光照和避光條件下石灰性水稻土Fe氧化還原與Cu活性關系研究

董樂恒 ，王旭剛，陳曼佳*，王子豪，孫麗蓉，石兆勇，吳琪琪

1.河南科技大學農學院，河南 洛陽 471023；2.廣東省科學院生態環境與土壤研究所/華南土壤污染控制與修復國家地方聯合工程研究中心/廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650

硫酸銅及其與石灰水混合物，是常見的高效殺菌劑，被長期應用于果樹疾病的預防及治療（Favaro et al.，2017），水產養殖業中車輪蟲、斜管蟲等寄生蟲的防治（Tavares-Dias，2021），稻田的除藻（Ohadi et al.，2021）等。硫酸銅的廣泛應用，已導致土壤中 Cu積累，嚴重污染土壤（Santana，1994；Lamichhane et al.，2018；周會程等，2020）。全國土壤污染調查公報顯示（2014），中國耕地土壤重金屬污染嚴重，Cu的點位超標率占2.1%，其中輕度、中度、重度污染分別占0.3%、0.15%、0.05%。Cu(Ⅱ)離子在土壤介質中可與有機物、礦質和微生物發生復雜的生物化學作用，使得重金屬的賦存形態發生改變（Kumpiene et al.，2008）。例如，調節土壤的pH和有機質含量升高可使Cu(Ⅱ) 離子由水溶態和交換態向有機態和殘渣態轉化（郝漢舟等，2010；劉勇等，2019）；土壤中加入鈍化劑如鉀長石、硫酸鈣、碳酸鈣等混合物能顯著降低弱酸提取態Cu含量（朱先強等，2017）。

Fe是土壤中豐度最高的可變價過渡金屬元素，具有較強的地球化學活性，是土壤中重要的吸附劑和氧化還原劑，可直接影響重金屬的鈍化、固定等環境行為。在淹水厭氧條件下，土壤中的Fe(Ⅲ) 可在微生物的作用下被還原為Fe(Ⅱ)（Lovley et al.，2004；Weber et al.，2006；馬小蘭等，2012），異化鐵還原菌是主要的鐵還原轉化媒介；在此Fe(Ⅲ) 還原過程中，鐵還原菌以土壤中有機物為電子供體，以鐵氧化物中Fe(Ⅲ) 為電子受體，使土壤中含鐵礦物溶解，晶相穩定、結晶度高的鐵氧化物發生異化還原反應，并重新組合形成結晶度低或無定型的鐵氧化物（Kappler，2005），而原本被吸附或共沉淀的重金屬隨著礦物的溶解而被釋放（Frierdich et al.，2011；Bingjie et al.，2014）。同時，厭氧條件下，鐵氧化菌均能使 Fe(Ⅱ) 氧化為 Fe(Ⅲ)（Schnell et al.，1993）。在 Fe(Ⅱ) 氧化過程中，鐵氧化菌能以還原性Fe(Ⅱ) 為電子供體，以胞外氧化性物質為末端電子受體，通過氧化Fe(Ⅱ) 偶聯電子受體還原，從這一過程中貯存生命活動所需的能量（Neubauer et al.，2002），Fe(Ⅱ) 被氧化生成具有良好吸附性的鐵（氫）氧化物，如水鐵礦、針鐵礦、菱鐵礦和赤鐵礦等，原本被吸附在礦物表面的重金屬在二次礦物形成的過程中被固定在結晶度更高的鐵礦物中，從而影響重金屬的形態和歸趨（Latta et al.，2012）。

研究表明，Cu在土壤中的環境行為涉及一系列的氧化還原反應，尤其與土壤中Fe的氧化還原循環過程密切相關（Davranche et al.，2000；Balint et al.，2015）。Matocha et al.（2005）研究發現，厭氧酸性條件下，Cu(Ⅱ) 可被 Fe(Ⅱ) 還原成 Cu。Balint et al.（2015）研究不同氧化還原條件下土壤中Cu活性發現，交替的氧化還原條件會促使Fe、Mn和有機質的氧化還原過程，從而進一步影響Cu在土壤中的遷移轉化；在有氧條件下，鐵錳氧化物的還原溶解再沉淀有利于Cu的釋放和遷移。由此可知，土壤中Fe的氧化還原必然會影響重金屬Cu的環境行為。

