LED藍光處理對小麥粉的減菌效果及其品質的影響

王子元，李婉怡，馬子楚，趙 萌，王靜涵，張 敏

（北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

小麥粉作為一種重要的加工原料粉，其需求量大，是全球最重要的主食原料粉之一。然而小麥粉的品質易受到外界環境影響，如種植區域、氣候狀況、儲存條件等；且小麥粉在儲藏過程中暴露在空氣中，由于其組織松軟、無外殼保護，易受微生物污染，導致微生物超標，造成糧食損失。其中霉菌污染會造成小麥粉霉變，使其品質下降，甚至會產生真菌毒素，危害食用者的身體健康；而其他病原性細菌可引起食源性感染和食物中毒。Berghofer等研究發現澳大利亞小麥粉中的微生物主要包括芽孢菌群、大腸菌群、霉菌和酵母等。吳國鋒研究表明我國小麥主產區小麥粉的微生物污染狀況與Berghofer等的研究結果相似；其中，小麥粉中大腸菌群典型數值為2（lg（CFU/g）），芽孢菌群典型數值為3（lg（CFU/g）），大腸菌群檢出率高達100%，蠟樣芽孢桿菌檢出率為94.35%。曾朝珍等研究了小麥粉生產過程中微生物的變化規律，結果表明在小麥粉的生產過程中蠟樣芽孢桿菌含量均高于1（lg（CFU/g））。郭禎祥等對小麥粉生產過程中微生物污染關鍵點進行了研究，結果發現在小麥粉中的大腸桿菌含量均高于2（lg（CFU/g））。李彪、譚靜等調查分析了微生物對小麥及其加工品的污染情況，結果發現小麥粉中的細菌多為桿菌，且革蘭氏陽性桿菌中有芽孢的占比較多。我國規定小麥粉中致病菌以蠟樣芽孢桿菌（）、大腸桿菌（）等作為參考菌群，其含量超標均可造成食品安全隱患。

現有應用于小麥粉的減菌處理技術主要包括微波處理、臭氧處理、電子束輻照、紫外輻照處理等。然而微波容易受熱不均，造成部分小麥粉因過度加熱而糊化，影響原料品質；且微波的熱效應可引起一系列不可控的化學反應，導致蛋白質變性、非酶褐變、維生素和營養成分的損失。臭氧氣調處理技術是利用臭氧的強氧化性達到殺菌目的，但過量的臭氧會影響食品風味，造成食品氧化，且成本相對較高。紫外輻照雖然是一種常見的滅菌方式，但存在不安全因素，可造成人體皮膚損傷。

LED光照處理是一種新興的非熱減菌技術，近年來受到越來越多的關注。LED處理采用半導體技術，利用半導體形成特定波長的光，其不需要預熱、散發熱量少并且能夠保持光照強度不變。此外，LED所需電壓較低，具有壽命長、節能、高效、耐久性高、環保等優點，同時易于與現有的處理技術相結合，因此LED處理技術是極具應用潛力的殺菌技術。LED冷處理技術已被報道應用于不同食品中食源性病原體的滅活，然而鮮有將LED光照處理應用于小麥減菌并研究其對小麥品質影響的報道。因此，本研究選取小麥粉中檢出率較高的革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）和革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌），研究LED藍光處理技術對不同筋度小麥粉的滅菌效果，同時研究其對小麥粉理化性質的影響。研究結果將為提高食品安全、解決由于小麥粉微生物污染而導致的面制食品安全問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金沙河高筋小麥粉、中筋小麥粉、低筋小麥粉（蛋白質量分數分別為12.2%、12.2%、8.8%）購買于京東商城；不加碘食鹽購于當地零售超市。

蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌由本實驗室保存。

LB營養瓊脂、0.1%蛋白胨水、磷酸鹽緩沖液、無水乙醇均購于北京半夏科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

