合成生物學構建微生物工程菌研究進展

高 欣，柳羽哲，江澤沅，曾 琦，劉詩夢，劉曉婷，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

微生物發酵是重要的工業生產手段之一。相比于一般的化學合成和植物提取，微生物發酵條件溫和，能利用易獲取的廉價底物快速繁殖，具有產量高、易轉化、周期短、易于提取純化等優點。隨著醫藥和食品領域發展，微生物發酵產品需求多元化，天然菌株中缺乏所需產物的代謝途徑，或其代謝途徑調控復雜，所需產物難以實現過量積累。拓寬微生物生產領域和提升微生物生產效率，是加快微生物發酵產業化的有效手段，已有大量研究人員致力于發酵優化和菌種改造。工業微生物發酵的人工代謝調控方法主要分兩類：一類是基因修飾，如密碼子優化、過量表達、競爭途徑敲除等；另一類是發酵條件控制，如溫度、pH值、供氧量、培養基碳氮比、前體物質添加等。這些技術手段相對成熟，主要作用位點針對性較強，但目前仍存在一定的局限性。傳統改造多屬于靜態調控，相比于以動態調控為核心的合成生物學改造手段，傳統改造方法不能在菌體所處環境條件發生變化時，動態地對代謝流進行調控，容易導致菌體自身代謝失衡，氧化還原平衡被破壞，進一步可能引起菌體的裂解死亡，因此亟需一種基于不同需要進行構建工程菌的思路。

合成生物學作為生物學和工程學的一個跨學科分支，對生物過程進行工程化。構建非天然存在的人工生物系統，同時重新整合天然存在的生物系統是合成生物學的出發點和歸宿。合成生物學使用的最基礎工具為標準化生物元件，生物元件通過逐級組裝形成生物線路、生物網絡和生物系統，通過對各元件的設計和組合，構建出具有特殊功能的人工系統。2000年，第一個利用遺傳撥動開關構建的合成雙穩態基因調節網絡被建立，它由任意兩個相互抑制的啟動子組成，利用瞬態化學或熱感應在穩態之間翻轉，顯示出接近理想的開關閾值，對生物技術和生物計算具有重要的意義?；诖嗽O計出的人工基因調控模塊構成菌體代謝活動的系統，能夠更合理地設計微生物體內代謝網絡，有效解決菌體代謝失衡問題。微生物作為合成生物學研究的重要載體，合成生物學技術的出現使工程菌種研究獲得了全新的機遇，合成生物技術的發展更是極大地提升了被構建工程菌的生產能力。在合成生物學研究中，微生物通常被設計并改造成細胞工廠，應用于不同產品的生產。本文概述合成生物學技術，綜述借助編輯工具和生物元件進行代謝通路的移植或動態調控構建工程菌，并介紹利用所構建工程菌在生產氨基酸、有機酸、芳香族化合物、糖類中的應用。

1 合成生物學技術方法

1.1 基因編輯工具

規律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR關聯蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系統是新涌現的基因編輯工具，能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。該工具的開發為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新的平臺。2013年，Le Cong等報道了CRISPR/Cas系統能同時編輯哺乳動物基因組中的多個位點，作為一種RNA引導的內切核酸酶系統，它可以直接通過核苷酸堿基配對靶向DNA位點。與傳統基因編輯工具相比較，CRISPR系統作為一種新型編輯工具，具有省時、易構建、精度高等特點，以CRISPR系統為代表的新型基因編輯技術飛速發展，在諸多生物學領域中得到廣泛應用，成為近年基因組編輯的熱門工具，當前已被廣泛應用于基因敲除、基因沉默和基因激活等方面，極大擴展了基因編輯技術的應用范圍，如圖1所示。

圖1 CRISPR/Cas系統作用機制[3]Fig. 1 Mechanism of action of CRISPR/Cas system[3]

