基于UPLC-MS/MS的3 個李品種果實初生代謝物分析

張 琴，黃世安，林 欣，羅登燦，彭俊森，朱守亮，董曉慶,*

（1.貴州大學農學院，貴州省果樹工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省果樹蔬菜工作站，貴州 貴陽 550025）

李（L）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（）植物，是多年生核果類水果，果肉酸甜可口且營養價值高，富含多種糖、有機酸、氨基酸、維生素、膳食纖維和礦物質等多種營養成分，具有治療疾病、心管疾病、增強免疫、抗氧化等多種生理功能。與其他果實相比，李果實中的膳食纖維、酚類物質含量和抗氧化活性均相對較高。

植物初生代謝物包括糖類、氨基酸、核苷酸、有機酸等物質，是植物生長發育和繁殖等生命活動必不可少的基礎物質和能量來源，主要作用是參與細胞的能量代謝。糖、有機酸和氨基酸等初生代謝物含量是評價果實品質的重要指標。代謝組學發展至今，其研究手段更加高效準確，在環境科學、毒理學研究、食品與營養學、疾病診斷、植物代謝研究等學科領域得到廣泛應用。Francini等利用代謝組學對不同品種的蘋果干進行分析，發現兒茶素、表兒茶素和綠原酸等酚類物質是區別不同品種的重要物質，與苦澀味密切相關。方賢勝等利用超高效液相色譜-串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術對淺黃色和紫色核桃內種皮代謝物進行了研究，為核桃內種皮中化學物質表征和功能成分研究提供了參考。Wang Dandan等基于廣泛靶向代謝組學技術對黑芝麻中的營養成分及其在中藥中發揮作用的相關代謝物進行了鑒定。Zou Shicheng等利用廣泛靶向代謝組學鑒定了枇杷的關鍵味覺成分，為枇杷味覺變異的潛在代謝原因提供了新的見解。王夢琪等采用UPLC-MS/MS技術分析比較了不同香型綠茶非揮發性成分差異。但是運用代謝組學技術分析不同品種李果實初生代謝成分及其差異的研究尚鮮見報道。

本研究以蜂糖李、空心李和脆紅李果實為研究材料，采用UPLC-MS/MS技術，從差異代謝物的角度著手，對3 個李品種果實的初生代謝物進行定性定量分析，揭示其氨基酸及其衍生物、有機酸和糖類等物質組成及各成分差異，旨在為李果實中的化學物質表征和功能成分研究提供參考，對提高李產量以及增強果實品質有非常重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以蜂糖李（‘Fengtang’，FTL）、空心李（‘Kongxin’，KXL）、脆紅李（Lindl. c.v‘Cuihong’，CHL）的果實為實驗材料，其中，蜂糖李于2020年6月27日采自貴州省鎮寧縣六馬蜂糖李種植農民專業合作社果園（105.52 E，25.37 N），空心李于2020年7月12日采自貴州省沿河土家族自治縣農民專業合作社果園（108.32 E，28.32 N），脆紅李于2020年8月24采自貴州省貴陽市烏當區貴州省農業科學院果樹研究所百宜實驗基地（106.59 E，26.48 N）。采后4 h內運回貴州大學園藝實驗室，挑選大小、色澤及成熟度一致（8 成熟）、無機械損傷的果實進行處理。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；二甲基亞砜 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Scientz-100F凍干機 寧波新芝公司；MM 400研磨儀 德國Retsch公司；Nexera X2超高效液相色譜日本島津公司；4500 QTRAP串聯質譜 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將蜂糖李、空心李、脆紅李果實去皮，各3 個生物學重復，迅速置于液氮中，隨后轉移到－80 ℃超低溫冰箱中保存備用。對超低溫冷凍保存的3 組供試樣品放置于凍干機中進行真空冷凍干燥；研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液提取液中；每30 min渦旋一次，每次持續30 s，共渦旋6 次，置于4 ℃冰箱過夜；12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS分析

利用UPLC-MS/MS聯用儀對樣本進行分析。

UPLC條件：SB-C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.0～9.0 min，95%～5% A、5%～95% B，維持1 min；10.0～11.10 min，5%～95% A、95%～5% B，并平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 °C；進樣量4 μL。

MS條件：電噴霧離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V；離子源氣體I、氣體II和簾氣分別設置為50、60、25 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。三重四極桿掃描使用多反應檢測模式，并將碰撞氣體（氮氣）設置為中等。在三重四極桿中，每個離子對是根據優化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

