蠟梅SRAP-PCR反應體系的建立

步洪鳳顧振華張文斗李達

(1.常德職業技術學院，湖南 常德 415000；2.湖南農業大學風景園林與藝術設計學院，湖南 長沙 410128)

前言

蠟梅(Chimonanthus praecox)，屬蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(Chimonanthus)，中國特有的落葉灌木、傳統名花。自然分布區大致為長江流域中下游地區，四川東部以東，湖南吉首以北，河南伏牛山以南，東到江蘇、浙江，現有天然群落僅存在于川東、重慶東北部、湘西北、鄂西北[1]。蠟梅高4～5m，成簇生長；葉對生，紙質，卵狀，披針狀，頂端逐漸變鈍，全緣，有許多覆瓦狀鱗，呈黃色，呈蠟白色[2]；花期12月—次年1月，香氣濃郁；果實瘦肉多，6—7月成熟，黃似臘，香氣濃郁，是一種原產于我國的珍貴冬季冷香型園林植物，在我國已經有1000多年的栽培利用歷史，廣泛應用于我國的園林造景中[3]。

隨著分子標記技術和二代測序技術的發展，越來越多的研究人員開始使用分子標記的手段對蠟梅的遺傳多樣性進行研究。陳龍清等提取蠟梅2個自然群體內的21個單株樣品DNA進行RAPD分析，得出蠟梅的遺傳多樣性主要來自群體間的差異，而單株差異較小的結論，且這一結論與形態特征是一致的[4]；趙冰等對蠟梅AFLP分子標記的反應進行探索，發現蠟梅的DNA提取可使用改良的CTAB法，而蠟梅葉片的年齡并不影響蠟梅基因組DNA提取的使用，用MseI-EcoR I酶切組合，從168對引物中篩選出10對帶型分布均勻、多態性高且分辨能力強的引物，因而確定了適用于蠟梅AFLP反應的最佳酶切連接、預擴和選擴體系[5]，緊接著對我國蠟梅種質資源的7個野生自然群體進行鑒定，設計的3對引物，共擴增出了218條多態位點，占據所有位點的86.17%，種群基因分化系數為0.2906，同樣也得出了蠟梅的遺傳多樣性主要存在于種群間，而非群體內[6]；2008年趙冰等又使用ISSR分子標記技術對蠟梅種質資源的7個野生型和2個栽培型種群的遺傳多樣性展開了進一步的研究，使用11條引物，擴增出110條多態位點，占據了總位點的88.70%，進一步指出了蠟梅總的遺傳多樣性水平較高，不同種群間的差異十分明顯[7]。

為了探討油菜品種內含子、啟動子與間隔區之間存在不同長度的多態現象，2001年美國加州農學院作物系Li等根據第4代分子標記技術開發出一種特異性克隆標記方法，并將其命名為關聯序列擴展多態性(Sequence-Related Anplified Polymorphism，SRAP)，該方法操作簡單，結果易被重復且條帶產出效率中等，具有目標片段易克隆和測序的特點[8]。在條帶的產出率上介于RAPD分析與AFLP分析之間，產率中等。引物設計可以參考AFLP的方法，通過隨機改變引物末端的堿基組成和排序獲取新的引物，然后在原有引物上添加新的SRAP標記引物，因而不需要強調選擇引物的類型。

目前該技術在甜瓜、辣椒、棉花等的研究中均顯示出操作簡便、穩定、產率中等、在基因組中檢測位點分布均勻等特點，并在石斛屬植物、水稻、番茄、黃瓜、油茶、杜鵑花屬植物、煙草等植物研究中得到成功應用[9,11]，并在基因定位、圖位克隆、遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜、基因文庫圖譜、雜種優勢預測、比較基因組等領域得到了廣泛的應用[12]。

目前蠟梅新品種的選育主要靠播種、分株、扦插、壓條、嫁接等傳統的育種手段，育種周期長、勞力費時、信息量少，嚴重阻礙了蠟梅良種選育的進程，而SRAP能較好地克服傳統育種的缺點，不易受環境的限制，可以大大縮短蠟梅的育種年限，提高育種效率[13]。本文目的在于提取高質量的適于SRAP分析的蠟梅基因組DNA，并建立和優化適于蠟梅SRAP-PCR反應的最佳實驗體系，為這一技術在蠟梅種質資源上的理論與應用研究提供技術支持，從而加快鑒定、保護和合理利用我國現存的種質資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2020年7月，采集常德職業技術學院資源圃的蠟梅成熟葉片為試材。