CRISPR/Cas系統被廣泛應用于多物種基因編輯的同時，Cas9蛋白對常用模式菌——谷氨酸棒桿菌的毒性問題也隨之被發現，這一困擾阻礙了微生物改造研究進程。2015年，Bernd等報道了一種具有不同于Cas9特征的更簡單的Cpf1蛋白。Cpf1是一種缺乏反式激活CRISPR RNA（trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA）的單一RNA引導的內切酶，通過DNA雙鏈交錯斷裂來裂解DNA，抗干擾能力增強。與Cas9蛋白相比，Cpf1蛋白對基因組編輯活性較高，脫靶效應更低，應用范圍更廣，并解決了部分菌種中Cas9不適用問題。自被發現以來，CRISPR-Cpf1已被廣泛應用于微生物研究。Krumbach等用CRISPR/Cpf1系統在機械敏感通道的關鍵位置進行密碼子飽和誘變，篩選到可外排-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌突變體。Ding Dan等同時表達來自Cas9和Cpf1內含子的多個gRNA和crRNA，與常規Cpf1載體相比，這種雜合基因在同時靶向多個位點時具有更高的效率和穩定性。Ferenczi等將CRISPR/Cpf1核糖核蛋白與單鏈DNA修復模板一步共遞送，在靶向核基因編輯效率低下的萊茵衣藻中實現高效、精確的靶向DNA替換。上述研究證明了CRISPR/Cpf1系統在內源基因座的序列特異性突變和表位標記的無轉基因和無選擇標記中的用途。

1.2 基因組合成方法

隨著近10 年合成生物學飛速發展，越來越多的科研團隊都致力于用合成DNA來構建復雜的基因系統。細胞自身基因組的人工改造自然而然地進入了人們視野。2008年，Venter研究所用化學合成的DNA構建出580 000 bp支原體基因組的完整副本；2016年，該研究所重新設計了之前合成的支原體基因組，刪除部分被認定為生長非必需的基因和DNA，被刪除部分約占全基因組的一半。這項工作未對基因進行任何編碼，保留的基因組部分與自然序列相同，但它是目前人為改造最多的基因組，它的基因內容和布局與天然基因組相比有很大差異。

作為基因組合成領域的里程碑，人工合成酵母基因組計劃旨在保證人工合成的酵母具有與野生型酵母相似活性的基礎上，實現人工合成釀酒酵母的全基因組構建，并且達到酵母基因組的完全人工編寫，構建全設計型、全合成型的釀酒酵母基因組。人工合成酵母基因組計劃已有大量研究者參與探索，Shen Yue等通過loxP介導進行合成染色體的重排和修飾，將基因組半合成酵母中與生長缺陷有關基因序列用野生型酵母序列替代，獲得與天然菌株生物過程高度一致的新型酵母菌株。同時Shao Yangyang等在釀酒酵母基因組結構的融合重建上取得突破，通過連續的端對端染色體融合和著絲粒缺失，從含有16 條線性染色體的釀酒酵母單倍體細胞中獲得了一種功能性單染色體酵母，這項研究證實了從染色體結構和功能方面探索真核生物進化的可能。賈斌設計的“與門”開關實現了合成型釀酒酵母基因組重排的精確調控。通過合成型基因組重排獲得多種表型，提高了酵母中類胡蘿卜素產量，成功發掘驗證了相關的功能基因。

2 合成生物學設計理論

2.1 生物元件設計與動態調控

2.1.1 基礎元件設計

生物元件是生命體內具有最基礎生物功能的基本結構單元，例如調控基因表達的調控元件，包括啟動子、終止子、核糖體結合位點（ribosomebinding site，RBS）以及特定功能的結構元件（如天然產物合成途徑中酶基因）。近年來隨著對啟動子序列核心元件和上游激活序列認識的不斷提高，人工雜合啟動子的開發和應用正在迅速發展。將來有望獲得序列更短、性能更強的啟動子，從而有利于實現對模式菌中所引入的復雜通路進行更有效的調控。通過構建文庫的方法來設計啟動子或RBS等調控元件非常有效，但文庫構建與元件篩選效率較低，不適用于需要大量調控元件的人工生物系統構建，此外許多元件無法快速進行文庫篩選。因此建立一套完整的啟動子的強度預測模型至關重要。Salis等通過將描述翻譯起始的生物物理模型與最優化算法相結合，提出了一套熱力學預測模型用于RBS設計。該模型通過預測RBS與核糖體結合的強度，可對蛋白翻譯的起始速率及蛋白表達水平進行定量調控。Shi Feng等通過優化RBS序列與啟動子間隔，提高蘇云金芽孢桿菌來源的異亮氨酸雙加氧酶表達。由于已有模型預測準確度偏低，現有的在啟動子或RBS強度預測水平不足以支持基于強度預測的理性設計，難以從真正意義上實現啟動子或RBS序列設計，而且缺乏通用性。借助人工神經網絡建立效果和普適性更好的預測模型和方法是可進一步挖掘的方向，所建立的模型和方法還可用于指導合成生物學精細調控元件的理性設計。不同來源不同功能的生物元件，可以通過復雜設計與其他元件或模塊進行組裝，形成更大規模的具有特定生物學功能的生物回路、裝置和系統。因此，生物元件的搜尋與標準化是設計與組裝更復雜的功能模塊和生命系統的基礎。