JA21001電子天平 上海菁海儀器有限公司；GR85DF高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；DHP-9162恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；BCL-1360A超凈工作臺 北京亞太克隆儀器技術有限公司；Infinite M200酶標儀 帝肯（上海）貿易有限公司；SU8220掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將凍存于-80 ℃的菌液接種于100 mL新鮮LB液體培養基中，將其置于搖床（37 ℃）上培養12～14 h，然后劃線接種于LB平板上，37 ℃恒溫培養24 h得到單菌落。挑取單菌落于LB液體培養基中，37 ℃培養12 h。培養后的菌液離心（5 000 r/min、10 min、4 ℃）并棄去上清液，用無菌磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）使菌體復懸，制得菌懸液。

1.3.2 小麥粉接種

參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》測定小麥粉中的初始菌落數。

將2 mL含不同菌落數的大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌菌懸液分別加入裝有10 g小麥粉的無菌聚乙烯取樣袋中，用手按壓3 min，然后將接種的小麥粉于室溫下（25℃）風干2 h，混勻。隨機選取3 個1 g樣品，按照GB 4789.2—2016方法測定小麥粉中菌落數，小麥粉中接種菌落數最終分別約為6 （lg（CFU/g））（高接菌量）和3（lg（CFU/g））（低接菌量）。

1.3.3 LED光照處理

在室溫下（25 ℃）將接種后的小麥粉置于無菌培養皿中，培養皿置于LED藍光燈（波長為430～470 nm，功率為36 W，光照面積為706.5 cm，光功率密度為50.955 mW/cm）正下方15 cm處，小麥粉厚度為0.5 cm，分別光照處理1、2、3、4、5 h，設置光照0 h為對照組。每小時取1 g小麥粉放入無菌均質袋中，并加入9 mL質量分數0.1%蛋白胨溶液，均質機拍打3 min，制成勻漿。使用無菌磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）對勻漿進行梯度稀釋，涂布于LB平板，每個稀釋梯度做兩個平行，37 ℃恒溫培養24 h后記錄平板菌落數，以此來確定LED藍光光照對小麥粉中微生物的影響。再以相同的LED光照處理條件處理未接種的小麥粉，按相應的方法測定小麥粉的理化指標。

1.3.4 小麥粉理化指標測定

1.3.4.1 水分質量分數

水分質量分數參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》進行測定。

1.3.4.2 水分狀態測定

將LED藍光處理不同時間和在自然環境下放置不同時間的小麥粉放置在直徑1.50 cm 的核磁專用測試管中，選擇CPMG序列掃描測定面條的橫向弛豫時間。參數設置：采樣頻率為200 kHz，等待時間為1 000 ms，回波個數為1 000，回波時間為0.125 ms，累加次數為32，測定結束后進行反演并導出數據，每個樣品測定3 次，取平均值。

1.3.4.3 色澤測定

選取LED光照處理不同時間和在自然環境下放置不同時間的小麥粉，采用色差儀測定樣品的值（亮度）、值（紅綠度）、*值（黃藍度）。每個樣品重復測定5 次，除去最大值和最小值，取平均值。數據采自3 次獨立重復的平行實驗。

1.3.4.4 濕面筋質量分數測定

參照GB/T 5506.1—2008《小麥和小麥粉 面筋含量》測定濕面筋質量分數。

1.3.4.5 蛋白質聚合體測定

采用質量分數12%分離膠及5%濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）實驗。取不同處理組小麥粉樣品20 mg分別加入1 mL 0.01 mol/L Tris-HCl提取緩沖液（pH 6.8，包括10 g/100 mL SDS、10%（體積分數，下同）甘油、0.1 g/100 mL溴酚藍）中。將樣品在100 ℃沸水中煮5 min，然后8 000×離心5 min。取15 μL各樣品上清液注入上樣孔槽中，在100 V下進行電泳。當染料前沿電泳至離橡膠框底邊約1 cm時，停止電泳。用0.2%考馬斯亮藍R250（溶劑含25%甲醇和10%乙酸）染色30 min后用脫色液（含40%甲醇和10%乙酸）脫色。用FUSIONN FX凝膠成像系統進行拍照，保存圖像。

