不同處理方法對蛋清蛋白免疫原性及結構的影響

王 晨，馬艷秋，張梓湘，張龍媛，遲玉杰,*，遲 媛

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學工程學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國雞蛋產量位居于世界第一，雞蛋營養豐富、價格低廉，是人們日常生活中主要的蛋白質來源之一，由于其高營養價值和優良的功能特性而被廣泛應用于食品工業中。但雞蛋也是引起人體過敏最常見的食物之一，其致敏對象主要以嬰幼兒和兒童為主。雞蛋所致過敏主要是蛋清中蛋白引起的，其中最主要的4 種過敏原分別是卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉鐵蛋白和溶菌酶。隨著雞蛋產量的增加和應用范圍的擴大，雞蛋過敏人群數量也隨之增加。因此，探究改性方法降低雞蛋致敏性對開發低致敏性產品具有一定的實際意義。

目前，解決雞蛋過敏問題常采用單一的物理法和化學法，熱加工、酶解及高壓等是主要的食物脫敏方法。其中，酶解法是最為有效的降低食物致敏性的方法之一，具有條件溫和、高效及特異性強等特點。Kasera等采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解3 種豆科植物，結果表明酶水解可有效地降低豆類蛋白質的致敏性，并可用于制備低過敏性食物提取物。王艷等利用不同蛋白酶水解蛋清蛋白，其中堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶水解能有效地降低蛋清蛋白的致敏性。微波是一種新興的降低食物致敏性技術，其具有高效、節能及操作簡便等優勢，已被廣泛應用于干燥和殺菌等加工領域。近年來，有學者研究利用微波和微波輔助酶水解降低食物致敏性，董曉穎等采用微波處理蝦過敏蛋白，通過間接酶聯免疫吸附測試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測定抗原性變化，結果顯示微波處理降低了蛋白致敏性；Izquierdo等采用微波和酶聯合處理牛乳清蛋白，結果顯示，酶與微波處理相結合能更有效地降低乳清蛋白免疫原性；Ketnawa等研究發現微波處理后的魚骨蛋白水解產物抗原性均顯著降低。綜上，微波和酶解處理可改變食物過敏蛋白的免疫原性。目前，國內外對降低蛋白致敏性技術的研究主要集中于單一的處理方式，對復合處理手段的研究相對較少，并且對蛋清蛋白致敏性和結構特性變化關系的研究較少。本團隊前期研究采用高壓微射流降低蛋清蛋白的致敏性并得到較理想的效果，故在對蛋清蛋白采用單一方法改性的基礎上，本研究采用微波、酶解、微波協同酶解處理蛋清蛋白，通過ELISA法對蛋白免疫原性變化進行探究，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、傅里葉變換紅外光譜、內源熒光光譜、外源熒光光譜及紫外光譜等方法對不同處理前后蛋清蛋白樣品結構進行表征，從而探究不同處理方法對蛋清蛋白免疫原性及結構性質的影響，為開展后續研究工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋采購于哈爾濱市好又多超市，4 ℃冷藏備用。

堿性蛋白酶（2×10U/g）、菠蘿蛋白酶（1.2×10U/g）、木瓜蛋白酶（6×10U/g）、中性蛋白酶（2×10U/g）、胰蛋白酶（250 NFU/mg） 南寧東恒華道生物科技有限責任公司；ELISA試劑盒 美國BioFront Technologies公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍G-250染液等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JJ-1精密增力電動攪拌機 上海浦東物理化學儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；多功能酶標儀 鄭州美生商貿有限公司；RF-6000型熒光分光光度計 日本島津制作所；傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清液的制備及處理

市售的新鮮雞蛋經清洗后打蛋，分離出蛋清，用鑷子挑出系帶，用電動攪拌機在300 r/min下攪拌2 h，然后用紗布過濾多余雜質，得到新鮮蛋清液，置于4 ℃貯存備用。

1.3.2 微波處理

將蛋清用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 8.0）進行1∶1稀釋，再進行微波處理，當微波功率為700 W時，微波時間分別為10、15、20、30、40 s；當微波時間為30 s時，微波功率分別為70、280、420、560、700 W。

1.3.3 酶解處理

將已處理的蛋清用PBS進行1∶1稀釋，分別在各蛋白酶最適反應溫度與最適反應pH值（表1）下進行水解。分別加入0.6%（以體系質量計，后同）的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶，于水浴振蕩器中振蕩反應30 min，滅酶10 min；加入堿性蛋白酶，酶添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，于水浴振蕩器中振蕩反應30 min，滅酶10 min。

