梔子苷對高糖誘導腎小管上皮細胞轉分化中TGF-β/Smad通路的影響*

梁棟 ，楊洪濤

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，天津 300381；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

隨著生活飲食習慣的改變，糖尿病全球患病率程上升趨勢，目前已成為威脅人類壽命的嚴重疾病。據相關流調顯示，目前中國成人2型糖尿病的患病率已達10.9%[1]。糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發癥。在全球范圍內，糖尿病腎病是導致慢性腎臟病（CKD）甚至終末期腎病（ESRD）的主要繼發性因素。在中國，既往慢性腎小球腎炎是導致慢性腎臟病發病的首要原因，隨著糖尿病發病率的持續上升，相關研究證實，糖尿病腎病已經取代慢性腎小球腎炎成為中國導致慢性腎臟病的主要原因[2-3]。腎小管間質纖維化是糖尿病腎病主要的病理特征，而在糖尿病腎病相關病程進展中，腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化（EMT）不僅促進腎間質纖維化，而且是糖尿病腎病腎臟損傷的主要機制[4]。而轉化生長因子β1是公認的致纖維化因子[5]，其過度表達可誘導糖尿病腎病，激活其下游相關因子，加速腎間質纖維化。最近的研究也證實抑制轉化生長因子-β1和 Smad相關蛋白（TGF-β1/Smad）可抑制腎纖維化和上皮細胞轉分化。既往的研究證實，高糖環境、持續炎癥狀態均可激活相關信號通路導致糖尿病持續腎損傷[6-7]。而其中白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是具有代表性的相關炎癥因子，其激活中性粒細胞并使其聚集，進一步向炎癥部位遷移、吞噬細胞、釋放卵清蛋白酶、促進細胞凋亡等，促進炎癥進一步發展，影響糖尿病患者免疫調節[8]。

梔子苷（GE）作為環烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是梔子中主要活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗炎等多種生物學作用[9]，在糖尿病腎病小鼠中可改善疾病狀態[10]，有研究表明，梔子苷可以降低脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞相關炎癥狀態中TNF-α和IL-1β、IL-6等的表達和釋放[11]。但是否通過改善腎小管上皮細胞轉分化發揮作用尚不清楚。因此，高糖誘導人近端腎小管上皮細胞HK2，探討GE對腎小管上皮細胞轉分化是否發揮作用，以初步探討GE緩解糖尿病腎病的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人近端腎小管上皮細胞HK2，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，資源編號：3111C0001CCC000160。

1.2 藥品、試劑及儀器 GE（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，CAS：24512-63-8）；胎牛血清、無糖DMEM培養液（美國Sigma公司，貨號分別為：F8318、90113）；IL-1β、IL-6、TNF-α 酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒，一抗 TGF-β1、Smad3、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，英國Abcam公司，貨號分別為：ab215715、ab40854、ab21027）磷酸化 Smad3（Phospho-Smad3，p-Smad3）（美國 CST 公司，批號 9520）；RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一條鏈合成試劑盒、2×SYBR qPCR Mix（北京 TAINGEN 公司，貨號分別為：DP419、KR104、KR108）。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀（美國ABI公司，型號：7500）；蛋白凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司，型號：GelDoc 2000）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及處理 實驗分為對照組、高糖組、GE 1、10、50、100 μmol/L 組。HK2 細胞在含 10%胎牛血清DMEM培養液中置于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞密度達到90%左右時進行傳代，細胞處于對數期時進行實驗。

對照組在5.5 mmol/L低糖DMEM培養液中培養，除對照組外，其余各組均于25mmol/L高糖DMEM培養液中培養，GE 1、10、50、100 μmol/L 組同時添加 GE，使 GE 終濃度分別為 1、10、50、100 μmol/L，干預48 h。

1.3.2 顯微鏡下觀察HK2細胞形態 倒置顯微鏡下觀察HK2細胞的形態學情況。

1.3.3 qRT-PCR檢測細胞中纖連蛋白（FN）、E-鈣黏素（E-cad）、Ⅳ型膠原（COLⅣ）mRNA 水平 RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA。qRT-PCR儀對FN、E-cad、COLⅣ、內參 GAPDH 擴增，FN F：5’-CGAAATCACAGCCAG TAG-3’、R：5’-ATCACATCCACACGGTAG-3’，E-cad F：5’-CTGAGAACGAGGCTAACG-3’、R：5’-TTCAA TCCAGCACATCC-3’，COLⅣ F：5’-TATTCCTTCCT CATGCACACGGCG-3’、R：5’-CCAATTTTTGGGTT GGCACC-3’，內參 GAPDHF：5’-AGTTCACTGGCGT CTTCAC-3’、R：5’-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3’。20 μL 反應體系：1 μL 40 ng/μL cDNA、10 μL 2×Mix、0.5 μL/0.5μL（F/R）、8 μL ddH2O；反應條件：95 ℃、40 s；95 ℃、30 s，（FN 59 ℃、45 s，E-cad 61 ℃、40 s，COLⅣ 57 ℃、45 s），40 個循環。2-ΔΔCt法計算FN、E-cad、COLⅣmRNA相對表達水平。