1.3.4.6 微觀結構測定

采用掃描電子顯微鏡對不同處理組小麥粉顆粒形態進行觀察。取干燥后的少量不同處理組小麥粉樣品均勻灑落在含有導電雙面膠的金屬圓盤上，真空條件下進行鍍金處理，再將圓盤放入掃描電子顯微鏡下放大2 000 倍觀察，選擇視野清晰且有代表性的樣品顆粒并拍照。

1.4 數據處理與分析

數據采用SPSS 19.0軟件進行處理與分析，選擇Duncan檢驗在＜0.05水平上對數據進行顯著性分析，作圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 LED藍光處理對小麥粉中大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的減菌效果

由圖1A可知，不同LED藍光光照時間（1～5 h）處理初始菌落數約為6（lg（CFU/g））的高筋、中筋和低筋小麥粉均能達到顯著抑菌效果，且光照時間越長，抑菌效果越好。光照時間達到5 h時，高接菌量的小麥粉中大腸桿菌菌落數由6.1（lg（CFU/g））減少到約1.2（lg（CFU/g）），減少了約4.9（lg（CFU/g））。相同光照處理時間的不同筋度小麥粉之間的顯著性分析結果顯示，小麥粉的筋度不會影響LED藍光對大腸桿菌的抑菌效果。由圖1B可知，對初始菌落數約為3（lg（CFU/g））的不同筋度小麥粉進行LED光照處理2 h后，大腸桿菌菌落數均顯著降低至約1.0（lg（CFU/g））。

圖1 LED光照時間對不同接菌量大腸桿菌的減菌效果Fig. 1 Influence of LED illumination time on bacterial decontamination of wheat flour inoculated with different concentrations of E. coli

由圖2A可知，高接菌量小麥粉蠟樣芽孢桿菌菌落數隨著光照處理時間的延長而顯著減少，光照1 h后，蠟樣芽孢桿菌減少約2（lg（CFU/g）），而光照處理5 h后，菌落數由初始時的6.1（lg（CFU/g））減少至約1.4（lg（CFU/g）），減少了約4.7（lg（CFU/g））。LED藍光處理對低接菌量小麥粉的抑菌結果表明，光照處理1 h后，蠟樣芽孢桿菌菌落數由3.1（lg（CFU/g））減少至約0.8（lg（CFU/g））（圖2B）。由此可知，LED藍光處理對不同筋度小麥粉中的蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌均有顯著的減菌效果，但不同菌種對LED藍光的敏感性不同。蠟樣芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，其細胞壁結構較為簡單，主要由肽聚糖層組成，藍光更容易透過其細胞結構從而起到抑菌作用；大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，其細胞壁由多層結構組成（肽聚糖層及特有的外膜層），使藍光相對不易穿透。此結果與李崢的研究結果相一致。

圖2 LED光照時間對不同接菌量蠟樣芽孢桿菌的減菌效果Fig. 2 Influence of LED illumination time on bacterial decontamination of wheat flour inoculated with different concentrations of B. cereus

2.2 LED藍光處理對小麥粉水分質量分數的影響

從圖3可知，與初始水分質量分數相比，LED藍光處理5 h后小麥粉水分質量分數降低3%左右，室溫放置（25 ℃、相對濕度55%）的未處理組小麥粉水分質量分數降低1%左右。該變化可能由LED長時間照射會產生的少量熱效應導致。Prasad等用395 nm LED脈沖強光處理寵物食品，研究結果表明，經過LED脈沖強光處理不同時間后寵物食品的水分質量分數顯著降低，且水分質量分數與光照時間呈負相關，與本研究結果相一致。

圖3 LED光照時間對小麥粉水分質量分數的影響Fig. 3 Effect of LED illumination time on the moisture content of wheat flour