2.1.2 傳感器與開關設計

借助生物傳感器進行動態調控，可以取代常規基因敲除，從而解決因基因敲除導致的菌體生長不良影響產量這一問題。目前生物傳感器主要包括熒光共振能量轉移傳感器、核糖開關傳感器和轉錄因子傳感器。

熒光共振能量轉移傳感器由于操作簡單、敏感性高、反應速度快的特點常用于食品安全檢測領域，例如對赭曲霉毒素A的檢測。核糖開關對配體的響應更為快速，結構簡單易于改造，更適用于基因表達的動態調控。王興設計了對異丙基硫代半乳糖苷濃度具有高靈敏度的傳感體系，包括產生信號分子LuxI蛋白表達元件和能接受信號分子的刺激產生綠色熒光蛋白的感應元件。轉錄因子傳感器借助轉錄因子識別和結合基因啟動子區的元件來控制下游基因表達，其調控基因表達的特性適用于建立細胞工廠，例如篩選高活性酶及高產菌、動態調控蛋白表達。如Uchiyama等開發了一種基于報告基因分析的酶篩選方法，在大腸桿菌中利用轉錄因子Ben R控制綠色熒光蛋白基因表達，對酰胺酶活力進行篩選。Rogers等設計出一種小分子響應性轉錄因子Acu R的遺傳編碼生物傳感器，根據熒光強度與靶代謝產物的細胞內濃度成比的原理，能實時監測菌體內3-羥基丙酸濃度的改變。Kortmann等利用賴氨酸生物傳感器對熒光激活細胞進行分選，獲得了有利于-賴氨酸產量提升的丙酮酸羧化酶突變體。

生物開關作為基因表達動態調控的重要組成部分，通過感應某一條件的改變，控制基因表達“開啟”或“關閉”，在代謝工程中常與傳感器聯動工作來完成調控。Binder等使用基于表達模塊的光響應控制元件，使用光控開關來改善谷氨酸棒狀桿菌中生長抑制型倍半萜生產。Cheng Lin等將溫控開關用于-酮丁酸生產，通過溫度升高誘導蘇氨酸脫氨酶過量表達，獲得-酮丁酸高產菌株。Zhou Libang等在產賴氨酸的谷氨酸棒桿菌LP917菌株中，使用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的核糖開關來控制基因和三羧酸循環活性，提高了進入賴氨酸合成途徑的代謝通量。修宇以重要中間產物柚皮素為核糖開關的小分子配體，利用能與柚皮素特異識別的適體庫，以雙選擇標記基因作為報告基因，在生物體內通過兩條不同柚皮素濃度的篩選路徑，富集獲得具有不同最適檢測適應范圍的核糖開關庫。由于核酸適配體對目標產物缺乏響應，基于核糖開關的代謝物傳感器在代謝工程中的應用仍然有限。近年來出現了一些有助于設計核糖開關的工具，或許可以促進核糖開關在微生物工業生產上的應用。