在稻田生態系統中，光照和避光條件對土壤氧化體系起重要的影響，如與水生生態系統相關的光合微生物在光照條件下的產氧過程會使 Fe(Ⅱ) 氧化（孫麗蓉等，2008），從而對重金屬的形態產生影響。石灰性水稻土作為中國北方重點的土壤類型（Shen et al.，2004），目前關于光照和避光條件下，其Fe的氧化還原過程及其與Cu的活性及形態關系仍缺乏系統性的研究。因此，本研究通過模擬不同Cu污染程度（輕、中、重度）土壤，構建恒溫厭氧泥漿培養試驗體系，分析避光和光照條件下的Fe的氧化還原轉化動力學和Cu的活性和形態的變化，以及C轉化，探索Fe的氧化還原耦合Cu轉化的行為機制，為石灰性土壤中重金屬的環境行為提供基礎理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試樣品為石灰性水稻土，采自河南省孟津縣（34°48′21″N，112°39′51″E），按多點采樣的方式采集深度為 0—15 cm的土壤，土壤樣品在實驗室自然風干后，去除動植物殘體，過0.850 mm篩。供試土壤的理化性質采用常規指標分析方法進行測試（魯如坤，1999）：pH 8.16±0.08，有機質 (14.87±0.10)mg·g-1，全氮 (1.49±0.01) mg·g-1，全磷 (1.03±0.05)mg·g-1，游離鐵 (10.24±0.67) mg·g-1，無定形鐵(2.20±0.17) mg·g-1，陽離子交換量 (14.95±0.29)cmol·kg-1。

Cu污染土壤制備：依據《土壤環境質量評價分析》，當pH＞7.5時，Cu的評價標準值（Sip）為100 mg·kg-1。運用單項污染指數法對土壤中Cu污染的嚴重程度進行評價，計算公式為：

式中：

Pip——土壤中污染物的單項污染指數；

Ci——調查點位土壤中污染物的實測濃度；

Sip——污染物i的評價標準值。當Pip≤1時，污染評價為無污染；1＜Pip≤2 為輕微污染；2＜Pip≤3 為輕度污染；3＜Pip≤5為中度污染；Pip＞5為重度污染。因此，將所采集的土壤樣品，通過外加CuSO4·5H2O溶液制備輕、中、重度污染土壤，其污染物質量分數分別為 256、384、512 mg·kg-1，其Pip分別為 2.56、3.84、5.12。

1.2 試驗設計

本試驗為泥漿恒溫厭氧培養。按照1∶1的水土比稱取3.00 g風干土樣于10 mL西林瓶中，然后加入3 mL不同濃度的CuSO4·5H2O溶液或超純水，分別配成Cu2+質量分數為256 mg·kg-1（輕度污染）、384 mg·kg-1（中度污染）和 512 mg·kg-1（重度污染）的污染土壤樣品以及空白對照樣品，共254個，蓋上橡膠塞，用高純氮氣充氣10 min，加鋁蓋密封，最后將1/2樣品用錫紙包裹后放置于隔水式恒溫培養箱[ (30±1) ℃]中避光培養，另外 1/2樣品放置于光照培養箱[(30±1) ℃]中光照培養。每隔一段時間進行取樣，測定樣品中可浸提態Fe(II) 和不同活性Cu。本實驗采用破壞性采樣，每個樣品設置3個重復，文中所示數據均為數據平均值。

1.3 分析方法

可浸提態 Fe(II) 樣品按照培養設定的時間分別在第1、2、3、5、7、9、12、15、20、25、30 天進行取樣，取出樣品充分搖勻后吸取0.4 mL泥漿于10 mL離心管中，加入4.6 mL 0.5 mol·L-1HCl，充分搖勻后放入隔水式恒溫培養箱 [(30±1) ℃]中浸提24 h，浸提液使用 0.22 μm 濾膜過濾后采用鄰菲羅啉比色法進行測定。采用0.5 mol·L-1HCl和DTPA溶液對第30天樣品進行提取，分析體系中活性Cu的含量（Maiz et al.，2000）；同時，利用修正BCR提取分析體系中不同形態（包括弱酸提取態、可還原態和可氧化態）Cu的含量（Rauret et al.，1999）；Cu的濃度用原子吸收分光光度法進行測定。溶液中可溶性碳以超純水及按V(water):m(soil)=1∶5的比例浸提，TOC分析儀（孫麗蓉等，2013）（島津 TOC-VCPH，N2載氣 150 mL·min-1，680 ℃催化燃燒，非色散紅外檢測）測定。

