矢車菊-3-O-葡萄糖苷及其代謝物原兒茶酸對雜環胺誘導細胞損傷的修復機制

周 娜，張會敏，潘 飛，艾 欣，趙 磊，王成濤

（北京工商大學，食品營養與人類健康北京高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

花色苷是一種廣泛分布于植物中的天然色素，由花青素和糖分子通過糖苷鍵連接而成。現已知天然花青素多達20 種，其中矢車菊素、牽牛花色素、飛燕草素、錦葵色素、天竺葵素和芍藥色素這6 種最為常見。大量研究表明，花色苷具有抗炎、抗癌、預防糖尿病及改善視力等功效。由于胃環境的pH值較低，花色苷進入人體后，在胃部保持穩定，能夠通過胃黏膜，同時以糖苷形式被胃部快速吸收（大約20%～25%）。與胃部相反，腸道pH值接近于中性，花色苷在小腸內迅速代謝，并以原型或代謝物（乙醇醛、硫酸鹽和甲基化衍生物）進入血液，或分泌到膽汁和尿液中。未被小腸吸收的花色苷進入結腸并發生實質性的結構變化，在生理條件下或在微生物作用下水解為花青素，進一步降解為簡單的酚酸，如香草酸、兒茶酸、高香草酸等。矢車菊-3--葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）是自然界中最為常見、含量最豐富的花色苷，其在人體內的主要代謝產物有原兒茶酸、3-甲基沒食子酸、沒食子酸、丁香酸和2,4,6-三羥基苯等，其中原兒茶酸含量最多。

雜環胺是肉類中的蛋白質經高溫加工過程中產生的一種有毒的有機化合物。根據化學結構和產生機制不同，雜環胺可分為兩大類，即氨基咪唑氮雜芳香烴類和氨基咔啉類，前者是由氨基酸、還原糖和肌酸或者肌酐在300 ℃的高溫下縮聚而成，主要有2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-]pyridine，PhIP）、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-]喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-]quinoline，IQ）、2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-]喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-]quinoxal，MeIQx）等；后者則是由氨基酸和蛋白質在300 ℃的高溫下裂解而產生，主要包括3-氨基-1,4-二甲基-5-吡啶并[4,3-]吲哚、3-氨基-1-甲基-5-吡啶并[4,3-]吲哚、2-氨基-9-吡啶并[2,3-]吲哚、2-氨基-3-甲基-9-吡啶并[2,3-]吲哚、2-氨基-6-甲基吡啶[1,2-:3’2’-]咪唑、2-氨基-二吡啶并[1,2-:3’2’-]咪唑等。大量流行病學調查研究發現，長期攝入雜環胺會增加直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等癌癥的病發率，然而，家庭烹飪卻難以完全避免雜環胺的產生。在已知的30多種雜環胺中，PhIP在肉制品熱加工過程中最容易生成、含量最為豐富，IQ被國際癌癥研究中心列為2A級致癌物，致癌作用最強。因此，從食源性物質中尋找抑制PhIP和IQ毒性的活性成分具有重要意義。

研究發現，一些天然多酚、黃酮類物質、化學合成物以及某些新鮮蔬果液等能夠降低雜環胺的致突變性。Kalemba-Dro?d?等通過彗星實驗發現富含抗氧化物質（多酚、黃酮類、花青素、抗壞血酸）的漿果果汁能顯著降低PhIP引起的氧化應激和DNA損傷。Jain等發現姜黃素可同時抑制PhIP誘導活性氧的生成和DNA加合物的形成，對DNA損傷有積極的改善效果；Akhtar等發現楊梅素能夠有效地防止癌癥前期單克隆丙種球蛋白病患者和健康人體DNA受到PhIP誘導損傷，這種保護作用可能歸因于其通過上調腫瘤抑制基因的水平而發揮抗腫瘤活性。許多研究表明，C3G與其主要代謝物原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。然而，目前鮮見C3G和PCA對PhIP和IQ毒性影響的作用機制研究。

雜環胺被消化吸收后，主要通過血液運輸至肝臟進行代謝。雜環胺活性代謝物不僅可以與脂質和蛋白質結合，導致氧化應激、細胞損傷和生物功能性喪失，還可以與DNA形成雜環胺-DNA加合物引起遺傳毒性，誘發細胞凋亡。細胞的凋亡受多種基因的調控，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax參與調控細胞凋亡。人肝癌HepG2細胞被廣泛應用于遺傳毒理學等方面的研究，對于研究毒物作用機制有著重要意義。因此，本研究選用HepG2細胞，采用IQ和PhIP誘導細胞損傷，通過測定細胞存活率、細胞核形態和細胞周期來比較C3G和PCA對雜環胺損傷細胞毒性的影響，并測定DNA損傷相關基因（、、和）和凋亡相關基因（、、、、、和）的表達，初步探討其修復機制，為雜環胺所致肝損傷防治和功能食品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞系（HepG2細胞）由中國協和醫科大學細胞中心提供。

