離額葉皮質腦組織用于電鏡觀察；剩下的腦組織用于HE 染色、NeuN 免疫組織化學染色及TUNEL染色。

1.5 HE 染色觀察海馬組織形態變化將三組大鼠分別麻醉致死，取出大鼠視交叉前后2 mm冠狀切片組織塊，將其固定于甲醛溶液中，用石蠟將組織包埋制成4 μm 石蠟切片，對切片進行HE 染色處理，用中性樹膠對切片進行封片，顯微鏡下觀察大鼠海馬組織的病理學變化。

1.6 TUNEL 檢測神經元細胞凋亡分別麻醉三組大鼠，斷頭處死后將大鼠的腦組織取出，用多聚甲醛將腦組織固定，經脫水、透明、包埋處理后，制成5 μm 的冠狀切面，實驗操作均按照TUNEL 試劑盒說明嚴格進行。細胞核中凋亡細胞為棕黃色，在顯微鏡下隨機選取基底節不同區的3 個視野，計算細胞的凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.7 透射電鏡觀察微血管結構和內皮形態將額葉腦皮質制備成1 mm3的組織塊，將組織固定后漂洗組織，經乙醇脫水、石蠟包埋后制成50～60 nm 的薄片；用醋酸鈾一枸櫞酸鉛雙染色，用透射電鏡對切片組織進行觀察。

1.8 免疫熒光染色檢測NeuN表達水平分別麻醉三組大鼠，打開大鼠胸腔，將右心耳剪開后，將生理鹽水從左心室緩慢灌注，當右心耳流出的液體為清涼時停止灌注，用250 mL 多聚甲醛繼續灌注，灌注后取出大鼠腦組織，將海馬區進行冰凍并切片。對切片進行高溫抗原修復，常規畫圈，把打孔液加入其中，15 min 后用山羊血液進行封閉，1 h 后將NeuN一抗加入，4 ℃環境孵育過夜后，對組織進行清洗，將山羊抗兔TgG 二抗加入，在室溫下孵育2 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）對組織再次清洗，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對切片組織進行復燃，15 min后用甘油將組織封邊。每只大鼠各隨機選取1張切片進行觀察，對陽性細胞數計數。

1.9 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測NeuN 和VEGF mRNA 表達分別麻醉三組大鼠，斷頭處死后將海馬組織取出，用Trizol 裂解液對總的RNA 進行提取，用逆轉錄酶將mRNA 逆轉錄為互補DNA（cDNA）。引物序列：NeuN 正向引物：5'CACGGCATGACCCTCTACAC 3'，反向引物：5'GTCTGTGCTGCTTCATCTGC 3'；β 肌動蛋白（β-actin）正向引物：5'GTCGTACCACTGGCATTGTG 3'，反向引物：5'TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG 3'；VEGF 正 向 引物：5'TGCCCCTAATGCGGTGT3'，反 向 引 物：5'TGCTGGCTTTGGTGAGGTT3'。反應條件：預熱94 ℃20 s，預熱72 ℃30 s，共40 個循環。通過2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.10 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件進行統計。計量數據符合正態分布以± s形式表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬組織病理學變化比較假手術組大鼠腦組織未見結構異常。CSVD 組大鼠腦組織結果紊亂，海馬區齒狀回病灶嚴重，神經組織大量壞死，腦皮質神經元變小，尼氏小體大量消失；干預后的G-CSF 組大鼠海馬區較SCVD 組大鼠有明顯改善，神經組織壞死數量減少。見圖1。

2.2 各組大鼠神經元細胞凋亡率比較假手術組、CSVD 組、G-CSF 組 細 胞 凋 亡 率 分 別 為（21.34±4.43）%、（50.31±2.92）%、（30.90±8.10）%（F=69.72，P＜0.001）。與假手術組相比，CSVD 組增多（P＜0.05），G-CSF組明顯低于CSVD組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 額皮質區微血管內皮細胞形態學變化假手術組微血管沒有明顯異常；CSVD 組可見血管管周結構溶解，血管內壁粗糙，血管基膜和基質之間的間隙增寬，細胞核大量固縮，線粒體內空泡嚴重；和CSVD組相比，G-CSF組大鼠腦組織微血管得到了明顯改善，管周完整程度較CSVD 組也改善明顯，內皮細胞核核固縮現象也明顯減輕。見圖3。

圖3 各組大鼠微血管內皮細胞形態情況（透射電鏡×12 000）：A為假手術組；B為腦小血管?。–SVD）組；C為粒細胞集落刺激因子（G-CSF）組

2.4 各組NeuN 陽性表達比較假手術組、CSVD組、G-CSF 組海馬組織中NeuN 陽性細胞率分別為（0.572±0.015）%、（0.375±0.020）%、（0.551±0.012）%（F=456.60，P＜0.001）。與假手術組相比較，CSVD組明顯降低（P＜0.05）；G-CSF 組明顯高于CSVD 組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬齒狀回神經元核抗原（NeuN）表達情況（免疫熒光染色×200）