重金屬Cu的BCR法提取及分析：培養結束后將反應樣品充分搖勻，吸取2 mL泥漿于50 mL離心管中，取1.00 g風干土樣于50 mL離心管中作空白對照。（1）弱酸提取態：向裝有樣品的50 mL離心管加入40 mL 0.1 mol·L-1HOAc溶液，在恒溫振蕩器中以 (22±0.5) ℃的溫度振蕩16 h，將振蕩完成后的樣品以3000 r·min-1離心20 min，收集其上清液測定弱酸提取態 Cu的濃度。（2）可還原態：向上一步離心后剩余的固體中加入40 mL 0.5 mol·L-1NH4OH·HCl溶液，用硝酸調其pH至1.5，然后在恒溫振蕩器中以 (22±0.5) ℃的溫度振蕩16 h，將振蕩完成后的樣品以3000 r·min-1離心20 min，收集其上清液測定可還原態Cu的濃度。（3）可氧化態：向上一步離心后剩余的固體中加入10 mL H2O2（pH為2—3），充分搖勻后靜置1 h，隨后在 (85±2) ℃水浴鍋中水浴1 h，再加入10 mL H2O2于 (85±2) ℃水浴1 h，然后加入50 mL 1 mol·L-1NH4OAc溶液，在恒溫振蕩器中以 (22±0.5) ℃的溫度振蕩16 h，將振蕩完成后的樣品以3000 r·min-1離心20 min。收集其上清液測定可氧化態Cu的濃度。

1.4 數據處理

避光條件下，Fe(Ⅲ) 還原過程采用 Logistic方程進行擬合（王旭剛等，2018）：

其中：

a——鐵還原容量；

b——一個擬合參數；

k——異化鐵還原速率；

Ct——體系中t時刻體系中可浸提態Fe(Ⅱ) 的含量，Fe(Ⅲ) 最大還原速率μmax=0.25ak。

光照條件下，Fe(Ⅱ) 的氧化率為 Fe(II) 的氧化量與 Fe(Ⅱ) 最大積累量之商。其中，Fe(II) 的氧化量為 Fe(Ⅱ) 最大積累量與培養結束后 Fe(Ⅱ) 積累量之差；Fe(Ⅱ) 最大積累量為在所擬定的采樣時間內測得的Fe(Ⅱ) 最大值。

數據應用Microsoft Excel 2016和Origin 9.0進行分析處理；應用SPSS 20.0進行方差分析，其中字母 a、b、c表示不同處理間差異達到顯著水平（P＜0.05）。

2 結果

2.1 Fe的氧化還原動力學

對不同培養條件下，石灰性土壤中Fe的氧化還原過程中可浸提態 Fe(Ⅱ) 的含量進行檢測分析（圖1）。由圖1a可知，避光培養條件下，不同Cu污染程度石灰性土壤中 Fe的氧化還原過程主要表現為Fe(Ⅲ) 的還原，所有處理中可浸提態 Fe(Ⅱ) 含量均隨反應進行呈先快速增加后趨于平穩。在反應 30 d后，對照土壤中生成了9.48 mg·g-1可浸提態Fe(Ⅱ)；當土壤受到Cu污染時，可浸提態Fe(Ⅱ) 的產生量未受到顯著影響，其質量分數介于9.78—10.84 mg·g-1。此外，可浸提態 Fe(Ⅱ) 的動力學曲線符合微生物生長曲線Logistic方程，各參數如表1所示。由表可知，原始空白對照土壤中，Fe(Ⅲ) 最大還原速率為0.57 mg·g-1·d-1；隨著 Cu污染程度的加深，土壤中Fe(Ⅲ) 的最大還原速率受到不同程度的抑制，輕、中和重度 Cu污染土壤的最大 Fe(Ⅲ) 還原速率分別下降到 0.50、0.47、0.39 mg·g-1·d-1，與空白對照相比，分別下降了12.28%、17.54%和31.58%。