2.2 蛋白質設計

根據目前的認知水平，功能生物元件的完全從頭設計有是一項艱難的挑戰，特別是在氨基酸序列與高級結構確定方面。許多蛋白質元件缺少高通量模型，無法快速進行文庫篩選獲得具有預期功能的突變體。因此根據掌握的元件序列與功能之間存在的特殊關系建立計算機模型，對元件的關鍵位點進行改造，理性設計具有預期功能和控制特性的元件是元件設計的重要方向。在蛋白質元件設計上，可以基于已知元件結構和功能間的關系，替換編碼生物元件的DNA序列，或引入編碼非天然氨基酸序列，獲得轉化的蛋白質元件；其次可以根據大規模定向進化篩選，將隨機變異導入編碼生物元件DNA中，用合適的篩選方法進行大規模篩選，得到期望的蛋白質生物元件；還可以利用計算模擬，定向設計與合成蛋白質中拓撲結構，利用從頭設計合成出具有特殊結構的蛋白質。

在蛋白質從頭設計上，蛋白質的整體結構依賴設計，但合成的蛋白質結構特征常常與預測結構不盡一致，因此迫切需要有效預測蛋白質結構折疊模式的方法。給定可以準確計算某種蛋白質構象能量的生物物理方法，同時基于快速抽樣搜索的算法，就可以快速尋找新型蛋白。Kevin等基于X射線衍射，設計了兩個蛋白質結構的蛋白質低聚物，形成的雙組分籠具有四面體對稱性。兩種蛋白均具有較高的可溶性。此外還使用了一個有利于氫鍵網絡的形成計算協議，而不是完全的疏水相互作用，以穩定設計的蛋白質-蛋白質界面。Huang等從頭設計了四重對稱、耐熱的丙糖磷酸異構酶（triosephosphate isomerase，TIM）桶狀蛋白質，蛋白質的X射線晶體結構與設計的TIM木桶模型幾乎相同。設計序列與其他天然存在的TIM桶狀蛋白超家族相距甚遠，這為定制酶提供了可能。Doyle等報道了用于從頭設計串聯重復蛋白結構的計算方法的開發和驗證，應用這些方法設計了一系列閉合的類螺旋體重復結構，并驗證了在蛋白質結構數據庫中尚未出現的左手螺旋結構的-類蛋白重復序列。Justin等借助人工設計的能將二氧化碳轉化為燃料和化學物質的酶Formolase，在細菌體內構建一種全新的代謝通路，說明現代蛋白質工程和設計工具能夠促進構建全新的生物合成途徑。這些人造蛋白結構可能會在生物納米技術中得到應用，并且為蛋白質制劑、新型功能酶的合成等方面的研究作出了貢獻，具有很大的應用潛力。

2.3 合成線路與合成網絡設計

基于合成生物元件，對多個元件進行串聯或并聯，組成了具有處理信息能力和干預生命體功能的合成基因線路。合成基因線路設計首先需要構建基礎功能元件，如撥動開關、感應器等，然后進行元件組裝，構建復雜的功能線路?；蚓€路的人工合成有助于對菌體自身基因組的刪減，基因組簡化能提升人們對基因組功能的認知，創造精簡高效的工程菌，如刪除菌體代謝調節網絡的重復部分、穩定插入的外源基因、優化菌體代謝途徑以及加強菌體對物質和能量的利用。近年來，合成基因線路的設計取得一些進展，科學家們構建出了基因傳感器和具有所需強度的調控元件、基因表達動態控制器和生物觸發器等一批功能組件。基于當前的研究，在單個細胞內構建的合成基因線路，難以攜帶大量的人為附加元件。基因表達的競爭和噪聲限制了基因線路規模化，而降低噪聲通常需要增加基因表達強度，使得細胞內有限的資源和能量分配緊張。如果減少元件數和表達量來降低其資源占用量，會增加基因線路表達的不確定性。使用動態信號可以在一定程度上抵抗外源噪聲帶來的不確定性，通過監測單個細胞，發現細胞內基因表達差異小于細胞間差異。徐顯皓的研究結果表明，增加監測時間點可以提高對外源噪聲的抗干擾能力。此外，針對動態信號的特點有針對性地設計基因線路也能降低基因表達噪聲。

