響應面法優化發酵對桑葉蛋白含量的影響

樊 杰，郝祥蕊，吳小珍，李 慧，張紅艷，馮鎮泰

(上海農樂生物制品股份有限公司，上海 201419）

桑葉在我國種植面積十分廣闊，其具有非常高的營養與應用價值。經權威機構檢測，新鮮的桑枝葉蛋白質含量在12.8%～28%之間，干桑葉粉中粗蛋白質的含量也在10.6%以上，且氨基酸種類齊全，維生素含量也十分豐富，同時還含有許多生物活性成分。國內外學者對桑葉飼用的研究十分廣泛。發酵后的桑葉貯藏時間明顯加長且營養物質顯著增加，而有毒物質被大量消除，提升了飼料品質和口感。研究發現，采用菌種協同發酵處理，可以提高植物飼料的蛋白含量和營養品質。桑葉經發酵后，粗纖維等難以吸收的大分子物質含量顯著降低，利于動物吸收的小分子營養物質等顯著升高，同時，桑葉中的生物活性物質的含量及組成也得到了修飾和優化，極大地改善了動物的適口性。目前市面上蛋白桑發酵劑品種很多，從功用上分為乳酸菌發酵劑和復合發酵劑。復合發酵劑含有多種益生霉菌（米曲霉、黑典霉)、軟酸菌(植物乳酸菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳酸菌等)和酵母菌，可產生多種消化酶，降低桑葉中的粗纖維含量，從而增加了桑葉飼料中的粗蛋白質含量。徐丹等發現，混合發酵桑葉粗蛋白含量有明顯提升，增加了23.26%。葉添梅等采用固態發酵桑葉粉的方法，發酵后蛋白質含量達到27.22%。

Plackett-Burman 是一種基于非完全平衡塊原理的近飽和的兩水平試驗設計方法。通過N 次試驗最多可以考察N-1 個因素，用最少試驗次數可以從眾多因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個主效因子，響應面分析是利用統計學和數學模型的方法對需要優化的多因素系統進行建模和分析，Box-Behnken 試驗設計是其中擬合模型之一，目前常被用于生物發酵過程培養基和培養條件的優化。由于多種菌混合培養，易出現污染、混菌比例難控制等問題，而枯草芽孢桿菌被允許用于動物養殖，應用其進行試驗可以避免這些問題因擾。因此，本研究選擇實驗室已鑒定出的枯草芽孢桿菌發酵桑葉，利用響應面法摸索發酵工藝和發酵條件，提高蛋白含量，為飼料桑產業的后續開發，桑蛋白的利用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 桑葉 2021 年8 月在上海農樂生物制品股份有限公司試驗桑園采摘桑葉（品種為‘ 豐馳桑’）。挑選大小勻稱、無明顯病蟲害的葉片，用清水沖洗干凈，自然晾干表面水分后去除葉柄，在55 ℃下干燥24 h，利用粉碎機粉碎后過80 目篩，常溫保存備用。

1.1.2 供試菌株 枯草芽孢桿菌hij158(Bacillus subtilis)，由本實驗室分離保藏。

1.1.3 種子液培養基 牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏3.0 g，骨蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，加蒸餾水定容至1 L，調節pH 值至7.0～7.2)。

1.2 發酵種子液的制備

選取直徑約為3 mm 的菌落進行平板劃線，28 ℃過夜培養，選擇單菌落挑取1 環至裝有50 mL 培養基的三角瓶（250 mL）中，200 r·min，培養18 h，制成菌株種子液，測定其菌落形成單位（CFU），該種子液CFU 為5×10個·mL。

1.3 桑葉發酵的基礎方法

在100 mL 三角瓶中加入20 g 粉碎后的桑葉粉，將不同的營養成分加入蒸餾水中進行溶解，然后將桑葉粉與上述溶液進行混合，混合比例根據試驗設計要求進行，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入適量的種子液，攪拌混勻后進行發酵。發酵條件及各成分比例根據試驗要求進行設計。