IQ、PhIP 加拿大TRC生物技術公司；C3G、PCA成都曼斯特生物技術有限公司；DMEM干粉培養基、青霉素-鏈霉素 美國Gibco公司；胎牛血清以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、細胞毒性實驗（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、噻唑藍試劑、Hoechst33258染色劑 上海碧云天生物技術有限公司；TRIzol細胞裂解液 美國Ambion生物技術公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒 北京天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HDL超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；Galaxy 170S恒溫CO細胞培養箱 德國Eppondorf生物技術公司；SpectraMaxi3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；ECLIPSE Ti倒置顯微鏡 日本Nikon公司；CFX96Toμch熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；BD Calibur流式細胞分析儀 美國Becton Dickinson公司；TDL-5-A低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

將HepG2細胞系用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和質量濃度100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液于5% CO、37 ℃培養箱中培養，使細胞貼壁生長。

1.3.2 HepG2細胞存活率的測定

實驗分為對照組（正常培養的細胞）、IQ單獨損傷組、PhIP單獨損傷組、IQ+C3G組、IQ+PCA組、PhIP+C3G組、PhIP+PCA組。將處在對數生長期的細胞接種于96 孔板中，利用血球計數板調整密度至每孔5×10個/100 μL，5% CO、37 ℃孵育24 h，細胞全部貼壁后，給予IQ或PhIP（0、62.5、125、250、500 μmol/L）以確定合適的作用濃度，再分別用不同終濃度的C3G和PCA（0、100、200、400、500 μmol/L）進行干預，每組5 個復孔。孵育48 h后，加入10 μL CCK-8工作液，繼續培養2 h。用酶標儀于570 nm波長處測各孔吸光度。根據下式計算細胞存活率。

1.3.3 Hoechst33258染色法觀察細胞核形態

將生長狀態良好的細胞接種于6 孔培養板中的無菌蓋玻片上，37 ℃、5% CO條件下培養24 h，待細胞融合至約50%～80%。加入含有不同濃度的雜環胺培養液（IQ終濃度為250、500、1 000 μmol/L，PhIP終濃度為125、250、500 μmol/L），放入培養箱培養48 h；用預冷的乙醇溶液將細胞固定，于4 ℃過夜；洗凈固定液，加入Hoechst33258染色液避光染色；制作載玻片并隨機選取10 個非重疊視野置于400 倍的熒光顯微鏡下觀察細胞核形態。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期

將狀態良好的細胞接種于60 mm的細胞培養皿中，24 h后加入IQ（500 μmol/L）或PhIP（125 μmol/L），隨后分別加入400 μmol/L C3G或PCA，作用48 h后，加入1 mL 0.25%胰酶消化2～3 min，收集細胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，用4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4、0.01 mol/L）清洗細胞2 次，再用200 μL PBS懸浮細胞，得到單細胞懸浮液，于體積分數70%乙醇溶液中4 ℃固定24 h；2 000 r/min離心10 min收集固定后的細胞，再用4 ℃預冷的PBS清洗3 次，得到的細胞用500 μL PBS懸浮得到細胞懸浮液，加入終質量濃度為25 μg/mL的RNaseA，37 ℃水浴40 min；加入26.3 μL質量濃度1 mg/mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）冰上避光染色30 min后，流式細胞儀檢測每組細胞周期分布情況。

1.3.5 實時熒光qPCR

各組加樣作用48 h后的細胞經胰酶消化后收集于離心管中，用4 ℃預冷PBS洗滌2 次，離心收集細胞沉淀。利用Trizol法提取細胞總mRNA，加入10 μL的焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行cDNA合成。反轉錄反應體系：2 μL 10×反轉錄緩沖液、1 μL酶混合物、2 μL引物混合物、5 μL雙蒸水，于42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。以三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）基因作為內參基因，引物序列見表1。

表1 qPCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數據統計與分析

用SPSS Statistic 21軟件進行單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示。實驗設定3～5 個平行組，每個實驗重復不少于3 次，以＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 IQ和PhIP對HepG2細胞存活率和細胞核形態的影響