2.3 LED藍光處理對小麥粉水分分布狀態的影響

水分是食品的重要組成成分，通過表征水分的性質可以了解食品的穩定性。本研究利用低頻核磁共振確定LED光照處理對不同筋度小麥粉水分狀態的影響。橫向弛豫時間可從微觀上表征小麥粉內部水分的流動性。越短說明水與非水組分的結合更為緊密，越長說明水分越自由。和分別表示強結合水和弱結合水的弛豫時間。由圖4A可知，隨著光照時間的延長，顯著縮短，說明強結合水和非水組分之間的結合變得緊密，且在0～1 h內變化幅度較大，1 h之后趨于平緩。和分別表示和對應狀態水的相對含量。由圖4B可以看出，不同筋度小麥粉中強結合水所占比例較大，均高于80%，且光照時間越長，越小，即強結合水的峰面積減小。觀察圖5A可知，光照處理不會對高筋和中筋小麥粉的造成顯著影響，表明光照處理不會影響高筋和中筋小麥粉中弱結合水與非水組分的結合緊密程度，而低筋小麥粉中隨光照時間延長呈延長趨勢，表明低筋小麥粉中水與非水組分的結合變得更加緊密。圖5B顯示光照時間對高筋小麥粉的無顯著影響，即光照處理不會影響高筋小麥粉的弱結合水含量。此外，中筋和低筋小麥粉的隨處理時間的延長而增加，表明LED藍光處理后中筋和低筋小麥粉中弱結合水含量增加。

圖4 不同LED光照時間條件下小麥粉T21（A）和A21（B）變化趨勢Fig. 4 Changes in T21 (A) and A21 (B) of wheat flour with LED illumination time

圖5 不同LED光照時間條件下小麥粉T22（A）和A22（B）變化趨勢Fig. 5 Changes in T22 (A) and A22 (B) of wheat flour with LED illumination time

觀察圖6可知，自然環境放置不同時間的小麥粉，隨放置時間的延長，不同筋度小麥粉弛豫時間減小，說明小麥粉中水分與非水組分隨著放置時間的延長，結合變得緊密。3 種筋度小麥粉的峰面積均減小，說明強結合水含量隨著放置時間的延長呈下降趨勢。由圖7可知，自然環境放置不同時間的小麥粉，隨放置時間的延長，高筋小麥粉減小，而中筋和低筋小麥粉無顯著變化，即高筋小麥粉中弱結合水與非水組分結合變得緊密。高筋和中筋小麥粉無顯著變化，放置后低筋小麥粉顯著增加，即低筋小麥粉中弱結合水含量增加。

圖6 自然放置不同時間后小麥粉T21（A）和A21（B）變化趨勢Fig. 6 Changes in T21 (A) and A21 (B) of wheat flour after different storage periods under natural conditions

圖7 自然放置不同時間后小麥粉T22（A）和A22（B）變化趨勢Fig. 7 Changes in T22 (A) and A22 (B) of wheat flour after different storage periods under natural conditions

2.4 LED藍光處理對小麥粉色澤的影響

由圖8可見，經過LED藍光處理不同時間的小麥粉與自然環境中放置不同時間的小麥粉*值無顯著變化，隨光照時間延長，小麥粉*值呈現上升趨勢，*值減小，即光照處理對小麥粉的亮度無顯著影響，而綠度和黃度下降。自然放置5 h后的小麥粉*值，*值及*值均無顯著變化。這與Du Lihui等的研究結果一致。其研究結果表明，與未經脈沖LED處理的樣品相比，455 nm脈沖LED處理后的小麥粉樣品的*值無顯著變化，而*值增大，*值減小。

圖8 不同LED光照時間對小麥粉色澤的影響Fig. 8 Effect of LED illumination time on the color of wheat flour

2.5 LED藍光處理對小麥粉濕面筋質量分數的影響

麥醇溶蛋白和麥谷蛋白被稱為面筋蛋白，不僅具有較高的營養價值，而且是小麥粉所特有的蛋白，可使面團形成獨特的黏彈性結構。濕面筋是由麥谷蛋白與麥醇溶蛋白構成的蛋白質凝聚物，濕面筋含量對面團品質有著決定性的作用。根據濕面筋含量可大致區分小麥粉的用途，如濕面筋含量高的比較適合制作面包，而濕面筋含量低的比較適合制作糕點類。高筋和中筋小麥粉在市售包裝上所標明的蛋白質量分數均為12.2%，但高筋小麥粉的濕面筋質量分數高于中筋小麥粉，這可能是因為不同筋度的小麥粉中麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的比例不同。當其中麥醇溶蛋白的相對含量較高時，面筋的網絡結構不牢固，導致濕面筋含量減少。