1.4 粗蛋白質的測定

參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》測定氮含量，相關結果乘以蛋白質折算系數6.25，計算粗蛋白含量。

1.5 桑葉發酵工藝條件的優化試驗

1.5.1 Plackett-Burman（PB）試驗設計 根據前期試驗結果，利用PB 設計對影響桑葉發酵后粗蛋白含量的11 個因素進行篩選，包括蔗糖（A）、檸檬酸鈉（B）、硫酸銨（C）、磷酸氫二鉀（D）、磷酸二氫鉀（E）、硫酸鎂（F）、發酵時間（G）、發酵溫度（H）、pH 值（I）、接種量（J）、料水比（K）。各因素設置高（+1）和低（-1）2 個水平。共設計12 組測試，每組3 個重復，響應值為發酵后測得的粗蛋白含量。根據各因素的貢獻率大小進行顯著因素篩選，選擇效果更顯著的因素進行下一步試驗。

1.5.2 最陡爬坡試驗 根據PB 試驗篩選出的因素，以各因素的正負效應、大小進行爬坡試驗，確定中心點，得到最大響應值。

1.5.3 Box-Behnken 試驗設計 最陡爬坡試驗所得最佳響應區域作為Box-Behnken 試驗設計的中心點，各因素取3 個水平，以（-1，0，1）表示，設計包括了5 個中心點（0，0，0），共17 個組合的響應面試驗。各處理3 次重復。

1.6 結果驗證和數據統計分析

根據Box-Behnken 試驗結果，進行方差分析，并擬合線性回歸方程，檢驗擬合方程的符合程度；利用擬合方程獲得最佳培養條件，并在最佳培養條件下進行驗證試驗。數據處理和作圖使用Excel 2016，統計分析使用Design Experts 10 和IBMSPSS 22。試驗結果以平均值±標準差形式表示。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 設計

在Plackett-Burman 設計試驗中，12 個組的粗蛋白含量在183.1～226.8 mg·g，通過統計軟件分析確定最優配方組合及條件為組合2，此時發酵條件為蔗糖8%、檸檬酸鈉1%、硫酸銨1%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、發酵時間10 d、發酵溫度28 ℃、初始pH 值為8、接種量為15%、桑葉粉與混合溶液質量體積比為1∶0.5(W/V)，在此條件下發酵得到的粗蛋白含量為226.8 mg·g（表1）。

表1 Plackett-Burman 設計各因素得編碼值及試驗結果

由表2 可以看出，硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、發酵時間、接種量對提高桑葉發酵后粗蛋白含量具有正效應，蔗糖、檸檬酸鈉、硫酸鎂、溫度、pH值、料水比具有負效應。影響因素最大的分別為溫度、硫酸銨和蔗糖。發酵溫度顯著影響菌種的生長速度，提供充足的碳源和氮源能顯著促進菌株的生長。

表2 Plackett-Burman 設計試驗因素水平表

由表3 可以看出，根據9 個因素（分別為蔗糖質量濃度、檸檬酸鈉質量濃度、硫酸銨質量濃度、硫酸鎂質量濃度、發酵時間、發酵溫度、接種量、料水比）預測的線性模型具有極顯著性（P＜0.01），表明該模型擬合度較高，可信度大于99%。其中相關系數R為0.9989，校正決定系數R為0.994 0，說該模型能解釋99.89%出現的變化。根據Plackett-Burman 設計以及顯著性方差分析得出，在11 個因素中發酵溫度、硫酸銨濃度和蔗糖濃度對桑葉發酵結束后粗蛋白含量影響最大，因此選擇這3 個因素進行進一步優化。