表1 各蛋白酶的最適反應溫度及反應pH值Table 1 Optimum temperature and pH for proteases tested in this study

1.3.4 微波協同酶解處理

選取微波處理700 W/20 s后的蛋清進行酶解處理，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的堿性蛋白酶，反應30 min，滅酶10 min。

1.3.5 酶聯免疫吸附測試

參照聶君等的方法，選用ELISA法分析蛋清蛋白免疫原性。取0.5 mL上述不同條件處理后的蛋清蛋白樣品，加入9.5 mL稀釋后的ELISA試劑盒抽提緩沖液（使用前預熱至60 ℃），在60 ℃下提取10 min。室溫下離心10 min，過濾。吸取200 μL樣品到96 孔板中孵育10 min，洗滌3 次，每孔中加入100 μL抗體/辣根過氧化物酶底物，孵育后洗滌，最后加入100 μL ELISA試劑盒終止液，在450 nm波長處測其吸光度。具體方法操作參考ELISA試劑盒說明書。根據原始吸光度繪制標準曲線，經軟件分析得到未處理蛋清蛋白質量濃度為/（μg/mL），處理后蛋清蛋白質量濃度為/（μg/mL）。按下式計算經不同條件處理后蛋清蛋白免疫原性降低率。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋清蛋白樣品用pH 8.0的PBS稀釋至1 mg/mL，與上樣緩沖液按體積比3∶1混合后加熱煮沸5 min，然后1 500 r/min離心3 min。樣品上樣量為10 μL，先80 V電泳1 h后，將電壓調至120 V，直到電泳結束。用考馬斯亮藍G250對凝膠進行染色，然后脫色直到清晰條帶出現。拍攝凝膠并觀察蛋清體系中蛋白質分子質量的變化。

1.3.7 內源性熒光光譜分析

將蛋清蛋白樣品用pH 8.0的PBS稀釋至0.1 mg/mL，在激發波長280 nm，發射波長300～420 nm條件下進行光譜掃描，并記錄最大發射波長的熒光強度。

1.3.8 紫外光譜分析

將不同條件處理前后的蛋清蛋白樣品用pH 8.0的PBS稀釋至2 mg/mL，設置掃描波長為240～400 nm，掃描速率100 nm/min，帶寬為5.0 nm，間隔為1.0 nm，響應時間為0.2 s，光徑為1 cm。重復掃描3 次，累加得到紫外掃描光譜圖。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜分析

取適量蛋清蛋白樣品置于衰減全反射附件上，使用OMNIC軟件，在4 000～400 cm范圍內進行全波段掃描，掃描分辨率為4 cm，并通過扣除水背景進行基線校準。基于二階傅里葉變換紅外光譜，使用Peakfit 4.12軟件定量計算蛋白的二級結構。

1.3.10 外源性熒光光譜

選用熒光探針法測定蛋清蛋白的表面疏水性，用pH 8.0的PBS調整蛋白質量濃度，使其質量濃度梯度為0.25～2.00 mg/mL，取4 mL樣液加入20 μL 8 mmol/L的ANS試劑混勻，在室溫條件下避光反應15 min，隨后設置外源性熒光光譜儀參數：激發波長390 nm、發射波長470 nm、狹縫5 nm，測定樣品相對熒光強度，以相對熒光強度為縱坐標、蛋白質量濃度為橫坐標作圖，以曲線斜率表示樣品的表面疏水性（）。

1.4 數據處理與分析

運用Microsoft Excel 2019軟件對數據進行統計分析，實驗中所有結果均是3 次測定的平均值。采用OriginPro 9.0軟件對傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜等圖譜結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 微波處理對蛋清蛋白免疫原性的影響