隨著合成生物學領域的發展，合成基因線路的功能越來越多。但隨著基因線路規模的擴大，簡單的構建方法已無法滿足日益增長的大規模合成基因線路的設計需要。利用合成生物學構建合成基因線路，在特定的條件下關閉或打開基因的表達，實現細胞生長的內源代謝途徑和目的產物生產的異源途徑之間的轉換。通過建立動力學模型和代謝模型，檢驗合成生物網絡是否具有期望的調控特性，在檢測的基礎上設計能處理特定信息的合成生物網絡，并分析實際代謝網絡中的代謝通量，為人工合成代謝網絡的構建提供了指導。大量研究者將線性優化引入代謝網絡分析，基于約束的建模理念和通量平衡分析，結合自動化和手工修飾，在基因組規模細胞代謝網絡設計上構建了一系列模式生物的代謝網絡。已有的典型模式生物的基因組規模代謝網絡包括、、、、、等物種的代謝網絡模型，、的基因調控網絡模型是主要代表。由合成線路構成的、具有特殊拓撲結構的基因網絡常作為研究模板，被稱為基因網絡模體，部分基因網絡模體具備特殊的功能，如瞬態響應和倍數感知等。Planes等對酵母菌基因網絡進行編輯，生產出青蒿素前體，在植物源藥物的異源生產上獲得重大突破。

3 合成生物學構建微生物工程菌的應用

隨著對代謝工程和合成生物學領域探索的不斷深入，人工構建微生物工程菌在合成各類產物方面具有獨特的優勢，成為了國內外工業生物技術研究的熱點。首先通過優化合成途能夠獲得工程菌框架，然后通過提高其性能和穩定性，進化代謝和全局調控提高其生產能力，并進行多重比較，選擇合適的宿主菌，將其轉化成生產可用的工程菌。一些模型微生物（大腸桿菌、畢赤酵母、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和解脂耶氏酵母）已被鑒定為異源表達和大規模生產高價值天然產物的理想基礎。這些模型微生物具有作為底盤細胞的優勢，因為有各種有效的合成生物學工具來設計它們，并且它們具有較高的生長率和經過充分研究的基因組和代謝網絡。在底盤細胞中對特定代謝產物生物合成相關基因進行重新設計、組裝和構建，從而利用底盤細胞已有的代謝網絡合成目標產物，實現目標產物的異源高效合成。

3.1 氨基酸

合成生物學技術的發展對氨基酸發酵生產行業具有較大的推動作用，不僅能提升傳統氨基酸產品的產量，還可以獲得產特殊氨基酸產品的工程菌。Zhou Libang等使用賴氨酸核糖開關和細胞內-賴氨酸作為信號來控制與賴氨酸生物合成相競爭的必需代謝旁路，較一刀切的傳統改造手段，降低了對菌體生長和代謝影響。龍夢飛設計出能動態調控-酮戊二酸脫氫酶活性的基因調控線路，并利用該調控系統下調支路關鍵酶活性，較傳統敲除支路手段，其小幅度變動宿主原基因組，提高了反式-4-羥基--脯氨酸的產量。Zhang Bin等在和引入RBS置換和起始密碼子置換，并在序列中插入經篩選的終止子，顯著提升-鳥氨酸的積累，緩解了直接敲除導致的谷氨酸棒桿菌菌體生長障礙。合成生物學相關技術的大力發展將為繼續突破模式工程菌生產各類氨基酸提供強有力的保證，相比于化工生產用的酶法、抽提法、合成法，發酵法生產氨基酸具有條件溫和、產物純度高的優點，而進一步借助合成生物學技術，在對生產用菌全局代謝途徑清晰的前提下，能對菌體使用動態的、更適當的、更精準的、影響更小的改造方式來高產目的氨基酸。