圖1 避光（a）和光照（b）條件下0.5 mol·L-1可浸提態Fe(Ⅱ)含量的變化Figure 1 Change of 0.5 mol·L-1 extracted Fe(II) concentration during incubation under dark (a)and light (b) conditions

表1 避光培養鐵還原過程Logistic方程擬合參數Table 1 Fitting parameters of logistic equation for iron reduction under dark condition

光照培養條件下，不同污染程度土壤樣品的可浸提態 Fe(Ⅱ) 含量則隨反應進行呈現先增加后降低趨于平穩的趨勢（圖1b）。對照處理中，反應前3天表現為Fe(Ⅲ) 的還原，可浸提態Fe(Ⅱ) 的產生量為 7.68 mg·g-1，反應 30 d 后下降為 4.72 mg·g-1，Fe(Ⅱ) 的氧化率為38.5%。當土壤受到Cu污染時，其Fe(Ⅱ) 氧化開始時間推后至反應第5天；輕、中、重度Cu污染處理下，可浸提態Fe(Ⅱ) 的產生量分別為 7.35、6.92、6.47 mg·g-1；反應 30 d 后分別下降為 6.06、5.58、5.33 mg·g-1，Fe(Ⅱ) 的氧化率分別為17.6%，19.4%、17.6%。由此可見，Cu污染可影響土壤的氧化還原過程，與對照處理相比，抑制了Fe(Ⅱ) 氧化的過程，但不同Cu污染程度處理之間，Fe(Ⅱ) 氧化率未有顯著性差異。

2.2 反應前后水溶性碳轉化

微生物是鐵氧化還原循環過程的主要驅動力，小分子有機碳和無機碳分別是鐵還原和鐵氧化菌生長的關鍵因子，為此，本研究同時分析了反應前后水溶性碳含量的變化（圖2）。原始土壤樣品的水溶性無機碳（WSIC）和有機碳（WSOC）分別為88.98、258.3 mg·g-1。避光反應 30 d，無機碳含量提高到301.15—316.5 mg·g-1，有機碳質量分數則降低為111.5—119.25 mg·g-1。而光照條件反應30 d后，無機碳質量分數下降到79.56—100.84 mg·g-1，但與反應前相比，未有顯著差異；而有機碳質量分數則顯著降低到 77.07—139.55 mg·g-1。

圖2 水溶性無機碳和有機碳含量的變化Figure 2 Changes in water-soluble inorganic and organic carbon concentration

2.3 Cu的活性變化

為研究石灰性水稻土鐵氧化還原過程中Cu的活性以及形態轉化行為，本研究分析了反應前后土壤中0.5 mol·L-1HCl溶液和DTPA提取態Cu，以考察Cu的活性。反應前，空白對照和輕、中、重度Cu污染土壤中0.5 mol·L-1HCl溶液可提取態Cu質量分數分別為 11.70、267.70、395.70、523.70 mg·kg-1，DTPA可提取態Cu質量分數分別為5.43、261.43、389.43、517.43 mg·kg-1。外加的 Cu(Ⅱ) 均以活性Cu形式存在于土壤中。培養30 d后，各處理Cu含量如（圖3）所示。無論避光與否，對照處理中，Cu的活性基本未發生變化。避光條件下，輕、中、重度Cu污染處理中，0.5 mol·L-1HCl溶液可提取態 Cu質量分數分別下降到 0.96、1.29、0.99 mg·kg-1，下降比例高達 99.6%以上（圖3a）。光照條件下，0.5 mol·L-1HCl溶液可提取態Cu也有一定程度的下降，分別下降到 193.3、292.5、403.5 mg·kg-1，降幅為23%—27.8%（圖3a）。類似地，反應30 d后，體系中DTPA提取態Cu呈現下降趨勢（圖3b）。避光條件下，輕、中、重度Cu污染處理中，DTPA提取態 Cu分別下降到 10.29、13.92、15.67 mg·kg-1，下降比例高達96.1%（圖3a）。光照條件下則分別下降到 66.75、95.75、121.8 mg·kg-1，降幅達74.5%以上（圖3b）。由此可見，反應30 d后，尤其是避光條件下，土壤中有效態Cu活性均降低，大部分游離態Cu轉化為低活性Cu。