選用不同濃度（0～500 μmol/L）的雜環胺誘導HepG2細胞48 h，CCK-8檢測細胞存活率，篩選出建立體外細胞損傷模型的最佳IQ和PhIP誘導濃度。如圖1所示，隨著雜環胺處理濃度的不斷增大，細胞的存活率均呈下降趨勢。與對照組相比，IQ濃度為250 μmol/L和500 μmol/L時，細胞存活率分別下降至81.71%和70.68%；而PhIP濃度僅為62.5 μmol/L時，細胞存活率就已經下降至86.48%，當作用濃度增大為500 μmol/L時，細胞存活率可降至33.31%。當細胞存活率為90%以上時認為雜環胺在該濃度下無細胞毒性，而當細胞存活率低于60%時，細胞損傷嚴重難以恢復，結合前期研究報道，本實驗選擇500 μmol/L IQ以及125 μmol/L PhIP用于后續研究。

圖1 IQ和PhIP對HepG2細胞存活率的影響Fig. 1 Effects of IQ and PhIP on the survival rate of HepG2 cells

采用Hoechst33258熒光染色法觀察IQ和PhIP作用48 h后HepG2細胞核形態的變化。由圖2可看出，對照組細胞核形態圓潤清晰，熒光顯色均勻彌散。而經過雜環胺處理的細胞，細胞核或者細胞質內出現了明亮并且濃密的熒光，說明經過藥物處理后的細胞核發生明顯變化，呈現核濃縮狀態，染色質遭到破壞發生形變，即典型的凋亡細胞核狀態，同時可看出濃縮細胞核數量隨著藥物濃度的增大而增加。

圖2 IQ和PhIP對HepG2細胞核形態的影響（400×）Fig. 2 Effects of IQ and PhIP on the nucleus morphology of HepG2 cells (400 ×)

2.2 C3G和PCA對雜環胺損傷HepG2細胞存活率的影響

C3G和PCA對雜環胺損傷細胞存活率的影響如圖3所示。IQ或PhIP單獨處理后，HepG2細胞存活率均顯著降至對照組的60%左右。由圖3A可知，與IQ單獨損傷組相比，100～500 μmol/L的C3G均能顯著提高細胞存活率（＜0.05），而PCA僅在500 μmol/L時能夠顯著提高細胞存活率（＜0.05）。由圖3B可知，與PhIP單獨損傷組相比，100～500 μmol/L C3G均能顯著提高細胞存活率（＜0.05），而PCA僅在200 μmol/L和400 μmol/L時能夠顯著提高細胞存活率（＜0.05）。因此，C3G對雜環胺損傷HepG2細胞的保護作用效果要比PCA更好。

圖3 C3G和PCA對IQ（A）和PhIP（B）損傷HepG2細胞存活率的影響Fig. 3 Effects of C3G and PCA on the survival rate of HepG2 cells injured by IQ (A) and PhIP (B)

2.3 C3G和PCA對雜環胺損傷HepG2細胞周期的影響

為了探究C3G和PCA對雜環胺誘導的HepG2細胞增殖能力變化的影響，運用流式細胞術對細胞周期的分布情況進行了檢測。圖4A～C顯示，與對照組相比，IQ誘導HepG2細胞的G0/G1期和S期細胞比例分別顯著和極顯著下降（＜0.05、＜0.01），而G2/M期細胞比例極顯著增加（＜0.01），這表明IQ（500 μmol/L）可使HepG2細胞發生G2/M期阻滯和DNA損傷，使細胞產生不利于有絲分裂的信號。與IQ單獨損傷組相比，C3G和PCA均能夠誘導G0/G1期細胞比例顯著或極顯著降低（＜0.05、＜0.01），S期細胞比例升高，說明加入C3G或PCA可使HepG2細胞發生明顯的S期阻滯，對DNA損傷有改善效果。

如圖4D～F所示，與對照組相比，PhIP誘導HepG2細胞的G0/G1期細胞比例極顯著升高（＜0.01），S期細胞比例極顯著下降（＜0.01），而G2/M期細胞比例未發生明顯改變。這表明PhIP（125 μmol/L）可使細胞產生G0/G1期阻滯，無法進入S期進行DNA的復制，影響了正常的細胞周期進程，使細胞修復損傷或發生凋亡。與PhIP單獨損傷組相比，C3G和PCA均能夠誘導G0/G1期細胞比例顯著或極顯著降低（＜0.05、＜0.01），S期細胞比例極顯著上升（＜0.01），說明加入C3G或PCA后可促進細胞由G1期進入S期，促進細胞體外生長增殖能力，對125 μmol/L PhIP引起的細胞周期變化有積極改善作用。

圖4 流式細胞術檢測C3G和PCA對雜環胺損傷HepG2細胞周期的影響Fig. 4 Effects of C3G and PCA on cell cycle of HepG2 cells damaged by heterocyclic aromatic amines