3.2 芳香族化合物

含有雙鍵和單鍵交替的不飽和環的芳香族化合物在工業上應用廣泛，例如作為添加劑被使用在藥物、農用化學品、食品、飼料和化妝品中。芳香族化合物主要通過化學合成，也可以通過提取從植物中獲得。由于一系列資源及環境問題，利用可再生生物質生產芳烴的生物技術越來越受到關注。許多微生物能夠分解代謝過多的芳香族化合物，攔截這些代謝途徑可能導致生物技術生產增值芳香族化合物，研究者重點關注莽草酸途徑這一生成芳香族氨基酸和其他多種芳香族化合物的重要途徑。莽草酸途徑中，最終產物4-羥基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，4HBA）是一種在防腐殺菌方面有利用價值的原料。Barker等構建了一系列重組大腸桿菌菌株，獲得了1 株4HBA反饋抑制得到緩解的、對菌體毒性作用下降的重組菌菌株，4HBA實驗室規模產量達到12.0 g/L。Verhoef等從惡臭假單胞菌S12中敲除4HBA羥化酶的基因，轉入載有苯丙氨酸解氨酶基因的質粒，構建了失去降解4HBA能力的S12pal B1菌株。由于惡臭假單胞菌S12缺乏利用木糖的天然能力，Meijnen等將來自大腸桿菌的木糖異構酶途徑引入到產對羥基苯甲酸酯的惡臭假單胞菌中，獲得能利用木糖的菌株。以往4HBA從石油成分中合成，對資源和環境的損耗極大?；诤铣缮飳W的工程菌設計思路，借助目標產物代謝途徑的小規模刪減和異源合成途徑的移植，使本不能留存4HBA的大腸桿菌在改造后有望實現4HBA及其他莽草酸代謝途徑產物的工業化生產。

3.3 糖類

氨基葡萄糖（2-amino-2-deoxy--glucose，GlcN）常用作膳食補充劑，GlcN及其衍生物-乙酰氨基葡糖胺（-acetyl--glucosamine，GlcNAc）具有控制疼痛、改善功能和延緩關節結構改變功效，在醫藥領域廣泛應用。劉延峰在枯草芽孢桿菌中共表達-葡糖胺-6-磷酸合成酶和-葡糖胺-6-磷酸乙?；福晒嫿℅lcNAc合成途徑，實現GlcNAc在枯草芽孢桿菌中積累。在該重組枯草芽孢桿菌基礎上，對GlcNAc合成途徑關鍵酶進行調控，采用雙啟動子系統優化GlcNAc合成途徑中關鍵酶表達，嚴謹型啟動子P調控-葡糖胺-6-磷酸合成酶表達，并抑制分支代謝途徑，獲得高產重組菌株。顧洋使用強組成型啟動子P替換葡萄糖/氫離子協同轉運蛋白載體和葡萄糖激酶編碼基因、和糖酵解途徑關鍵基因和的原始啟動子，強化自身的轉運系統，避免磷酸烯醇式丙酮酸對其轉錄水平的反饋調控。GlcN目前主要以甲殼素水解法生產，水解法消耗大量的酸堿，純化工藝復雜，存在過敏效應。相對水解法，微生物發酵法生產不受資源限制，對環境污染小，不存在過敏效應，借助合成生物學技術進行GlcN代謝途徑的移植和轉化系統強化，改造后的枯草芽孢桿菌能順利積累GlcN，并顯著提高了發酵生產GlcN的產量與生產強度。

糖胺聚糖廣泛用于臨床治療、保健品和化妝品領域，例如透明質酸（hyaluronic acid，HA）、硫酸軟骨素（chondroitinsulfate，CS）等。當前糖胺聚糖的主要生產方式是從組織提取，產量有限，不同來源的提取物分子質量差異很大，且存在穩定性差、產品純度不足等缺點?；诤铣缮飳W策略，構建工程菌進行生產可避免上述問題，還可實現產品分子質量分布的精準控制。Hubbard等發現獸疫鏈球菌（）透明質酸合酶（hyaluronan synthase，HAS）與人HAS跨膜拓撲相似，序列同一性顯著，對Se-HAS進行體外催化，將純化后Se-HAS重構為蛋白脂質體，實現了HA的體外合成。Jeong等構建了含有多種HA途徑基因組合盒的表達載體，最終將來自非洲爪蟾的HAS整合至畢赤酵母基因組，工程菌HA產量達0.8～1.7 g/L。CS廣泛分布在軟骨連結組織中，和GlcN配合使用有一定的止疼、促進軟骨再生的功效，硫酸軟骨素糖胺聚糖還是大腦中生長因子信號和神經干細胞穩態的關鍵調節因子。CS衍生物有利于原代神經細胞的神經突觸生長，He Wenqin等對4--硫酸轉移酶和6--硫酸轉移酶等關鍵酶進行修飾，成功在大腸桿菌和畢赤酵母中產出CS，為借助工程菌酶法合成CS提供了基礎?；诤铣缮飳W技術及理念構建重組工程菌生產糖胺聚糖的方式必將取代傳統動物組織提取，這能提高糖胺聚糖的使用安全性，同時降低其生產成本，為保健食品和醫藥的研發提供大量優質的原材料。