由圖1可知，與未經微波處理的蛋清蛋白樣品比較，微波處理后樣品的吸光度均有一定程度的降低，表明微波處理后的蛋清蛋白免疫原性有所降低，且蛋清蛋白樣品的免疫原性與微波功率呈負相關，當微波功率達到700 W時，其免疫原性降低最明顯，表明在該處理條件下對蛋清蛋白的免疫原性影響最大。究其原因是微波的熱效應迫使蛋清蛋白分子發生折疊，隱藏了部分免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G的結合表位，使其免疫原性降低，隨著微波功率進一步增加，蛋白分子可能發生了分子內或分子間的聚集，導致部分IgG的結合表位被更多地隱藏或破壞，免疫原性進一步降低。由圖2可知，當微波功率一定時，蛋清蛋白免疫原性降低率隨著處理時間的延長呈先上升后下降趨勢，這可能是隨著微波時間的延長，蛋清蛋白空間伸展，暴露出部分表位，但數量遠少于被隱藏的表位，所以其免疫原性整體仍呈降低趨勢。微波處理條件為700 W/20 s的蛋清蛋白樣品免疫原性降低率最高，降低了50.81%。這與陳紅兵等的研究結果一致，其研究證實了微波處理可以一定程度降低蛋清蛋白潛在的致敏性，并且所有條件下處理后的蛋清樣品結構均發生改變。Lamacchia等的研究也表明小麥籽粒經微波處理后，其抗原性明顯降低。

圖1 不同微波功率處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 1 Effects of microwave power on immunogenicity of egg white protein

圖2 不同微波時間處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 2 Effects of microwave time on immunogenicity of egg white protein

2.2 酶解處理對蛋清蛋白免疫原性的影響

酶水解會降低食物蛋白質的部分過敏原表位數量，從而達到降低其致敏性的效果，其中蛋白酶的添加量和種類等是影響蛋白質致敏性的主要因素。由圖3可以看出，不同蛋白酶酶解處理的蛋清蛋白樣品免疫原性都有一定程度的降低。其中菠蘿蛋白酶酶解后，蛋清蛋白免疫原性殘留量最低，最終免疫原性降低了61.22%。其次是堿性蛋白酶，降低了約55.83%。由于每種蛋白酶的作用位點不同，對蛋清過敏蛋白的水解能力不同，因此蛋清蛋白經處理后得到的免疫原性降低率各不相同。王艷等的研究也指出不同酶水解蛋清蛋白后，蛋清蛋白致敏性均降低，其中堿性蛋白酶處理后抗原性降低最明顯。實驗結果顯示采用堿性蛋白酶酶解得到的蛋清蛋白免疫原性降低率僅略低于菠蘿蛋白酶，但考慮到蛋清pH值呈堿性，堿性蛋白酶最適pH值為8.0，因此選擇堿性蛋白酶進行后續實驗。由圖4可知，隨著堿性蛋白酶添加量的增加，蛋清蛋白免疫原性呈降低的趨勢，當蛋白酶添加量到0.8%及以上時，免疫原性的變化趨于平緩。由于酶解改變了過敏原的構象表位，一般情況下構象表位在水解開始后就會被迅速破壞。而隨著酶添加量的增加，蛋白質被水解的程度也逐漸增大，堿性蛋白酶更多地作用在抗原表位上，從而達到降低免疫原性的效果。綜上所述，酶水解能有效地降低蛋清蛋白免疫原性，但其免疫原性仍然存在，因此后續的研究可對蛋清樣品采用物理法協同酶水解處理，來進一步降低蛋清蛋白的免疫原性。

圖3 不同酶種類處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 3 Effects of different proteases on immunogenicity of egg white protein

圖4 不同酶添加量處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 4 Effects of enzymatic hydrolysis with different enzyme dosages on immunogenicity of egg white protein

2.3 微波協同酶解處理對蛋清蛋白免疫原性的影響

固定微波條件為700 W/20 s，以堿性蛋白酶添加量為變量進行實驗，如圖5所示，隨著蛋白酶添加量的增加，蛋清蛋白免疫原性降低率整體呈上升趨勢，當蛋白酶的添加量為0.8%時，蛋清蛋白樣品的免疫原性下降程度最高，降低了67.48%。與未處理和單獨堿性蛋白酶處理的樣品相比，通過微波和堿性蛋白酶結合處理所得到的樣品免疫原性降低更明顯，這是由于微波加快了蛋白酶水解蛋白的速率，微波處理下形成的折疊蛋白可以作為蛋白酶作用的理想底物，使一些表位更容易被酶水解，進而減少部分過敏原表位數量。隨著蛋白酶添加量進一步增加，蛋白水解的程度增大，蛋白酶更多地作用在抗原表位上，使免疫原性繼續降低。綜上，酶解和微波聯合處理有助于降低蛋清蛋白的免疫原性，且保留了酶活性和蛋白質結構修飾的可逆熱變性，對于降低蛋白質的免疫反應性可能具有實際意義。也有研究報道了與未處理的樣品和單獨的酶處理樣品相比，通過微波與鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶聯合處理獲得的乳清蛋白水解物免疫反應性顯著降低，證明微波輔助酶解處理有助于降低蛋白水解產物的抗原性。