表3 采用Plackett-Burman 設計篩選影響粗蛋白含量的重要顯著因素

2.2 最陡爬坡試驗確定因素水平

由Plackett-Burman 設計的試驗結果可以看出，蔗糖、硫酸銨、溫度對桑葉發酵影響最顯著，故選取這3 個因素進行最陡爬坡試驗。根據上述試驗結果，將其他因素固定在最佳水平，采用最陡爬坡試驗的方法，對蔗糖（A）、硫酸銨（C）、溫度（H）3 個因素在各自合適的方向上進行最陡爬坡，以獲得這3 個因素的最佳中心點。根據這3 個因素的效應大小比較設定它們的變化方向和步長，由表4 可知，當蔗糖添加量為6%、硫酸銨1.5%、溫度為30 ℃時，粗蛋白含量最高為241.3 mg·g。故Box-Behnken design 試驗選擇以第3 組的條件作為中心點。

表4 最陡爬坡試驗試驗結果

2.3 Box-Behnkendesign試驗篩選主要因素的最優水平

根據最陡爬坡試驗結果設計Box-Behnken design 試驗的因素和水平。蔗糖濃度分別設置7%，6%，5%作為高、中、低水平；硫酸銨濃度分別設置2%，1.5%，1%作為高、中、低水平；溫度分別設置33，30，28℃作為高、中、低水平，具體設計情況見表5。根據Box-Behnken design 試驗設計原理，進行三因素三水平的響應面分析試驗，17 個試驗點可以分為2 類：一是析因點；二是零點。零點試驗重復5 次，用以估計試驗誤差。由表5 可知，Box-Behnken design 設計的17 組試驗中，粗蛋白含量的變化范圍為206.8～257.5 mg·g；零點重復試驗中，粗蛋白含量值范圍為255.8～257.5 mg·g；第1 組試驗檢測到最大值257.5 mg·g，此時蔗糖濃度為6%，硫酸銨濃度為1.5%，溫度為30 ℃。經回歸擬合后，試驗因素對響應值的影響可以用以下回歸方程表示：

式中，Y 表示預測的粗蛋白含量；A、C、H 分別代表蔗糖濃度、硫酸銨濃度和發酵溫度的編碼值。結果顯示，不同處理的預測結果和測試結果有一定偏差，但相差不多，表明該預測模型較為準確（表5）。

表5 Box-Behnken 設計中各變量水平及檢測值

以發酵后粗蛋白含量為響應值，對該模型進行顯著性方差分析。結果表明，該模型差異極顯著（P＜0.01），能夠對菌株hij158 發酵桑葉后粗蛋白含量進行準確預測。R為0.974 8，校正決定系數R為0.940 4，兩者間誤差較小。3 個因素對響應值的影響順序為：溫度＞硫酸銨＞蔗糖，且3 者對粗蛋白含量的影響均極顯著（表6）。

表6 根據響應面二次模型對影響粗蛋白含量的因素進行方差分析

三維響應面因素和響應值所構成的曲面圖，直觀地展示出不同因素交互作用對響應值的影響和變化范圍。利用回歸方程繪制粗蛋白含量隨各因素變化的二維等高線圖和三維響應面圖（圖1）。三維響應面和二維等高線圖可以看出溫度對粗蛋白含量的影響要大于蔗糖和硫酸銨，但兩因素之間不存在明顯的相互作用，即其中一個因素對粗蛋白含量的影響作用并不會隨著另一個因素的變化而變化。

圖1 雙因素互作對粗蛋白含量影響的響應面圖和等高線圖

2.4 優化結果驗證

為了檢驗試驗模型及優化結果的可靠性，對預測的優化條件進行驗證，經過3 次重復測試，每次設置3 個重復，粗蛋白含量均值為246.8 mg·g，與預測值256.6 mg·g接近，較優化前157.5 mg·g提高了1.57 倍。此時最佳發酵條件為：蔗糖6%、檸檬酸鈉0.5%、硫酸銨1.5%、磷酸二氫鉀0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、發酵時間10d、發酵溫度30℃、初始pH 值為8、接種量為15%、桑葉粉與混合溶液質量體積比為1∶0.5(W/V)。綜上所述，回歸方程能夠在一定范圍內反映各因素對菌株hij158 發酵桑葉后粗蛋白含量的影響，應用響應面設計優化固態發酵培養基以提高桑葉發酵后粗蛋白含量的方案切實可行，使用的模型能夠準確預測發酵最終粗蛋白含量。