3.4 有機酸

發酵法被應用于多種有機酸生產，有機酸在醫藥領域需求廣泛，因此有機酸生產已經逐漸成為發酵產業的重要部分。莽草酸是合成抗病毒藥物奧司他韋的關鍵中間體，其衍生物具有抗腫瘤、防止血栓形成等多種功效，可以通過化學合成、微生物發酵和從某些植物中提取來獲得，由于植物提取成本高，通過發酵在重組微生物中生產莽草酸可能成為既定的優選途徑。侯建屾等利用生長依賴啟動子和去電子構建了動態分子開關，這種動態分子開關將細胞生長與莽草酸合成分開，發酵72 h后生成莽草酸14.33 g/L。Liu Chang等根據大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌遺傳密碼子使用偏好性，構建適配性增強的3-脫氫奎寧酸脫水酶元件庫，為合成生物學應用定制了新DNA序列，并獲得可用于設計代謝工程和合成生物學的莽草酸途徑人工模塊。Niu Fuxing等開發了生物傳感器介導、等離子體誘變與基因組改組相結合的菌株改良策略，通過引入外源-呋喃果糖苷酶基因，對產蔗糖大腸桿菌進行改造，得到的利用蔗糖的大腸桿菌菌株莽草酸產量達（24.64±0.32）g/L。以往從植物分離莽草酸的成本較高，產量有限，限制了其作為合成原料的應用。采用合成生物學手段，借助異源合成途徑的移植，使本不能合成莽草酸的大腸桿菌在改造后有望實現莽草酸及其代謝途徑產物的工業化生產。

-酮異戊酸是多個生物合成和化學合成領域中重要的中間體，廣泛應用于制藥和保健品行業，例如合成臨床藥物-酮酸片用于治療尿毒癥。Liu Long等在一株能夠產支鏈氨基酸氨基轉移酶、將-亮氨酸和丙酮酸轉化為-酮異戊酸的蠟樣芽孢桿菌中，利用人工神經網絡支持遺傳算法，對酶催化過程進行建模和優化，經優化發酵8 h后-酮異戊酸質量濃度達到5.63 g/L，比未優化組提高了3 倍。宋陽進行N端密碼子替換，將催化底物-亮氨酸脫氨合成-酮異己酸的-氨基酸脫氨酶活力提高24.89%。李雅婷構建微氧調控開關，協調輔酶循環，調控-酮異戊酸合成途徑和丙酮酸消耗途徑，實現了-酮異戊酸高效發酵合成。-酮己酸在食品、飼料和生物制藥工業中的應用日益增多，-酮己酸的高效生產越來越受到人們的關注，Song Yang等在大腸桿菌中，從轉錄和翻譯水平對-氨基酸脫氨酶基因的表達進行微調，以提高-酮異己酸效價，通過優化具有不同拷貝數的質粒來源、調節起始密碼子下游的信使RNA結構以及設計RBS的序列，構建的重組工程菌產-酮異己酸質量濃度最高達到86.55 g/L。-酮異戊酸、-酮己酸目前以化學合成為主，合成過程需要高成本的催化劑，生產成本較高。在傳統改造方法所構建的菌株之上，借助人工網絡的模擬計算，結合感受器和開關聯動，微調關鍵酶的表達，更為精細地對代謝途徑進行優化改造，為-酮酸的發酵工業化合成提供了新思路。