圖3 培養結束各處理Cu含量Figure 3 Cu concentration of each treatment at the end of incubation

為進一步分析 Cu在體系中的轉化，本研究以中度Cu污染為例，繼續分析了弱酸提取態、可還原態和可氧化態Cu的含量（圖4）。培養前中度污染土壤樣品中，弱酸提取態、可還原態和可氧化態Cu質量分數分別為 384.64、6.66、5.29 mg·kg-1。反應 30 d后，避光條件下，基本不存在弱酸提取態Cu，可還原態Cu和可氧化態Cu質量分數分別從6.66、5.29 mg·kg-1升高為 209.9、138.2 mg·kg-1，分別增長了30.5倍和25.1倍。光照條件下，弱酸提取態Cu質量分數為21.2 mg·kg-1，與培養前相比下降了94.5%，可還原態Cu和可氧化態Cu質量分數分別 198.9 mg·kg-1和 127.0 mg·kg-1，分別增長了28.9倍和18.3倍。由此可見，無論是避光培養還是光照培養均能促進弱酸提取態Cu向可還原態和可氧化態Cu轉變，降低土壤中Cu活性，且避光條件下效果更加顯著。

圖4 中度Cu污染土壤培養30 d后不同形態Cu含量Figure 4 Cu concentration of different forms in medium polluted soil after incubation 30 days

3 討論

3.1 鐵氧化還原過程對Cu活性的影響

土壤中 Fe的氧化還原過程對重金屬的形態轉化以及有效性有著重要的影響，已有研究表明，在鐵還原過程中，鐵還原微生物能夠通過自身的代謝活動，將（類）金屬如As、Mn、Cr等作為電子受體（供體）從而改變其價態（王春等，2020；錢子妍等，2021）。在本實驗中，Fe的氧化還原過程對Cu的活性有著重要的影響。通過對DTPA可提取態Cu的減少量以及HCl可提取態Cu的減少量與Fe(Ⅲ) 的最大還原容量進行相關性分析發現，其二者與鐵的還原容量之間存在著顯著的正相關關系（圖 5），其原因可能在于，隨著 Fe(Ⅲ) 被還原為Fe(Ⅱ)，Fe(Ⅱ) 與鐵氧化物形成配體，具有很強大的吸附性（Tessier et al.，1996），從而吸附Cu(Ⅱ)，降低其活性；同時，Fe(Ⅱ) 可與Cu(Ⅱ) 發生交互反應，促使Cu的老化（Tao et al.，2017）。Cu由活性狀態向可氧化態和可還原態轉變（圖3—4）。此外，我們發現在此過程中，體系中水溶性無機碳的增加量與DTPA可提取Cu的減少量以及HCl可提取Cu的減少量之間存在極顯著的正相關關系（圖5）。眾所周知，微生物介導的異化鐵還原過程中，微生物能以水溶性有機碳為電子供體，產生水溶性無機碳，可與土壤中Cu(Ⅱ) 結合，生成難溶的CuCO3，從而降低了Cu的活性。在本試驗中，光照條件下Cu的活性降低量低于避光條件下，且光照條件可還原態Cu和可氧化態 Cu分別比避光條件少 5.25%和8.10%，這可能是由于，在光照培養后期，光合細菌如藍藻等以光照為能量來源，水溶性無機碳為電子受體，從而限制了CuCO3的形成，抑制Cu活性的降低。

圖5 Cu活性與鐵最大還原容量和水溶性無機碳（WSIC）增加量相關性Figure 5 Correlation between Cu activity and iron max reduction capacity and increase of water-soluble inorganic carbon (WSIC)

3.2 避光/光照條件 Cu污染程度對鐵氧化還原的影響

Fe的氧化還原過程既包含微生物參與的過程，也包含化學過程。已有的研究表明，淹水條件下，土壤的鐵還原過程由微生物介導的異化鐵還原過程起主導作用（徐麗娜等，2009）。