1.3.3 質控（quality control，QC）樣本

QC樣本是由所有樣本提取物等量混合制備而成（mix），3 個重復。在每10 個檢測分析樣本中插入一個QC樣本，以監測分析過程的重復性。

1.4 數據處理

基于邁維（武漢）生物技術有限公司自建MWDB數據庫，根據二級譜信息進行物質定性，通過三重四極桿質譜的多反應監測模式對代謝物定量。獲得不同樣本的代謝物質譜分析數據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。利用軟件Analyst1.6.3處理質譜數據。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析對代謝物進行多元統計分析，根據正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）預測模型的穩定可靠性，同時利用多維統計變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值、單維統計值及差異倍數（fold change，FC）篩選差異代謝物。對差異顯著的代謝物進行歸一化處理，通過R軟件中的pheatmap程序對蜂糖李、空心李和脆紅李的差異代謝物進行聚類分析并繪制熱圖，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫對相應差異代謝物進行代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 3 個李品種果實初生代謝物總體分析

如圖1所示，QC樣品總離子流圖的基線穩定，其重復性好，峰分離度高。

圖1 QC樣品總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of quality control samples

表1 3 個李品種果實的初生代謝物數量統計Table 1 Statistics of primary metabolites in three varieties of plum

在3 個李品種果實中，共檢測到12 類307 種初生代謝物，如表1所示，包括74 種氨基酸及其衍生物、55 種有機酸、41 種核苷酸及其衍生物、40 種游離脂肪酸、35 種糖類、20 種溶血磷脂酰膽堿、12 種維生素、12 種醇類、10 種溶血磷脂酰乙醇胺、6 種甘油酯、1 種磷脂酰膽堿及1 種鞘脂。3 個李品種果實檢測到的共有代謝物290 種，有17 種代謝物未在3 個品種中都檢測到，分別是6 種有機酸（磷酸二乙酯、2-羥基丁酸、2-羥基肉桂酸*、乙基丙二酸、珀酸單甲酯、2-呋喃甲酸），4 種核苷酸及其衍生物（2-氨基嘌呤、環-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、2’-脫氧鳥苷、次黃嘌呤），3 種氨基酸及其衍生物（-甲基甘氨酸、-乙酰--亮氨酸、-苯乙酰甘氨酸），2 種溶血磷脂酰膽堿（溶血磷脂酰膽堿15:1、溶血磷脂酰膽堿16:2），1 種糖類（松三糖--鼠李糖苷）和1 種維生素（抗壞血酸（VC））。其中，在空心李中檢測到了特有的代謝物質環-3’,5’-腺嘌呤核苷酸，脆紅李中檢測到了溶血磷脂酰膽堿16:2，這2 種物質在蜂糖李果實內并沒有檢測到。表明不同品種李果實的初生代謝物存在差異。

空心李特有代謝物質環-3’,5’-腺嘌呤核苷酸可以作為其特征成分，是一類環狀核苷酸，在植物細胞分化和分裂的過程中起著重要的調控作用。脆紅李特有代謝成分溶血磷脂酰膽堿16:2，是溶血磷脂酰膽堿的一種，廣泛存在于人體細胞內外的一類具有多種生理功能的生物活性信號分子。其含量變化與疾病類型、疾病嚴重程度密切相關，在臨床病理研究、疾病診斷及預防等方面發揮著重要作用。

2.2 PCA結果

圖2 3 組樣品PCA得分圖（A）和相關性圖（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and correlation heatmap (B) of three sets of samples and quality control

對蜂糖李、空心李、脆紅李進行PCA，了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣品之間的變異度大小。如圖2所示，PC1和PC2的貢獻率分別為33.84%和24.88%，各組之間代謝物分離趨勢明顯，表明蜂糖李、空心李和脆紅李在代謝水平上有較大的差異。且各樣品及mix組內的Pearson相關系數均大于0.9，說明組內的重復樣本相關性極強、重復性好，可以用于后續差異代謝物分析。

2.3 OPLS-DA結果

圖3 3 個比較組OPLS-DA得分圖和驗證圖Fig. 3 OPLS-DA score plot and permutation test plot

2.4 差異代謝物篩選與鑒定

基于OPLS-DA結果，以VIP≥1、FC≥2和FC≤0.5篩選出不同比較組的差異代謝物。通過火山圖可以清晰看出代謝物在各比較組中數目及變化情況，如圖4所示，FTL_vs_CHL篩選到的差異代謝物有70 種（上調43 種、下調27 種），FTL_vs_KXL和KXL_vs_CHL分別篩選到96 種（上調84 種、下調12 種）和75 種（上調19 種、下調56 種）。

圖4 3 個比較組差異代謝物火山圖Fig. 4 Volcano map of differential metabolites among three varieties