2.4 C3G和PCA對雜環胺損傷HepG2細胞的DNA損傷和細胞凋亡相關基因表達的影響

C3G和PCA對雜環胺誘導HepG2細胞DNA損傷基因mRNA表達的影響如圖5所示。與對照組相比，IQ顯著提高了4 種DNA損傷相關基因的表達量；PhIP顯著提高了和基因的表達量（＜0.05）。由此說明IQ和PhIP可以通過提高DNA損傷相關基因的表達水平從而造成HepG2細胞的損傷。與IQ單獨損傷組相比，C3G可顯著降低、和基因的mRNA表達水平（＜0.05）（圖5A），PCA可顯著降低GADD45α和基因的mRNA表達水平（＜0.05）（圖5B）。但C3G和PCA對PhIP誘導的HepG2細胞和基因的mRNA表達水平無顯著影響（＞0.05）（圖5C、D），說明兩者可能通過其他途徑減輕PhIP對細胞產生的不利影響。Liu Wei等發現，和基因和蛋白的表達水平在紫外照射HepG2細胞12 h后明顯升高，而經過一定濃度的藍莓花青素干預后，兩者的表達量顯著降低，這與本實驗C3G干預IQ造成DNA損傷后的變化趨勢相同，說明C3G和PCA對IQ造成的DNA損傷有改善作用。但加入PCA和C3G后，基因mRNA表達水平變化趨勢有明顯差異，其原因仍待查明，推測基因參與多條通路，與其他通路中的作用靶點有關。

圖5 C3G和PCA對雜環胺誘導HepG2細胞DNA損傷相關基因mRNA表達的影響Fig. 5 Effects of C3G and PCA on the mRNA expression of DNA damagerelated genes in HepG2 cells induced by heterocyclic aromatic amines

C3G和PCA對雜環胺誘導HepG2細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響如圖6所示。與對照組相比，經IQ和PhIP處理的HepG2細胞的促凋亡基因、、、的mRNA表達量顯著提高（＜0.05），PhIP處理的HepG2細胞的基因表達量無顯著變化（＞0.05），說明IQ和PhIP能促進HepG2細胞發生凋亡，IQ和PhIP作用后亦能使抑凋亡基因的mRNA表達量顯著上調（＜0.05），這與Pezdirc等報道的250 μmol/L IQ作用HepG2細胞使基因表達量顯著下調，基因表達量上調的趨勢不同，其原因仍需進一步探究。與IQ單獨損傷組相比，C3G和PCA顯著降低了促凋亡基因的表達水平（＜0.05），進一步顯著提高了抑凋亡基因和的mRNA表達水平（＜0.05）（圖6A、B），由此可得出，C3G和PCA可顯著下調IQ引起的促凋亡基因的過表達，可以降低IQ誘導的細胞毒性和細胞凋亡。吳實在研究C3G修復紫外線照射后的細胞損傷時也發現，C3G可下調紫外線氧化損傷后基因的表達量，上調基因表達量，以此實現對損傷細胞的修復作用。與PhIP單獨處理組相比，加入C3G干預后，促凋亡基因除和基因mRNA表達水平顯著降低外（＜0.05），其他促凋亡基因、、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05）（圖6C）；加入PCA干預后，促凋亡基因、、基因mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），而其他促凋亡基因、基因mRNA表達水平仍顯著升高（＜0.05）（圖6D）。上述研究表明，C3G和PCA能夠使細胞凋亡保持在合適的水平，當PhIP誘導細胞凋亡程度較輕時，可降低細胞凋亡從而使細胞恢復正常狀態；而當PhIP使細胞凋亡嚴重至不可修復時，細胞繼續增殖容易誘發突變，C3G和PCA則促進這部分細胞凋亡，從而減少PhIP誘發的突變。

圖6 C3G和PCA對雜環胺誘導HepG2細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響Fig. 6 Effects of C3G and PCA on the mRNA expression of apoptosisrelated genes in HepG2 cells induced by heterocyclic aromatic amines

3 結 論

本實驗通過雜環胺誘導建立HepG2細胞肝損傷模型，比較C3G和PCA對雜環胺損傷細胞毒性的影響，并初步探討其修復機制。結果表明，IQ和PhIP能顯著降低細胞存活率并使細胞核發生皺縮破壞；C3G和PCA能夠顯著提高雜環胺損傷細胞的存活率，并對雜環胺引起的細胞周期變化有積極改善作用；C3G和PCA對IQ造成的DNA損傷和細胞凋亡有改善作用，對PhIP造成的DNA損傷也有一定的修復效果，但當PhIP損傷嚴重至無法逆轉時，C3G和PCA可促進細胞凋亡，降低癌變發生幾率。與國內外現有研究相比，本研究首次系統研究并比較了C3G及其代謝產物PCA對雜環胺誘導細胞損傷的修復作用及潛在作用機制，同時揭示了C3G可通過母體和代謝物形式共同發揮其生物活性。本研究可為日常飲食中減輕雜環胺對人體健康的危害提供理論指導，并促進花色苷資源的開發與應用。