圖9 不同LED光照時間對小麥粉濕面筋質量分數的影響Fig. 9 Effect of LED illumination time on wet gluten content of wheat flour

由圖9可知，高筋小麥粉的濕面筋質量分數約為30%，中筋小麥粉的濕面筋質量分數約為26%，低筋小麥粉的濕面筋質量分數約為20%。隨著光照處理時間的延長，3 種不同筋度的小麥粉濕面筋質量分數均未呈現顯著性變化，因此可知LED藍光處理對小麥粉濕面筋質量分數無顯著影響。

2.6 LED藍光處理對小麥蛋白質聚合體的影響

SDS-PAGE可以保持蛋白形態，用于分析蛋白聚合狀態。由圖10可見，高筋、中筋和低筋小麥粉的蛋白電泳條帶主要分布在20～40、60～70 kDa及85～120 kDa之間，且隨著光照時間的延長，條帶顏色變化不明顯，說明各條帶對應的蛋白質聚合體無明顯差異。相關研究表明，麥醇溶蛋白主要分布在25～100 kDa之間，麥谷蛋白主要分布在100～120 kDa之間，因此可知小麥粉中麥醇溶蛋白和麥谷蛋白含量較多。從圖10A、B可以看出，高筋小麥粉和中筋小麥粉的電泳條帶灰度大體相同。由圖10C可知，低筋小麥粉與高筋和中筋小麥粉相比，不同分子質量區間的蛋白條帶顏色相對較淺，證明低筋小麥粉的蛋白質含量較少。與未處理組對比，LED光照處理組的電泳圖沒有出現蛋白質聚合體分子質量的差異，表明光照處理不會影響小麥粉中醇溶蛋白和谷蛋白的組成。

圖10 不同LED光照時間處理不同筋度小麥粉的SDS-PAGE圖Fig. 10 SDS-PAGE patterns of wheat flour illuminated with LED blue light for different periods of time

2.7 LED藍光處理對小麥粉微觀結構的影響

從圖11可知，與未經LED藍光處理的小麥粉相比較，LED處理后的小麥粉，尤其是在藍光處理5 h后，其微觀結構的不同組分，如蛋白-蛋白、蛋白-淀粉及淀粉-淀粉之間結合得更加緊密。Du Lihui等用395 nm脈沖LED處理小麥粉，與對照相比增強了小麥粉的蛋白和淀粉之間的相互作用，形成了更加穩定的結構，與本研究結論一致。同時也有研究表明，用穩定性強的面粉生產出來的面包、面條及饅頭等食品往往具有更好的質構和口感。

圖11 未處理小麥粉及不同時間LED藍光處理的小麥粉掃描電鏡圖Fig. 11 Scanning electron microscopic images of intact wheat flour and LED blue light-treated wheat flour with different illumination periods

3 結 論

LED藍光可以有效控制小麥粉中大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的菌落數，且光照時間越長，減菌效果越顯著。與對照相比，LED藍光處理會降低小麥粉的水分質量分數，同時隨著光照時間的延長，小麥粉中的水與非水組分的結合更為緊密，且強結合水向弱結合水轉變。LED藍光處理后小麥粉的*值無顯著變化，但*值和*值降低。LED處理對小麥粉中濕面筋的質量分數和蛋白質聚合體無顯著影響，但隨著光照時間的延長，小麥粉中的蛋白、淀粉之間會發生聚集，使小麥粉的穩定性提高。綜上所述，LED藍光處理技術可有效降低小麥粉中的微生物數量且不會對其他理化特性造成不利影響。