2.4.1 蜂糖李與脆紅李差異代謝物分析

表2 FTL_vs_CHL果實中差異代謝物Table 2 Differential metabolites in Fengtang_vs_Cuihong

由表2得知，FTL_vs_CHL之間篩選到9 類70 種差異代謝物，包括26 種氨基酸及其衍生物（19種上調、7 種下調），16 種有機酸（7 種上調、9 種下調），8 種核苷酸及其衍生物（4 種上調、4 種下調），6 種糖類（2 種上調、4 種下調），4 種溶血磷脂酰膽堿上調，4 種維生素（1 種上調，3 種下調），3 種游離脂肪酸上調，2 種溶血磷脂酰乙醇胺上調，1 種甘油酯上調。結果表明：與蜂糖李相比，脆紅李中上調的物質多于下調物質，有多種氨基酸及其衍生物上調表達且相對含量增加，其次是溶血磷脂酰膽堿和游離脂肪酸。其中纈氨酸可以根據其構象分為-纈氨酸和-纈氨酸，是人體必需氨基酸之一，通常以-纈氨酸的形式在人體中存在。有研究表明-纈氨酸參與多種生理反應，影響炎癥和腫瘤的發生與轉歸。維生素中僅有吡哆醛上調表達，為VB的組成成分，而吡哆醛激酶是VB代謝的關鍵酶。相較于蜂糖李，脆紅李有多種有機酸和糖類物質表達下調且相對含量降低，可能是脆紅李果實口味酸甜適中的原因之一。

2.4.2 蜂糖李與空心李差異代謝物分析

表3 FTL_vs_KXL果實中差異代謝物Table 3 Differential metabolites in Fengtang_vs_Kongxin

如表3所示，FTL_vs_KXL篩選出差異代謝物共10 類96 種，包括21 種有機酸、18 種核苷酸及其衍生物、17 種氨基酸及其衍生物、13 種溶血磷脂酰膽堿、9 溶血磷脂酰乙醇胺、5 種維生素、5 種糖類、4 種醇類、3 種游離脂肪酸、1 種甘油酯。其中上調物質有84 種，占87.50%；下調物質12 種，占12.50%。說明與蜂糖李相比，空心李中絕大多數代謝物質相對含量增加，少數降低。糖酸含量及其配比是果實風味形成的關鍵，其中糖含量在很大程度上決定了果實的甜度，有機酸含量決定了果實酸度。有機酸在空心李果實中上調且相對含量增加，相反在蜂糖李中下調且相對含量降低，表明了蜂糖李的酸度要低于空心李。這與李剛鳳等的研究空心李酸（2.06%～3.90%），董曉慶等的研究蜂糖李的酸（0.15%～0.32%）結論相致。蜂糖李果實有機酸含量低但含有較高的糖類（如-果糖、-葡萄糖、甘露糖、-蔗糖*、葡萄糖酸葡萄糖-1-磷酸*等），具有低酸高糖的特點，所以造就成其獨特的風味因而具有較高的商品價值。空心李果實中氨基酸及其衍生物上調12 種，其含量高于蜂糖李，這與李剛鳳等研究結果相一致。

2.4.3 空心李與脆紅李差異代謝物分析

表4 KXL_vs_CHL果實中差異代謝物Table 4 Differential metabolites in Kongxin_vs_Cuihong

由表4可知，在KXL_vs_CHL比較組篩選到差異代謝物10 類75 種，包括核苷酸及其衍生物19 種、氨基酸及其衍生物17 種、有機酸14 種、血磷脂酰膽堿7 種、維生素7 種、糖類4 種、醇類4 種、溶血磷脂酰乙醇胺1 種、游離脂肪酸1 種、甘油酯1 種。結果顯示上調表達19 種，下調表達56 種，其中差異較大的是核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、有機酸3 種類別，分別占比25.33%、22.67%和18.67%。與空心李相比，核苷酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，有機酸等這類物質在脆紅李中下調表達，在空心李中上調表達。在KXL_vs_CHL的19 種核苷酸及其衍生物中，只有2 種上調，其他均下調。其中腺苷、鳥苷、腺苷-5’-單磷酸等相對含量較高。氨基酸及其衍生物下調10 種，上調7 種。氨基酸類物質的種類和含量是判斷果實營養價值的主要指標之一，與果實的營養及風味形成密切相關。張紹陽等對空心李果實營養進行分析，檢測出的15 種氨基酸中天冬氨酸含量最高，其次為丙氨酸、谷氨酸與賴氨酸，組氨酸最少，本研究結果與此一致。其中谷氨酸與天冬氨酸是鮮味氨基，甘氨酸、丙氨酸等為甜味氨基。此外谷氨酸還是腦組織生長代謝中的重要物質，參與多種生理活性物質的合成，在大腦、肌肉、肝臟等組織中發揮重要的解毒作用，還可保護肝臟。