避光厭氧條件下，異化鐵還原微生物能以水溶性有機碳為電子供體，Fe(Ⅲ) 氧化物為電子受體傳遞電子，使得Fe(Ⅱ) 含量隨培養時間的增加而逐漸增加，最終趨于穩定（圖1a），同時促進了有機碳的礦化，培養30 d后土壤中水溶性有機碳含量降低了53.8%—56.8%，水溶性無機碳含量增加了2.4—2.6倍（圖2）。當土壤中受到Cu污染時，土壤Fe(Ⅲ)的最大還原速率受到一定程度的抑制（表 1），對Fe(Ⅲ) 的最大還原速率與 Cu的污染程度的相關性進行統計分析，結果發現，石灰性土壤的最大鐵還原速率與土壤中Cu的含量之間存在著顯著的負相關關系（r2=0.904，P=0.044）（圖6）。本實驗中，Fe的氧化還原過程由微生物起主導作用，與微生物尤其是鐵氧化/還原菌活性密切相關。然而 Cu(Ⅱ) 可以通過與細胞內的酶結合使細胞失活，有研究表明，土壤中微生物生物量氮和碳與有效銅含量呈顯著負相關關系（王秀麗等，2002）。Cu(Ⅱ) 添加量在50 mg·kg-1時會對土壤微生物活性產生抑制作用（吳春艷等，2006），在400 mg·kg-1時對土壤微生物產生顯著毒害作用（王靜等，2010）。本實驗中，外源添加 Cu(Ⅱ) 含量在 65—130 mg·kg-1之間，隨著Cu污染程度的加深，對鐵還原微生物的毒害增強，從而在一定程度上抑制了Fe(Ⅲ) 的還原。其次，外加的Cu(Ⅱ) 可吸附在鐵氧化物表面，阻礙了鐵還原微生物與鐵氧化物的直接接觸，抑制了Fe(Ⅲ) 還原過程，從而導致Fe(Ⅲ) 的最大還原速率隨著Cu污染程度的增加而逐漸減小。

圖6 Cu添加量和最大還原速率相關性Figure 6 Maximum reduction rate Cu content is correlated with maximum reduction rate

光照厭氧條件下，不同程度Cu污染均表現為培養前期可浸提態Fe(Ⅱ) 含量逐漸增加，而隨著培養的進行，被還原的Fe(Ⅱ) 再次被氧化；然而隨著Cu污染程度的加深，Fe(Ⅱ) 的氧化率逐漸降低，研究表明，光照厭氧條件下，Fe(Ⅱ) 的氧化主要是由于土壤中的微生物作用而導致的，如土壤中存在藍細菌等光合產氧菌，其在光照條件下，能產生氧氣，從而導致Fe(Ⅱ) 的直接氧化（孫麗蓉等，2013），因此，隨著Cu污染程度的加深，抑制了Fe(Ⅱ) 的氧化過程，此外，光照培養結束后，體系中水溶性有機碳含量顯著降低，而水溶性無機碳含量與培養前無顯著變化。Wang et al.（2002）研究石灰性水稻土光照條件下培養30 d后發現，體系有機碳含量降低，藍藻的相對豐度從2.8%增加到11.7%。由此推測，在本研究中，在Fe(Ⅱ) 氧化過程中，光合細菌以水溶性有機碳為電子受體，Fe(Ⅱ) 氧化物為電子供體傳遞電子，消耗了水溶性無機碳。

4 結論

本研究通過對不同Cu污染程度石灰性土壤中Fe的氧化還原過程及Cu的活性進行系統性研究，結果發現，避光條件下，石灰性土壤主要發生異化鐵還原過程；而在光照條件下，先發生鐵還原，后發生鐵氧化的過程；鐵還原/氧化菌是介導土壤鐵氧化還原過程的主要驅動力。不同程度Cu污染均會對Fe的氧化還原過程產生抑制作用且隨著Cu污染程度的加深，抑制作用逐漸增強；Fe的氧化還原過程亦能夠促進土壤中Cu由弱酸提取態向可還原態和可氧化態轉變，降低土壤中Cu的活性。