綿羊Myl3基因啟動子區的克隆、分析及蛋白表達

張春蘭

（濰坊學院 生物與海洋學院，山東 濰坊 261061）

肌球蛋白輕鏈3基因（Myosin light chain3，Myl3）是動物體肌肉組織中編碼肌球蛋白的基因之一。研究發現該基因及其編碼蛋白（MYL3）主要在小鼠[1]和牛[2]的心肌細胞中表達，MYL3蛋白C端Ser殘基的磷酸化與心肌收縮有關[3]，并且發現該基因突變與心肌的增生有密切關系[4~6]。

雖然大量研究表明該基因在心肌的分化和發育中發揮了重要作用，但是對其表達調控的研究甚少，在羊上還鮮有報道。前期研究中在綿羊骨骼肌組織中利用5′和3′RACE法克隆得到了該基因的全長cDNA序列[7]。本試驗以獲得的cDNA序列為參考，對其啟動子區序列進行了克隆和分析，并利用Western blotting法對其編碼蛋白在小尾寒羊各種組織中的表達情況進行分析，從而為深入研究其功能和調控機理建立基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗用小尾寒羊來自山東魯良優質肉羊科技示范有限公司。從純種群中選取3只11月齡母羊，宰殺后迅速采取心、肝、肺等組織并立即投入液氮保存備用。

1.2 啟動子區的克隆及特征分析

1.2.1 引物設計

將前其獲得的綿羊Myl3的cDNA序列（Genbank登錄號KJ710703）與NCBI中的預測序列加以比對，查找起始密碼子。以起始密碼子上游序列為參考，以Primer Premier 5和DNAClub軟件設計引物（F：5′-ATGTGCCAACCAGAGGAG 3′，R：5′-GAGAAGGAAGCCGAAAGC 3′），并交由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴增及測序

依照PCR MasterMix試劑盒（TIANGEN，KT201）說明書，以小尾寒羊基因組DNA為模板擴增獲得Myl3基因的啟動子區序列，并依照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN，#0691）說明書對PCR產物進行純化和回收。將陽性克隆送于上海生物工程有限公司進行測序，以DNAman7.0軟件查看測序峰圖及測序序列。

1.2.3 生物信息學分析

將測序所得序列以CpGislands（http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html） 和 CpGPlot（https://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot） 分析其CpG島（設定參數值為CG%>50%，Obs/Exp>0.65，序列長度≥200 bp）； 以 Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預測啟動子；以McPromote在線工具預測轉錄起始位點；提交至http://www.dan.affrc.go.jp/PLACE/分析其潛在的順式作用元件；并以 AliBaba（http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）對轉錄因子結合位點加以分析。

1.3 蛋白表達分析

取小尾寒羊各種組織，以RIPA裂解液（Solarbio，R0010）提取總蛋白后進行SDS-PAGE電泳分離。分離條帶經電轉移法轉移至PVDF膜上，以兔MYL3多克隆抗體（Proteintech，10913-1-AP）進行一抗孵育。然后以山羊抗兔二抗（上海雅酶生物科技有限公司，LF102）孵育后，加入ELC Plus超敏發光液（Solarbio，PE0010）進行顯影和拍照。以GAPDH蛋白的表達水平為參考，通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

2 結果與分析

2.1 啟動子區序列

經瓊脂糖凝膠電泳，該基因啟動子區序列擴增條帶單一。該單一條帶經克隆測序，獲得長為990 bp的序列（圖1）。

圖1 Myl3基因啟動子區的PCR擴增

2.2 生物信息學分析

如圖2所示，該序列有1個CpG島，位于15～216 bp處；存在1個基礎啟動子，位于803～853 bp處；在其34 bp處有1個TATA-box；有4個CAAT-box，分別位于3、308、794和835 bp處；并在536 bp處有1個GC模序。

圖2 Myl3基因啟動子區的生物信息學分析

經分析發現，該序列有多種轉錄因子的結合位點。其中結合位點較多的轉錄因子有Sp1、MyoD、NF1、AP1等。

2.3 小尾寒羊不同組織MYL3蛋白表達差異

如表1和圖3所示，MYL3蛋白分子量約為22KD，主要在小尾寒羊的心肌中表達，其次為骨骼肌；在脾和卵巢組織中有少量表達，而在其他組織中均無表達。

表1 小尾寒羊各種組織中MYL3蛋白的表達量（×104）

圖3 MYL3蛋白在小尾寒羊各組織中的表達

3 討論

典型的真核生物基因啟動子主要包括TATA-box、CAAT-box、GC-box等順式作用元件。這些元件在基因的轉錄過程中具有重要的調控作用。本試驗獲得的綿羊Myl3基因啟動子區序列中擁有這些元件，并且具有多個CAAT-box，說明該基因可能具有較高的轉錄頻率。但是，由于多數CAAT-box距離轉錄起始位點較遠，它們能否增加該基因的轉錄頻率還有待于進一步研究證明。

真核生物許多管家基因的啟動子區通常存在CpG島。轉錄因子Sp1在動物體多種組織中均有表達，并且結合于許多管家基因的啟動子中[8]。本試驗分析發現，在該基因啟動子區序列中存在有CpG島，并且含有多個Sp1轉錄因子的結合位點，說明該基因是一個管家基因，其表達方式為組成型表達。

Sp1廣泛參與了細胞的增殖、分化和調亡等多種代謝活動[8]。在小鼠[8]和大鼠[9]中均發現Sp1可通過調控相關基因的轉錄進而調控骨骼肌的生長。多個研究表明，MyoD作為一種轉錄調控因子，在骨骼肌中進行特異性表達，對骨骼肌的生成和分化具有重要的調控作用[10,11]。本試驗在綿羊Myl3的轉錄調控區域發現有多處Sp1和MyoD轉錄因子的結合位點，從而認為Sp1、MyoD和Myl3基因在綿羊骨骼肌的生長和發育中具有協調的調控作用。

本試驗發現綿羊MYL3蛋白分子量約為22kD，這與前期根據編碼的氨基酸預測得到該蛋白分子量為21.961kD相一致[7]。蛋白表達譜顯示該基因編碼蛋白主要在綿羊的心肌中表達、其次為背最長肌，這與在小鼠[1]、牛[2]和豬[12]中的發現相一致。綜上分析推測認為，綿羊Myl3基因的表達可能在Sp1、MyoD等轉錄因子的調控下對骨骼肌和心肌組織的生長和發育具有重要的調節作用。

4 結論

綿羊Myl3基因啟動子區序列有一個基礎啟動子和一個CpG島，是一個管家基因。綿羊MYL3蛋白分子量約為22 kDa，在心肌組織中表達量最高，其次為骨骼肌。Myl3基因的表達可能受到Sp1、MyoD等轉錄因子的調控。