1.2 主要試劑

SDS溶液、CTAB溶液、CTAB-free溶液、初提液(CHCl3∶C5H12O=24∶1)、5mol·L-1NaAc、5mol·L-1NaCl、Tris-HCl。

1.3 主要儀器

產自美國Applied Biosystems公司的Veriti 96-well Thermal Cycler PCR擴增儀；美國Carestream Health公司的Kodak Gel Logic 212凝膠成像系統；德國Hermle公司的Z323K高速冷凍型離心機；上海雙旭電子有限公司的DYY-12電泳儀、立式電泳儀；上海元析儀器有限公司的UV-2450紫外分光光度計。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA提取

DNA提取選擇CTAB溶液為主要提取試劑，具體操作流程：在碾磨時加入少許PVP-40粉末防止材料褐化，在進行裂解前加入CTAB-free buffer洗滌蠟梅中的多糖、多酚物質，以免影響DNA質量。使用2%瓊脂凝膠對提取出的DNA進行電泳檢測，然后取2μL樣液用無菌水稀釋為100μL的體系，在Eppendorf Biophotometer上測定DNA的質量濃度(選擇OD260nm/OD280nm值選項)，調節質量濃度至50ng·μL-1，-20℃保存備用。

1.4.2 PCR基本體系與擴增程序

體系為30μL的標準溶液，即150ng的模板，2.20mmol·L-1的Mg2+，1.8mmol·L-1的dNTPs，1.5mmol·L-1的引物，以及Taq酶加入量為1.8U。SRAP上游引物Me9和下游引物Em3由Invitrogen公司合成。引物序列Me9:5′-AAATTATCGATTGCAAG-3′；Em3:5′-ATGCGGTATCGATTGCAG-3′。擴增程序：在94℃進行預變性4min；94℃ 1min、35℃復性1min、72℃延長1min 5個循環；30次重復溫度提高到55℃；72℃延長5min[9]。

1.4.3 單因子試驗

根據表1中各影響因素水平，分別研究5個因素對SRAP-PCR反應體系的影響。電泳檢測后，Goldview染色，KODAK拍照檢測PCR效果。并對結果進行直觀分析與評價。

表1 SRAP-PCR反應中的影響因素水平

2 單因子試驗結果分析

2.1 模板濃度對SRAP-PCR結果的影響

適宜的模板含量是提高擴增保真率的基礎。選擇合適的模板DNA濃度對于SRAP擴增至關重要，模板量過少會使PCR產物產率過低或者得不到所需條帶，但模板量過多可能會導致PCR產物中出現非特異性條帶，同時還造成了DNA模板的浪費。在本試驗中，設計了50ng、100ng、150ng、200ng、250ng依次遞增的5個模板DNA濃度梯度。如圖1所示，5個不同濃度DNA模板反應體系均得到了較為明顯的條帶，但高分子條帶隨著模板DNA量的增加引物二聚體的含量越來越高，同時高分子條帶隨著模板DNA濃度的增加呈現出先增高后降低的趨勢，并在150ng濃度時擴增條帶最多且清晰，因此本研究認為，150ng是該試驗體系的最佳模板含量。

圖1 模板濃度對SRAP-PCR的影響注：M為標準分子量1000bp plus；編號1～5的處理編號同表1。

2.2 Mg2+濃度對SRAP-PCR結果的影響

Mg2+是Taq酶活化的主要因素，Mg2+在反應物中的濃度對PCR的特異性及擴增效果有顯著影響。其不僅會影響到酶的活性和擴增的精確度，還會產生對引物與模板的結合效果差、模板與產物的解鏈效率低、非特異性產物的生成以及二聚物的生成等方面的問題。因此Mg2+的含量能對SRAP產物含量產生直接的影響，Mg2+缺乏時Taq酶的活性會下降，而且dNTP還會競爭Mg2+，dNTP的濃度會進一步抑制Taq酶的活性。在本試驗中，Mg2+的用量選取0.7mmol·L-1、1.0mmol·L-1、1.3mmol·L-1、1.6mmol·L-1、1.9mmol·L-1、2.2mmol·L-1、2.5mmol·L-17個梯度。如圖2所示，Mg2+濃度<1.9mmol·L-1或者>2.2mmol·L-1時，擴增條帶少且不清晰。考慮到Mg2+濃度過低不利于酶的激活，Mg2+濃度太高又容易產生非特異條帶，因此該試驗最適Mg2+濃度為2.2mmol·L-1。