圖5 不同微波協同酶解處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 5 Effects of microwave-assisted enzymatic hydrolysis with different enzyme dosages on immunogenicity of egg white protein

2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果

卵白蛋白分子質量主要分布在44 kDa處，卵轉鐵蛋白的分子質量約為76 kDa，卵類黏蛋白的分子質量約為28 kDa，溶菌酶的分子質量約為14.3 kDa。如圖6所示，與未處理蛋清蛋白樣品相比，微波處理后的蛋清蛋白樣品條帶灰度輕微變淺，表明蛋清蛋白質量濃度發生了一定程度的降低，這是微波處理使部分蛋清蛋白變性所致，該結果與文獻[17]的研究結果一致。從堿性蛋白酶處理蛋清蛋白結果可以看出，目標條帶與未處理蛋清蛋白條帶相比灰度變得較淺，在14.4～45.0 kDa之間出現一些新條帶，說明蛋清蛋白經堿性蛋白酶作用后部分被水解為蛋白片段。而經酶解和微波協同酶解處理的樣品在電泳圖上呈現出較為一致的結果，卵轉鐵蛋白條帶幾乎完全消失，說明卵轉鐵蛋白不穩定，易發生聚集。與單一酶解處理相比，微波處理下蛋白質降解反應發生得更快。電泳只能從一個側面反映出過敏蛋白分子的水解效果，并不能反映抗原性的具體變化，因此采用傅里葉紅外變換光譜和熒光光譜等對蛋清蛋白的結構變化進一步研究。

圖6 不同處理前后蛋清蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 6 SDS-PAGE patterns of egg white protein subjected to different treatments

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析結果

通過紅外光譜可進一步分析蛋清蛋白質的結構變化規律。紅外圖譜主要有幾組特征吸收譜帶，分別為酰胺I帶（1 600～1 700 cm）和酰胺II帶（1 530～1 550 cm）。其中，酰胺I帶主要反映C＝O伸縮振動，最常用于分析蛋白質的二級結構；酰胺II帶反映了N—H變形振動或C—N伸縮振動；在3 200～3 400 cm的吸收峰反映了O—H和N—H的伸縮振動。由圖7可知，不同方法處理蛋清蛋白的紅外光譜都有所差異。4 種樣品都在酰胺I帶出現了特征吸收現象，而O—H或N—H與C＝O之間形成的氫鍵比O—H自身形成的氫鍵所引起的特征現象更明顯。未處理的蛋清蛋白在酰胺I帶的吸收峰在1 656.26 cm處，經微波和酶解處理的蛋清蛋白分別遷移到1 656.86 cm和1 656.58 cm處，酰胺基譜帶的變化說明微波與酶解條件對蛋清蛋白的二級結構造成了影響，其中微波協同酶解處理使-折疊數量減少的程度更大。經過協同處理后，蛋清蛋白的酰胺基吸收峰遷移到1 655.91 cm處，向短波數移動，表明協同處理使N—H與C＝O形成的氫鍵總量增加。未處理蛋清蛋白的N—H伸縮振動峰在1 541.15 cm處，微波、酶解和微波協同酶解處理后，N—H伸縮振動峰分別遷移至1 540.43、1 540.35 cm和1 541.08 cm，峰強度也有不同程度的增加。這是分子間或分子內的氫鍵締合作用產生氫鍵，使N—H和O—H的鍵常數減小，相應基團的振動偶極矩變化增大，導致結構的變化。不同處理樣品在3 300 cm附近的峰發生了不同程度的遷移，主要是蛋白質分子中N—H伸縮振動與氫鍵形成了締合體，蛋清蛋白的二級結構中-螺旋或無規卷曲相對含量提高的緣故。

圖7 不同處理條件下蛋清蛋白的紅外光譜Fig. 7 Infrared spectra of egg white under different treatment conditions