1.3.4 ELISA 檢測細胞上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α水平 收集細胞培養液，3 000 r/min離心5 min收集上清，離心半徑為32.3 cm。嚴格按照人IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測細胞中TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA蛋白水平 收集細胞，添加蛋白裂解液冰上裂解10 min，14 000 r/min、4℃離心20 min提取總蛋白，離心半徑為11.09cm。10%凝膠電泳分離蛋白，280 mA 40 min PVDF膜轉膜；PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA，4℃孵育過夜；加入對應二抗，室溫孵育1 h。避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。條帶灰度值通過image J軟件分析獲得。

1.4 統計學方法 統計學軟件GraphPad 8.0進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05時表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態 對照組細胞呈多邊形或卵圓性，分布均勻；高糖組細胞部分呈現長梭形、胞核呈梭形變；隨著GE劑量的升高，細胞形態逐漸恢復正常。見圖1。

圖1 各組細胞形態情況（×200）Fig.1 Cell morphology of each group(×200)

2.2 GE對細胞中纖維化標志物FN、E-cad、COLⅣmRNA水平的影響 與對照組相比，高糖組細胞中FN、COLⅣmRNA水平升高，E-cad mRNA水平降低（P＜0.05）；與高糖組相比，GE 1 μmol/L 組細胞中FN mRNA 水平降低（P＜0.05），GE 10、50、100 μmol/L組細胞中FN、COLⅣmRNA水平降低，E-cad mRNA水平升高（P＜0.05）。見表 1。

表1 6組細胞中FN、E-cad、COLⅣmRNA水平比較（n=6，±s）Tab.1 Comparison of FN，E-cad and COLⅣmRNA levels in 6 groups of cells（n=6，±s）

表1 6組細胞中FN、E-cad、COLⅣmRNA水平比較（n=6，±s）Tab.1 Comparison of FN，E-cad and COLⅣmRNA levels in 6 groups of cells（n=6，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05。

組別 FN E-cad COLⅣ對照組 1.01±0.12 0.99±0.09 0.98±0.09高糖組 3.16±0.31* 0.37±0.04* 2.43±0.25*GE 1 μmol/L 組 2.42±0.25# 0.43±0.04 2.18±0.16 GE 10 μmol/L 組 2.14±0.19# 0.57±0.05# 1.96±0.18#GE 50 μmol/L 組 1.86±0.17# 0.73±0.08# 1.53±0.05#GE 100 μmol/L 組 1.34±0.12# 0.82±0.06# 1.38±0.14#

2.3 GE 對上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與對照組相比，高糖組上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與高糖組相比，GE 1、10、50、100 μmol/L 組上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見表 2。

表 2 6 組上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（n=6，±s）Tab.2 Supernatant of IL-1β、IL-6、TNF-α level comparison in 6 groups of cells（n=6，±s）

表 2 6 組上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（n=6，±s）Tab.2 Supernatant of IL-1β、IL-6、TNF-α level comparison in 6 groups of cells（n=6，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05。

組別 IL-1β IL-6 TNF-α對照組 26.46±3.16 49.19± 7.15 116.15±13.69高糖組 86.28±6.98* 136.48±13.96* 348.19±30.18*GE 1 μmol/L 組 67.49±5.86# 86.49± 9.14# 298.48±25.41#GE 10 μmol/L 組 56.66±4.94# 72.46± 7.92# 215.19±13.59#GE 50 μmol/L 組 43.71±4.69# 69.48± 7.18# 158.59±12.59#GE 100 μmol/L 組 34.85±6.15# 62.18± 6.75# 139.29±13.16#

2.4 GE 對細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA蛋白水平的影響 與對照組相比，高糖組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平升高（P＜0.05）；與高糖組相比，GE（1、10、50、100）μmol/L組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖 2、表 3。

圖2 6組細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA 蛋白水平情況Fig.2 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA protein level in 6 groups of cells

表 3 6 組細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA 蛋白水平比較（n=6，±s）Tab.3 Comparison of TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA protein level in 6 groups of cells（n=6，±s）

表 3 6 組細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA 蛋白水平比較（n=6，±s）Tab.3 Comparison of TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA protein level in 6 groups of cells（n=6，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05。