圖2 Mg2+濃度對SRAP-PCR的影響注：編號1～7的處理編號同表1；M為標準分子量1000bp plus。

2.3 dNTPs濃度對SRAP-PCR結果的影響

dNTPs的含量對PCR的擴增有著直接影響作用。dNTP作為PCR的反應底物，同時也會參與到Taq酶的Mg2+的爭奪，所以在PCR過程中，必須將dNTP調節至適宜的水平以獲得最優的擴增結果。當dNTPs的含量較低時，其擴增產物明顯降低；當濃度太高時，誤差增大，并與Taq酶發生競爭，導致Mg2+含量降低，導致Taq酶活力降低，PCR的反應效率下降，甚至阻礙了整個反應過程。在本試驗中，dNTPs的用量選取0.6mmol·L-1、1.0mmol·L-1、1.4mmol·L-1、1.8mmol·L-1、2.2mmol·L-15個梯度。如圖3所示，dNTPs的5種不同濃度含量對擴增結果影響顯著，在0.6～2.2mmol·L-1，均有條帶出現，0.6～1.4mmol·L-1擴展條帶較1.8mmol·L-1擴增的條帶數少，清晰度也較差，同時2.2mmol·L-1擴展條帶較模糊，按照條帶豐富穩定、清晰的原則，dNTPs適宜濃度為1.80mmol·L-1。

圖3 dNTPs濃度對SRAP-PCR的影響注：M為標準分子量1000bp plus；編號1～5的處理編號同表1。

2.4 引物濃度對SRAP-PCR結果的影響

在PCR特異反應過程中，引物起著十分關鍵的作用，高的引物濃度將導致不特定的突變和擴增，并能提高引物間的二聚化幾率；如果引入的引物質量太低，與DNA的結合效率就會下降，從而導致產物產率下降[11]。在本試驗中，引物的用量選取1.0mmol·L-1、1.5mmol·L-1、2.0mmol·L-1、2.5mmol·L-1、3.0mmol·L-15個梯度。如圖4所示，當引物的濃度增加時，條帶亮度會出現變化，當引物的密度為1.0～3.0mmol·L-1時，條帶清晰可見。基于以上條件分析，1.5mmol·L-1為最適SRAP-PCR引物濃度。

圖4 引物濃度對SRAP-PCR的影響注：編號1～5的處理編號同表1；M為標準分子量1000bp plus。

2.5 Taq酶濃度對SRAP-PCR結果的影響

Taq的濃度和質量是影響基因擴增效果的關鍵因素。過低的Taq會使放大效率下降；而在較高濃度下，PCR的穩定性會下降，且會產生非特異的擴增區，從而產生偽陽性，即反應體系中的亮帶并非擴增條帶。在本試驗中，Taq酶用量選取0.6U、0.8U、1.0U、1.2U、1.4U、1.6U、1.8U 7個梯度。由圖5可以看出，0.6～1.8U的Taq酶均可擴增出條帶，在1.4～1.8U時，隨著Taq酶活性單位的增加條帶亮度增加，特別以1.8U時效果最佳，故將1.8U作為最優Taq酶用量。

圖5 Taq酶對SRAP-PCR的影響注：編號1～7的處理編號同表1；M為標準分子量1000bp plus。

3 結論

本試驗采用CTAB洗滌法提取蠟梅成熟葉片的DNA能滿足SRAP-PCR擴增的要求。單因子試驗認為，SRAP-PCR的最優反應體系為150ng的模板濃度，2.20mmol·L-1的Mg2+濃度，1.8mmol·L-1的dNTPs濃度，1.5mmol·L-1的引物濃度，1.8U的Taq酶用量。

近年來，由于植物分子生物學技術的高速發展，以RAPD、AFLP、SSR及ITS為代表的分子標記技術被廣泛應用于藥用植物的分子鑒定和功能基因的研究。其中，RAPD技術工藝簡便，但具有穩定性差、擴增產率低等缺點；AFLP技術雖具有很高的擴增產率，但其操作步驟繁瑣、難以實現自動化；SSR標記具有中等產率和產物大多為共顯性標記的優點，然而該標記既費時又昂貴；ITS序列分析在分子鑒別上的優點突出，但其測序資金耗費大[14]。而SRAP技術則是將RAPD與AFLP技術的優勢有機地結合起來，不僅可以解決RAPD重復率低的問題，而且可以解決AFLP技術復雜、成本昂貴的問題，同時具有操作簡單、快速、低成本、可靠性好、重復性好及易于測序的特點，因而很快得到了世界范圍內的分子生物學研究[15]。

本實驗建立了適用于蠟梅穩定可靠、重復性強的SRAP反應體系，但也不可避免地存在主觀因素介入而導致的試驗誤差，因此，建立一套更為客觀的科學評價PCR擴增結果的評價標準，將能更好地構建PCR擴增體系。