根據研究報道，蛋白質的二級結構與紅外光譜各子峰存在對應關系，即-螺旋結構對應波數范圍為1 650～1 659 cm，-折疊結構對應波數范圍為1 610～1 639 cm，-轉角結構對應波數范圍為1 660～1 700 cm，無規卷曲結構對應的波數范圍為1 640～1 649 cm，據此計算出的各二級結構相對含量，如表2所示。未處理的蛋清蛋白樣品，-螺旋相對含量為22.30%，-折疊相對含量為27.23%，-轉角相對含量為28.08%，無規卷曲相對含量為22.40%。與未處理蛋清蛋白相比，700 W微波處理20 s蛋清蛋白樣品-螺旋、-折疊和無規卷曲相對含量均有所增加，-轉角相對含量降低，表明蛋白質分子間的相互作用會導致蛋白結構的改變，在蛋白質受微波作用變性時，由于疏水殘基的暴露導致部分展開分子間相互交聯，從而形成-折疊結構。對于酶解和微波協同酶解處理的樣品，其蛋白質中各二級結構相對含量均發生變化，-螺旋和無規卷曲結構相對含量均有所增加，而-折疊和-轉角結構相對含量相應降低。這是由于酶解與協同處理都使蛋清蛋白二級結構的螺旋結構展開，蛋白分子結構得到伸展，從而導致隱藏在蛋白分子內部的抗原表位暴露在分子表面，進而降低了其免疫原性，這與Golias等研究結果基本一致。綜上，不同方法處理蛋清樣品吸收峰峰位因處理條件的不同會發生不同程度的變化，蛋清蛋白的二級結構被破壞，蛋白分子中官能團所構成的-螺旋、-折疊和-轉角含量也會發生變化，它們之間在不同作用下相互轉化或者轉化為無規卷曲。

表2 不同處理對蛋清蛋白二級結構相對含量的影響Table 2 Effects of different treatments on the secondary structure content of egg white protein

2.6 內源性熒光光譜分析結果

激發的蛋白內源熒光光譜可以反映是否存在色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸，主要以色氨酸為蛋白質構象變化的反映指標，探究蛋白質三級結構的變化。不同方法改性前后蛋清蛋白樣品的內源熒光光譜如圖8所示，相比于未處理蛋清蛋白，酶解處理后的蛋清蛋白具有更高的熒光強度，主要是因為在堿性蛋白酶的作用下，掩埋在分子內部的疏水區域被破壞，使色氨酸基團暴露于溶劑中。并且酶解后的蛋清蛋白最大波長發生了輕微的紅移，表明蛋白構象被破壞，更多的色氨酸從蛋白質分子內部非極性環境中逐漸暴露出來。酶解改變了蛋清蛋白的三級結構，使過敏原失去原有的活性從而導致蛋白免疫原性降低。微波處理蛋清蛋白樣品的內源熒光強度低于未處理樣品，是因為蛋白質發生了折疊，部分生色基團被破壞或者掩埋，蛋白因相互聚集掩蓋了過敏反應的反應位點，引起免疫原性的改變。微波協同酶解處理樣品內源熒光強度高于單一微波處理樣品，但低于未處理與單一酶解處理的樣品，蛋清蛋白樣品并沒有發生明顯的變化，主要是微波的熱效應使蛋白質聚集，酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸殘基被包埋于分子內部，而后隨著酶解處理，蛋白質分子先伸展從而暴露出部分生色基團，或者是蛋白質分子之間產生了交聯，表面形成了新的生色基團而導致熒光強度的增大，但新形成的生色基團數量遠少于最初被包埋的基團，所以總體上生色基團數量仍減少，致使熒光強度低于未處理的樣品。微波促進酶水解的同時也加快了過敏原構象表位的變化，使其免疫原性降低更明顯。

圖8 不同處理前后蛋清蛋白內源性熒光光譜Fig. 8 Fluorescence spectra of egg white protein under different treatment conditions

