天祝白牦牛IFN-γ、IL-2和MHC抗病基因多態(tài)性研究

吳貝寧，魯媛媛，高 原，張雅欣，王進(jìn)娥，霍生東

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

白牦牛是世界上罕見的牦牛地方類群和遺傳資源，被列為國(guó)家級(jí)家畜品種，并享有“高原白珍珠”之稱。牦牛具有耐寒、耐粗、耐勞、耐缺氧等特點(diǎn)，可以利用其他家畜無(wú)法利用的高寒草場(chǎng)牧草資源，為農(nóng)牧民提供肉、乳、毛皮、役力等生產(chǎn)資料和生活資料[1]。有研究報(bào)道，動(dòng)物對(duì)多種疾病的抵抗力在一定程度上取決于基因。因此，通過發(fā)現(xiàn)抗病基因來進(jìn)行抗病育種，可以提高動(dòng)物的免疫力，降低藥物用量，從而推動(dòng)畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

干擾素（interferon,IFN）主要來源于T淋巴細(xì)胞，是一種具有抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力的蛋白質(zhì)因子。干擾素家族[2]是出現(xiàn)最早且作用最快的一種抗病毒體系。根據(jù)IFN的結(jié)構(gòu)及抗原性，可以將其分為IFN-a、IFN-β、IFN-γ三大類；按照受體類型，可以分為I型IFN和Ⅱ型IFN，I型IFN包含IFN-a、β等[3]，Ⅱ型IFN只有IFN-γ一種類型，又稱為免疫干擾素，且與機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，除了以上兩種之外，根據(jù)IFN與其受體的結(jié)合方式，又可分為三種類型，即IFN-A1、IFN-A2、IFN-A3。

目前已有研究表明，IFN基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及抗病毒感染都有一定作用。Guzman等[5]通過對(duì)牛IFN基因和抗病毒作用的研究發(fā)現(xiàn)，牛BoIFN-γ對(duì)水泡性口炎病毒有明顯的抑制作用，且具有3個(gè)抗病毒活性區(qū)段。說明該基因可能與牛對(duì)病毒的抗性有關(guān)聯(lián)，并且此基因與牛的抗病毒能力存在一定關(guān)系。

白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，它能促進(jìn)活化的T細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性、分化及增殖能力[6]。已有研究表明，IL-2直接或間接的具有生長(zhǎng)因子和分化信號(hào)[7]，其作用機(jī)制可能與Tc細(xì)胞的增殖有關(guān)[8]。但目前關(guān)于IL-2基因多態(tài)性的相關(guān)研究較少。

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是超基因家族中的一個(gè)大類[9]。牛的MHC又被稱為BoLA基因[10]。MHC是影響免疫反應(yīng)和識(shí)別的重要因素，它與動(dòng)物的易感性和抗性有關(guān)，是一種具有重要意義的抗性遺傳基因。另外，已有研究顯示，MHC基因多態(tài)性與許多疾病的耐受性及敏感性相關(guān)，如口蹄疫[5]、乳腺炎[11]等。

本試驗(yàn)以天祝白牦牛為研究對(duì)象，通過對(duì)與動(dòng)物抗病力密切相關(guān)的IFN-γ、IL-2和MHC基因的多態(tài)性進(jìn)行研究，為研究天祝白牦牛抗病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為牦牛健康養(yǎng)殖和綠色養(yǎng)殖提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)對(duì)天祝藏族自治縣13只健康白牦牛（2～5歲）進(jìn)行頸靜脈采血，每只3 ml，所采集的樣品具有品種的典型特征。采集的牦牛血使用EDTAK2進(jìn)行抗凝，再低溫送回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃保存，備用。

1.2 血液DNA的提取

按照購(gòu)買的DNA試劑盒說明書，提取牦牛的基因組DNA，將得到的基因組DNA分成兩份，一份-20 ℃保存，另一份用來PCR擴(kuò)增，然后使用UV1800紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)血液DNA的濃度和純度。

1.3 引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增

根據(jù)NCBI上已公布牛MHC（Gene ID：282530）、牛IFN-γ（Gene ID：102267095）和牛IL-2（Gene ID：102272426）基因DNA的參考序列，利用在線軟件Primer-Blast設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1，對(duì)基因部分的外顯子和內(nèi)含子設(shè)計(jì)序列。引物由北京奧科鼎盛生物科技公司合成。

表1 基因引物序列

PCR反應(yīng)體系（25 μl）：2×F8 Master Mix 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，基因組DNA 4 μl，滅菌超純水7.5 μl。經(jīng)過多次摸索最終確定反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，65.4 ℃/63.5 ℃/66 ℃退火30 s，72 ℃延長(zhǎng)1 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 PCR-SSCP檢測(cè)