2.5 差異代謝物通路分析

基于KEGG數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析，通過對差異代謝物進行通路富集分析有助于理解差異代謝物在代謝途徑的變化機制。如圖5A所示，FTL_vs_CHL的70 種差異代謝物共注釋到57 條代謝通路，主要分布在20 條代謝途徑中，前5 條富集代謝物數量多且顯著差異的代謝通路（＜0.05）分別為代謝通路、氨酰-tRNA生物合成通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路和賴氨酸降解通路，富集到的差異代謝物主要為氨基酸及其衍生物、有機酸、核苷酸及其衍生物。其中有6 種氨基酸及其衍生物、2 種有機酸參與了多個代謝途徑。在顯著差異的5 條代謝通路中硫代葡萄糖苷的生物合成途徑最為顯著（值最小），參與硫代葡萄糖苷的生物合成通路有6 個差異代謝物，分別是-纈氨酸、-異亮氨酸*、-亮氨酸*、-甲硫氨酸、-酪氨酸、-色氨酸。其中-色氨酸是營養中重要的氨基酸，人體內自身不能合成需要從外界攝取，-酪氨酸是多種重要的次級代謝物的通用前體，可以用作帕金森氏病藥物左旋多巴的合成。

FTL_vs_KXL的96 種差異代謝物共注釋到53 條代謝通路，如圖5B所示，前5 條代謝通路富集差異代謝物數多且較顯著的為代謝通路、嘌呤代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路和色氨酸代謝通路，富集到的差異代謝物主要包括核苷酸及其衍生物、有機酸、氨基酸及其衍生物和維生素。其中有12 種核苷酸及其衍生物、6 種有機酸和4 種氨基酸及其衍生物參與多個代謝途徑。顯著差異通路有1 條為色氨酸代謝通路（＜0.05）。參與色氨酸代謝通路的有3 個差異代謝物，分別是-色氨酸、5-羥基--色氨酸、2-吡啶甲酸。其中2-吡啶甲酸是一種重要的吡啶類化合物，廣泛用于農藥、醫藥、以及日用化學品的生產。

KXL_vs_CHL的75 種差異代謝物注釋到52 條代謝通路，如圖5C所示，前5 條代謝通路富集差異代謝物數量多且顯著的為代謝通路、ABC轉運蛋白、2-氧羧酸代謝通路、嘌呤代謝通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路，富集到的差異代謝物主要包括核苷酸及其衍生物、有機酸、維生素、氨基酸及其衍生物。其中有10 種核苷酸及其衍生物、1 種有機酸，1 種維生素及5 種氨基酸及其衍生物參與了多個代謝途徑。顯著差異通路2 條（＜0.05）：嘌呤代謝通路和硫代葡萄糖苷的生物合成通路，其中嘌呤代謝通路最為顯著（值最小），參與嘌呤代謝通路有10 個差異代謝物，分別是次黃嘌呤、鳥嘌呤、2’-脫氧腺苷、腺苷、2’-脫氧鳥苷、鳥苷、環-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、腺苷-5’-單磷酸、5’-肌苷酸、鳥苷-5’-單磷酸，都為核苷酸及其衍生物，其中嘌呤是一種生物堿，主要以嘌呤核苷酸的形式存在，可分為鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤等，廣泛參與人體的各種生命活動。

以上分析表明，3 組比較組之間有多條代謝通路一致，部分代謝物參與多個代謝途徑。

圖5 3 個比較組差異代謝物KEGG富集圖Fig. 5 KEGG enrichment map of different metabolites among three varieties

3 結 論

3 個李品種果實共檢測出12 類307 種初生代謝物，FTL_vs_CHL和FTL_vs_KXL的差異代謝物分別為70 種和96 種，且主要以上調為主；KXL_vs_CHL的差異代謝物有75 種，以下調為主。值小于0.05的顯著差異代謝途徑FTL_vs_CHL有5 條，分別為代謝通路、氨基酰-tRNA生物合成通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路和賴氨酸降解通路，FTL_vs_KXL僅有1 條色氨酸代謝通路，KXL_vs_CHL有2 條分別是嘌呤代謝通路和硫代葡萄糖苷的生物合成通路。

本研究成功鑒定出空心李（環-3’,5’-腺嘌呤核苷酸）和脆紅李（溶血磷脂酰膽堿16:2）的特征成分。利用UPLC-MS/MS技術對蜂糖李、空心李和脆紅李的初生代謝物進行分析，所檢測到的物質可為李果實的功能研究及下一步開發利用提供參考，也為李果實優良品種選育和功能保健食品的開發提供理論依據，具有廣闊的開發利用前景。