3.5 天然產物

天然產物結構復雜多樣，具有多種活性，但其天然合成途徑和代謝調控較復雜，需要對宿主合成途徑進行系統設計和改造，以提高天然產物的生物合成效率。隨著合成生物學技術日益成熟，異源表達已被廣泛應用于天然產物生產。梁蓉等利用畢赤酵母真核表達體系實現擬南芥AtPOFUT1蛋白異源表達，初步檢測明確了該重組蛋白具有-巖藻糖基轉移酶活性。Paddon等通過重新改造合成途徑過表達植物脫氫酶和細胞色素P450，使得青蒿酸在釀酒酵母中發酵產量達到25 g/L，為青蒿素化學合成的前體大量生產提供了可能。Bian Guangkai等開發了萜類化合物生物合成平臺，通過在釀酒酵母中過表達tHMG1，去除跨膜結構域，得到能高產萜類化合物菌株。Zhou Yongjin等建立模塊化工程途徑并在釀酒酵母中組裝合成次丹參酮二烯通路。Dai Zhubo等在釀酒酵母中引入不同植物來源的齊墩果酸合酶、原人參二醇合酶、原人參三醇合成酶等，構建了原人參二醇、原人參三醇和齊墩果酸的合成途徑。Yamanaka等構建了基于轉化相關重組的基因平臺，該平臺可以直接克隆、重組和異源表達沉默生物合成途徑，從而產生新抗生素，利用該方法成功表達了來自海洋放線菌糖單孢菌的非核糖體肽合成酶生物合成基因簇，并在模型表達宿主鏈霉菌中產生了二氯化脂肽抗生素他霉素A，為新天然產物發現和藥物開發開辟了途徑。通過分析天然產物生物合成途徑，它們均遵循生物合成邏輯而通過體內相關酶催化反應產生。因此，通過構建文庫和平臺，對次生代謝產物生物合成基因元件進行改造和拼裝，可人工構建天然產物的生物合成途徑，優化工程菌自身代謝，有效提高天然產物產量。

近年單純合成天然產物不再滿足人們的需要，研究者致力于改造天然產物以提高其水溶性和活性，重構合成途徑，減少其結構類似副產物，獲得高純度高活性的目標天然產物。Liu Xiaochen等在大腸桿菌中重組表達歐洲山芥來源的糖基轉移酶，并利用尿苷二磷酸-糖基轉移酶對產物進行糖基化修飾，最終獲得水溶性和生物活性顯著提高的甘草次酸-3--單葡萄糖。天然產物二聚化也是一種有助于提高活性的修飾方法，Matsuda在煙曲霉中發現天然產物Neosartorin合成基因簇，并通過一系列基因缺失實驗研究了其生物合成，還發現了用于異二聚化的P450單加氧酶接受非天然底物以提供新的Neosartorin二聚體，二聚化產物的抗菌活性較初產物有顯著提升。Liu Yiqi等在酵母中通過重新設計天然轉錄調節回路，構建了信號強度增加20 倍的葡萄糖抑制和乙醇誘導的轉錄信號擴增裝置，并利用該裝置生物合成了一種降血脂藥物中間體莫納可林J，首次構建并系統工程化了一株產抗生素二氫莫納可林L的菌株。Wang Zheng等對需鈉弧菌（）進行工程改造，通過利用誘導型啟動子表達異源酪氨酸酶基因來合成黑色素，并證明了黑色素的產生比以前報道的異源系統快得多。在重組工程菌的基礎上進行不斷的改進和調整，是天然產物發酵生產研究的前景方向。

4 結 語

合成生物學相關技術研究為構建和生產預期化合物工程菌株提供了強有力技術支撐，是發酵工業領域研究的重要方向。采用合成生物學技術構建高效微生物工程菌，能夠在保持菌體生長正常，使工業微生物在代謝穩定的基礎上提高已有的產能和生理性能。將合成生物學工具應用于定向進化，能縮短工程菌定向進化周期，增加突變體篩選效率，將其應用于代謝工程，在將生物系統作為一個整體進行工程改造前提下，通過動態控制各復雜途徑表達量，可以迅速提升產品多樣性。以開發氨基酸、GlcN等功能性成分為代表的工程菌發酵研究目前取得了顯著進展。在理論研究、技術探索和借鑒典型合成回路的基礎上，進一步擴寬合成的目標范圍、構建智能化工程菌和實現大規模生產是未來合成生物學技術的重要方向。