取6 μl變性上樣Buffer置于PCR管內(nèi)，加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物，振蕩混勻，98 ℃水浴10 min變性后，迅速取出冰浴8 min。將PCR產(chǎn)物與變性buffer混合液上樣至加樣孔，然后在聚丙烯酰胺凝膠中160 V電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠取出進(jìn)行染色。主要過程：先用蒸餾水清洗2遍，將凝膠放在染色盤并倒入染色液，放置在水平搖床上搖晃15 min，確保染色均勻，染色后用雙蒸水洗膠，倒入顯色液，溶液變黑，倒出，再用雙蒸水清洗，再次倒入適量的顯色液在搖床上搖晃30 min，待DNA條帶合適，用雙蒸水終止顯色，并拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA，結(jié)果如圖1所示。所提取的DNA條帶清晰，說明血液DNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 牦牛血液DNA提取結(jié)果

2.2 牦牛基因擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)表1所列引物信息，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行多次優(yōu)化，最終確定最優(yōu)條件，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)牦牛IFN-γ、IL-2、MHC基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2～4所示，各基因擴(kuò)增片段大小均與預(yù)期相符，且條帶清晰，特異性良好，可用于后續(xù)SSCP檢測(cè)。

圖2 IFN-γ基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 MHC基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 SSCP檢測(cè)結(jié)果

2.3.1IFN-γ基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)擴(kuò)增IFN-γ基因進(jìn)行SSCP檢測(cè)，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的IFN-γ基因出現(xiàn)一種帶型（圖5），命名為AA。

圖5 IFN-γ基因擴(kuò)增片段SSCP檢測(cè)結(jié)果

2.3.2IL-2基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)擴(kuò)增IL-2基因進(jìn)行SSCP檢測(cè)，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的IL-2基因無(wú)多態(tài)性表現(xiàn)（圖6），命名為BB。

圖6 IL-2基因擴(kuò)增片段SSCP檢測(cè)結(jié)果

2.3.3MHC基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)擴(kuò)增MHC基因進(jìn)行SSCP檢測(cè)，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的MHC基因出現(xiàn)兩種帶型（圖7），分別命名為TT和TA型。

圖7 MHC基因擴(kuò)增片段SSCP檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)所用區(qū)段IFN-γ表現(xiàn)出一種帶型，在以往試驗(yàn)中已經(jīng)證明[12]，IFN-γ可以協(xié)同間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，而間充質(zhì)細(xì)胞可以有效促進(jìn)造血干細(xì)胞移植，提高成功率，減少移植物抗宿主病。根據(jù)此試驗(yàn)結(jié)果，可以試著將IFN-γ用于協(xié)同免疫抑制，從而提高臨床治療效果。Shaoyong Li等[13]研究表明，IFN-α負(fù)載的SLN可能是獸醫(yī)治療中有用的配方。Xiju Shi等[14]對(duì)MDBK/VSV細(xì)胞株進(jìn)行了抗病毒活性測(cè)試，結(jié)果表明，6種重組的IFN-α（rIFN-α）對(duì)MDBK/VSV細(xì)胞株的抑制作用均比CEF/VSV強(qiáng)1 000倍以上。另外，rIFN-αs可以通過利用CPE抑制MDBK細(xì)胞株中感染性牛鼻氣管炎病毒的復(fù)制和增殖。結(jié)果表明，rIFN-αs是一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型抗病毒藥物，它具有很好的生物活性和廣譜效應(yīng)。

本試驗(yàn)未檢測(cè)出IL-2基因具有多態(tài)性，這可能是由于基因具有保守性或樣本量較小影響多態(tài)性的檢出。付滿良等[15]研究成功克隆了牦牛IL-2基因，其原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)牦牛具有顯著的免疫活性，為研制新型免疫增強(qiáng)劑提高牦牛的抗病能力和增強(qiáng)牦牛疫苗的免疫保護(hù)率奠定了良好基礎(chǔ)。同時(shí)白細(xì)胞介素IL-2能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]。

MHC在本試驗(yàn)中表現(xiàn)出高度多態(tài)性。Othman[17]研究結(jié)果顯示，不同的MHC基因型可能對(duì)提高埃及水牛特別是埃及流行的O型口蹄疫病毒有很大幫助。乳房炎是奶牛生產(chǎn)中最普遍的一種疾病，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一[18]。DRB3基因是動(dòng)物免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要的多態(tài)性基因，多態(tài)性最為豐富的基因位點(diǎn)可在動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中高度表達(dá)，與許多疾病的耐受性、易感關(guān)系密切。由此推斷，MHC基因的多態(tài)性與隱性乳房炎有一定關(guān)系，這對(duì)奶牛隱性乳房炎的預(yù)防和治療具有一定的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)IFN-γ、IL-2和MHC基因的多態(tài)性與牦牛抗病之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：IFN-γ只有一種基因型，IL-2未檢測(cè)出基因型，MHC具有兩種基因型。因此，天祝白牦牛抗病性主要與MHC基因的表達(dá)密切相關(guān)。