組別 TGF-β1 Smad3 p-Smad3/Smad3 α-SMA對照組 0.43±0.04 0.67±0.07 0.09±0.01 0.06±0.01高糖組 1.21±0.18*0.68±0.08 1.12±0.11* 0.38±0.04*GE 1 μmol/L 組 0.96±0.09# 0.65±0.06 0.89±0.06# 0.26±0.03#GE 10 μmol/L 組 0.45±0.05# 0.65±0.07 0.34±0.06# 0.19±0.04#GE 50 μmol/L 組 0.24±0.05# 0.67±0.08 0.35±0.04# 0.12±0.02#GE 100 μmol/L 組 0.11±0.01#0.68±0.05 0.32±0.04# 0.09±0.01#

3 討論

梔子是茜草科植物梔子的果實，是中國的傳統中草藥，具有瀉火除煩、涼血解毒、清熱利濕、消腫止痛等作用。GE作為梔子重要活性成分，在糖尿病中具有保護胰島β細胞結構，從而達到降血糖目的。在腎小管上皮細胞中是否亦發揮類似功效抑制腎小管上皮細胞轉分化進而緩解糖尿病腎病，目前尚不清楚。

腎小管上皮細胞轉分化是細胞在病理條件下的形態、結構、功能改變現象，與腫瘤轉移、細胞修復、臟器纖維化關系密切，特別是臟器纖維化會引發腎衰竭[12]。FN、COLⅣ均是細胞外基質主要成分，在腎臟疾病早期即可出現，誘導膠原的分泌和沉積，進而促進腎間質纖維化過程[13]。正常情況下腎小管上皮細胞通過多種黏附蛋白緊密連接，E-cad作為黏附蛋白，在細胞膜上表達較多，具有維持細胞穩定性和完整性作用[14]，E-cad在腎小管上皮細胞上表達降低，腎小管上皮細胞間黏附性喪失，變成單個細胞，促進腎小管上皮細胞轉分化，E-cad是腎小管上皮細胞轉化的第一道屏障[15]。本研究發現，與對照組相比，高糖組部分細胞呈長梭形、形態發生改變，細胞中FN、COLⅣmRNA水平升高，E-cad mRNA水平降低，提示高糖可誘導腎小管上皮細胞之間的黏附作用降低、腎小管上皮細胞轉分化，且促進膠原的分泌和沉積，促進纖維化過程；與高糖組相比，GE各劑量組均可在一定程度上降低FN、COLⅣmRNA水平，升高E-cad mRNA水平，從而增加腎小管上皮細胞黏附、減少膠原沉積，實現對腎小管上皮細胞轉分化的緩解作用。

炎癥損傷是腎小管間質纖維化的關鍵，病理情況下產生各種炎癥因子，炎癥因子又通過旁分泌、自分泌等過程擴大炎癥效應，產生炎癥級聯反應，促進糖尿病腎臟疾病的發展，導致腎纖維化過程[16]。本研究發現，與對照組相比，高糖組上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，提示高糖可促進腎小管上皮細胞炎癥過程，加速炎癥反應。與高糖組相比，GE各劑量組上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，提示GE具有抑炎作用，抑制腎小管上皮細胞炎癥反應。

TGF-β1作為細胞增殖、分化的調控基因，亦可調節細胞外基質分泌[17]，TGF-β信號通路已經公認作為腎小管上皮細胞轉分化的關鍵介質，在血管內皮損傷、腎小管萎縮、足細胞損傷等多方面影響糖尿病腎病[18]，TGF-β信號通路中Smad蛋白亦參與這一過程[19]。α-SMA作為肌成纖維標志蛋白，可促進細胞纖維肌絲的形成，TGF-β可通過Smad過程誘導成纖維細胞標志物α-SMA的表達從而成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化，促進FN、COLⅣ的分泌[20]；TGF-β/Smad通路亦可參與炎癥免疫信號通路過程[21]。本研究發現，與對照組相比，高糖組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平升高，提示高糖誘導腎小管上皮細胞TGF-β/Smad通路處于激活狀態，促進細胞纖維肌絲形成和腎小管上皮細胞轉分化。與高糖組相比，GE各劑量組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平降低，提示GE可抑制TGF-β/Smad通路，促進細胞間黏附作用、降低炎癥反應，從而抑制腎小管上皮細胞轉分化，抑制腎小管間質纖維化。

綜上所述，GE可能通過降低FN、COLⅣmRNA水平，升高E-cad mRNA水平，從而增加腎小管上皮細胞黏附、減少膠原沉積，實現對腎小管上皮細胞轉分化的緩解，同時抑制腎小管上皮細胞炎癥反應，從而抑制腎小管上皮細胞轉分化，抑制腎小管間質纖維化。其是否通過其他途徑影響腎小管上皮細胞轉分化，尚需進一步研究。