3 結論與討論

桑樹是我國列入飼料目錄的作物，是一種開發前景十分廣闊的飼料，含有豐富的營養物質，其粗蛋白含量較高，可用于填補我國蛋白飼料資源匱乏的缺口。因此，粗蛋白含量是評價飼料品質和桑樹品種的重要指標。丁佐龍對安徽的7 個桑樹品種進行了桑葉粗蛋白測定，其含量分布在16.8%～23.02%；鄭莎等測定了45 個桑資源，其粗蛋白含量分布在13.61%～24.97%之間。粗蛋白含量除了與品種有關，還與季節、水肥管理、葉位相關，因此，本研究選用了樹齡相同，同時保證在相對一致的栽培條件下來評價發酵桑葉的粗蛋白含量。

利用微生物發酵技術，能顯著改善飼料的品質，增強動物機體免疫功能、促進動物體內的微生態平衡，從而提高動物抗病能力，具有十分廣闊的應用前景。桑葉經過微生物發酵后，發酵菌種可以分泌豐富的酶類以及各種活性物質，將一些難以消化分解的大分子物質降解成易于消化的蛋白質和游離氨基酸，一些微生物能通過不同的生理活動將非蛋白氮化為菌體蛋白，提高真蛋白含量。有學者研究發現，在玉米青貯飼料發酵過程中添加一定量枯草芽孢桿菌能夠顯著提高最終的粗蛋白含量。胡仁建等利用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、啤酒酵母發酵桑葉，桑葉蛋白含量由14.7%提高至19.6%。任元元等利用植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉按照1∶1∶1∶1 的添加比例進行復合菌種發酵桑葉，桑葉蛋白含量由6.2%提高至17.2%。朱佳文等研究發現，添加枯草芽孢桿菌能夠使青貯桑葉中的粗蛋白含量顯著提高，而抗營養因子、粗纖維和粗脂肪的含量有所下降，發酵品質得到顯著改善。現階段發酵桑葉使用的發酵菌種繁多，發酵工藝多樣，多種益生菌微生物復合發酵劑雖然比單菌劑有一定優勢，但是多種菌混培養，易出現污染、混菌比例難控制等問題。如細菌的培養溫度一般為28～37 ℃、酵母菌的培養溫度為25～30 ℃、霉菌的培養溫度為25～28 ℃，不同菌的培養溫度和培養時間很難統一，微生物代謝過程很難做到精準控制。選擇單一菌種發酵容易控制其生長曲線和代謝過程，芽孢桿菌是益生型細菌，具有良好的益生特性和熱穩定性，在不良環境中具有非常強的抗逆性，許多研究表明，芽孢桿菌飼料添加劑對動物生產具有有益的影響。利用芽孢桿菌發酵飼料的研究十分廣泛。枯草芽孢桿菌能產生強抗逆性的孢子，具有耐熱、耐紫外、耐干燥的特性，無致病性，可以產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等多種酶類。我國農業部頒發的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中寫明枯草芽孢桿菌可用于動物飼料。

本研究選擇枯草芽孢桿菌進行單菌種發酵，提高了發酵后桑蛋白含量，使用Design Experts 10 軟件結合Plackett-Burman 試驗、最陡爬坡試驗以及Box-Behnken 試驗優化了桑葉發酵條件，測試的11個因素中，蔗糖質量濃度、硫酸銨質量濃度、發酵溫度顯著影響桑葉發酵后的蛋白含量（P＜0.05），影響大小順序為：發酵溫度＞硫酸銨質量濃度＞蔗糖質量濃度，確定最優發酵條件為蔗糖質量濃度為6%、硫酸銨1.5%、發酵溫度30 ℃，粗蛋白含量達到246.8 mg·g，較優化前157.5 mg·g提高了1.57 倍。本研究對飼料桑產業的后續開發，桑蛋白的利用具有一定的借鑒意義。