2.5 各組大鼠NeuN 和VEGF mRNA 表達水平比較與假手術組相比，CSVD 組大鼠海馬齒狀回NeuN 和VEGF mRNA 表達降低（P＜0.05）；與CSVD組相比，干預后的G-CSF 組大鼠NeuN 和VEGF mRNA表明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠NeuN和VEGF mRNA表達水平比較/± s

表1 各組大鼠NeuN和VEGF mRNA表達水平比較/± s

注：NeuN為神經元核抗原，VEGF為血管內皮生長因子。①與假手術組相比，P＜0.05。②與CSVD組相比，P＜0.05。

組別假手術組CSVD組G-CSF組F值P值鼠數10 10 10 NeuN mRNA 0.48±0.13 0.11±0.04①0.32±0.11①②33.76＜0.001 VEGF mRNA 1.45±0.21 0.76±0.31①1.31±0.26①②19.21＜0.001

3 討論

CSVD 主要累及直徑為30～800 μm 沒有側肢吻合的解剖終末動脈，包括顱內小動脈、微動脈、小靜脈和毛細血管等，占全部缺血性腦卒中病因的25%～30%，有供血區域主要在腦深部白質及腦干，80 歲以上的老年人腦白質信號基本都高，其中腦微出血發病率占36%以上［9］。CSVD的發病相對隱蔽，在臨床上以缺血性/出血性卒中、認知功能障礙等癥狀為主，但其具體的發病機制目前還不是十分的明確，因此對CSVD 的早期預防和治療是未來臨床研究的主要方向，也能為臨床治療提供可靠依據。有研究發現，CSVD 發病率主要集中于老年人，其發生發展極有可能有外周血內皮細胞的參與［10］。文獻研究顯示，腦小血管內皮損傷介導CSVD 的發病，CSVD 的早期病理生理變化很可能是腦小血管內皮損傷［11］。因此，促進腦小血管內皮細胞修復新生以減輕腦血管損傷可能是治療CSVD的途徑之一。

G-CSF 是一種刺激髓系造血細胞增殖、分化的生長因子，在臨床上廣泛應用，主要常用于中性粒細胞減少癥［12］。研究證實，G-CSF 會透過血-腦屏障和其受體相結合而發生系列作用，例如動員造血干細胞、抗細胞凋亡、抗炎等［13］。近年來發現國內外已經應用G-CSF 治療多種神經損傷性疾病，目前已經進入Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗階段；另外，G-CSF 在多種缺氧缺血性腦損傷新生動物模型中被證明在神經保護方面擁有巨大前景［14］。本研究采用同種系微栓子體外注入法制備CSVD 大鼠模型，造模成功后CSVD 組大鼠海馬組織發生病理性改變，且大鼠的神經元細胞也出現了大量的凋亡，經過G-CSF 干預后的G-CSF 組和CSVD 組相比，大鼠海馬組織得到明顯改善，神經元細胞凋亡也得到了明顯抑制，可見G-CSF 可有效改善CSVD 大鼠海馬組織的病理學改變及抑制神經元細胞的凋亡。肖云月等［15］研究發現，G-CSF 可能通過增加VEGF 表達水平，促進腦小血管內皮細胞修復，減少神經元凋亡，從而減輕原發性高血壓大鼠CSVD損傷。

臨床研究發現，G-CSF可激活血管內皮細胞，動員內皮祖細胞，對血管的新生進行促進，改善大腦中動脈閉塞；其還會和神經元和神經膠質細胞上的相應受體結合，刺激細胞內信號轉導通路促進神經發生，進而對神經進行保護［16］。本研究發現，CSVD組大鼠微血管損傷嚴重，給予G-CSF 后血管內皮損傷和血管周圍水腫明顯減輕，進而證實了G-CSF 對血管內皮能進行有效地保護。何曉英等［17］通過動物實驗研究發現，G-CSF 可上調ICH 后VEGF 表達，增加血腫周圍新生血管生成，改善神經功能。NeuN是一種可溶性核蛋白，在體外能與DNA 結合，識別神經元特異的核蛋白單克隆抗體的產生，已成為中樞神經系統成熟神經元的常用標志物，在大鼠大部分神經元有明顯的表達［18］。VEGF 是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，可促進血管內皮細胞遷移、增殖及血管形成。本研究發現CSVD 組大鼠中NeuN 和VEGF mRNA 表達降低，G-CSF 干預后大鼠的NeuN 和VEGF mRNA 表達得到了明顯回升，進而猜測G-CSF 通過提高NeuN 和VEGF 表達發揮神經保護作用。有研究證實，G-CSF 能增強腦組織中VEGF表達，從而發揮腦組織的保護作用［19］。

綜上所述，G-CSF可促進內皮細胞增生修復、促進神經元存活而減少凋亡發生，同時有效促進NeuN的陽性表達，進而發揮腦保護作用。

（本文圖1，2，4見插圖9-3）