2.7 紫外光譜分析結果

蛋白質產生的紫外吸收光譜主要是由色氨酸和酪氨酸殘基側鏈對紫外光的吸收所形成，氨基酸殘基的微環境由蛋白分子的構象決定，一旦蛋白分子的構象改變，所處的微環境發生改變，生色基團的紫外吸收光譜隨之發生改變。如圖9所示，蛋清蛋白樣品經過不同方法處理后，紫外吸光度均發生變化，表明蛋白分子構象發生了變化，抗原的構象表位遭到破壞，故蛋白的免疫原性降低。相比于未處理的蛋清蛋白樣品，微波處理蛋清蛋白樣品的紫外吸光度降低，這是由于蛋白分子發生聚集，芳香族氨基酸殘基被掩藏于蛋白分子內部，不能發揮其顯色作用。經酶解及微波協同酶解處理樣品的吸光度較未處理樣品均出現一定程度的增加，表明酶解使蛋白質的空間結構展開，色氨酸和酪氨酸殘基暴露于分子表面，導致其紫外吸光度升高。復合處理的樣品先是在微波條件下蛋白質分子發生聚集，隨著酶解的進行，蛋白結構展開，疏水基團暴露出來，使其紫外吸光度升高，總體芳香族氨基酸殘基暴露量低于單一酶解改性樣品，故紫外吸光度低于酶水解處理的樣品。Ai Minmin等研究采用不同蛋白酶水解皮蛋清凝膠，結果表明蛋清酶解產物的紫外吸光度均發生了不同程度的增加，說明酶水解改變了蛋白結構。

圖9 不同處理條件下蛋清蛋白紫外吸收光譜Fig. 9 UV absorption spectra of egg white protein under different treatment conditions

2.8 表面疏水性分析結果

疏水相互作用是維持蛋白質三級結構的主要作用力，ANS與蛋白質結合的熒光強度與蛋白的表面疏水性呈正相關，利用外源性熒光光譜對不同方法處理蛋清蛋白樣品的疏水性進行分析，如圖10所示，酶解、微波和微波協同酶解處理蛋清蛋白樣品的表面疏水性均比未處理樣品高，且經過微波協同酶解處理的樣品表面疏水性最高，這可能是堿性蛋白酶的作用使包埋在蛋白內部的疏水基團暴露，從而導致表面疏水性的增加。也可能是水解使蛋白結構部分展開，導致掩埋在蛋白質中的疏水位點暴露。微波700 W處理20 s的蛋清蛋白樣品由于蛋白質分子相互作用，從而使蛋白質內部疏水基團暴露在表面，增加了與ANS的結合位點數量。在此過程中，蛋清蛋白的抗原表位由此被破壞或在聚合變性時被隱藏，從而不能與結合位點結合，使其免疫原性降低。復合處理后蛋清蛋白的表面疏水性最高，微波破壞了蛋白質的空間結構，進而促使蛋白酶更容易作用于蛋白質，導致其表面疏水性增加，免疫原性進一步降低，這與常慧敏的研究結果一致。郭榮佳利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白，結果表明酶解處理大豆分離蛋白表面疏水性整體均高于未處理大豆分離蛋白。Zang Xiaodan等研究發現經胰蛋白酶水解后米糠蛋白疏水性增加，這歸因于蛋白質結構的展開和疏水基團的暴露。

圖10 不同處理條件下蛋清蛋白的表面疏水性Fig. 10 Surface hydrophobicity of egg white protein under different treatment conditions

3 結 論

微波、酶解和微波協同酶解處理對蛋清蛋白免疫原性均有不同程度的影響。微波處理可降低蛋清蛋白免疫原性，當微波700 W處理20 s時，蛋白免疫原性降低率最高（50.81%）。此條件下蛋白質分子發生聚集，部分生色基團和芳香族氨基酸殘基被包埋，分子相互作用使內部疏水基團暴露，一定程度修飾了過敏表位，導致免疫原性降低。不同蛋白酶水解后，蛋清蛋白免疫原性均降低，其中堿性蛋白酶水解后免疫原性降低了55.83%。隨著酶添加量的增加，其免疫原性降低率逐漸增加。酶水解使蛋清蛋白分子空間結構展開，疏水基團和芳香族殘基暴露，改變了蛋白的三級結構，使高級結構中的化學鍵斷裂，過敏原失去活性引起免疫原性的降低。經微波協同酶解處理后，蛋清蛋白的免疫原性隨著酶添加量的增加進一步下降。經協同處理后的SDS-PAGE條帶發生變化，-螺旋結構相對含量有所增加，而-折疊結構相對含量相應降低，疏水基團逐漸暴露，說明微波協同酶解處理導致蛋清蛋白的二、三級結構發生改變，據此可知，蛋清蛋白的免疫原性隨著其構象的改變而改變，通過破壞蛋白的構象及抗原表位能夠使其免疫原性降低。綜上所述，微波和酶解處理對降低蛋清蛋白免疫原性具有協同作用，但蛋清蛋白結構與免疫原性變化的具體原因還有待進一步研究。