藏紅花素對癲癇大鼠學習記憶能力的影響

江冉冉，李曉東，周蓓瀛

我國癲癇發(fā)病率為0.7%，現(xiàn)有病人約900萬例，30%～40%的病人存在認知功能障礙，嚴重影響癲癇病人生活質量[1-2]。認知功能障礙多表現(xiàn)為學習能力低下和記憶功能受損，海馬組織是學習和記憶的腦功能區(qū)域。相關研究報道，癲癇發(fā)作過程中，神經(jīng)元異常興奮與放電所致海馬組織氧化應激和炎癥損傷與癲癇后認知功能障礙密切相關[3-4]。

藏紅花素是藏紅花的主要有效成分，通過抑制氧化應激和炎癥對過氧化氫所致視網(wǎng)膜損傷、腦缺血及腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[5-7]。藏紅花素是否對癲癇所致海馬神經(jīng)元損傷及學習記憶能力有保護作用文獻報道較少。本研究觀察藏紅花素對癲癇大鼠學習記憶能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 通過河北省實驗動物中心購買180只清潔級雄性SD大鼠[SCXK(冀)2018-004]，體質量(240±10)g，動物批號：2020031604。在溫度(24±1)℃、濕度(65±10)%、明/暗各12 h交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物與試劑 藏紅花素(批號：17304-1G，純度≥98%)購自美國Sigma公司；注射用丙戊酸鈉(批號：20190826)購自四川科瑞德制藥股份有限公司；丙二醛(MDA)(貨號：A003-1-2，批號：191026)、超氧化物歧化酶(SOD)(貨號：A001-1-2，批號：191204)、過氧化氫酶(CAT)(貨號：A007-2-1，批號：190917)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF)-α(貨號：SEKR-0009，批號：20200105)、白細胞介素(IL)-1β(貨號：SEKR-0002，批號：20191128)、IL-6(貨號：SEKR-0005，批號：20190914)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自北京索萊寶生物技術有限公司。

1.3 分組、模型制備與給藥 在180只雄性SD大鼠中隨機取150只大鼠，參照康云霄等[8]報道的氯化鋰-匹羅卡品誘導法復制實驗用癲癇大鼠模型(127 mg/kg腹腔注射氯化鋰、20 h后15 mg/kg背部皮下注射匹羅卡品)，隨機分為癲癇組、藏紅花素5 mg/kg組、藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組[9]和丙戊酸鈉300 mg/kg組[10]，每組30只；其余30只大鼠作為正常組。各組均于背部皮下注射匹羅卡品前1 h腹腔注射給予相應劑量藥物(癲癇組給予生理鹽水)，正常組在造模和給藥過程中均給予生理鹽水。

1.4 癲癇首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作程度分級 造模完成后2 h內，觀察每只大鼠癲癇首次發(fā)作潛伏期(造模完成到第1次癲癇發(fā)作的時間間隔)，記錄癲癇持續(xù)時間，依據(jù)Racine分級標準[11]進行癲癇分級，Racine分級標準見表1。

表1 Racine分級標準

1.5 大鼠學習記憶能力測定 Morris水迷宮平臺固定于第Ⅲ象限，水溫25 ℃。氯化鋰-匹羅卡品注射24 h后，每組隨機選取10只大鼠，訓練3 d(每日4次)后，分別于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限使頭向器壁放入水中并誘導大鼠找到第Ⅲ象限平臺。①定位航行實驗：將每只大鼠分別在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限頭向器壁入水，記錄尋到平臺時間(120 s內未找到計120 s)，取平均值，即逃避潛伏期，可反映大鼠學習能力；②空間探索實驗：去掉第Ⅲ象限平臺，于第Ⅰ象限頭向器壁入水，記錄120 s內穿越原平臺位置次數(shù)，反映大鼠記憶能力。

1.6 海馬組織病理學檢查 造模完成24 h后，各組隨機另取10只大鼠，頸椎脫臼處死、取腦，4%多聚甲醛溶液固定72 h后包埋、切片、脫蠟、透明后行蘇木精-伊紅(HE)染色，通過光學顯微鏡觀察海馬組織病理學改變。

1.7 海馬組織氧化應激和炎性因子水平測定 造模完成24 h后，將各組剩余大鼠頸椎脫臼處死，冰上取腦、研磨勻漿，4 ℃離心取上清液。部分上清液按試劑盒說明處理后，采用酶標儀檢測氧化應激指標(SOD、CAT活性、MDA含量)；其余上清液按試劑盒說明處理后，采用酶標儀檢測炎性因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-6含量)。

2 結 果

2.1 藏紅花素對癲癇大鼠首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作等級的影響 藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組癲癇首次發(fā)作潛伏期較癲癇組延長、持續(xù)時間縮短、發(fā)作等級降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組癲癇首次發(fā)作潛伏期延長、持續(xù)時間縮短、發(fā)作等級降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

2.2 藏紅花素對癲癇大鼠學習記憶能力的影響 癲癇組大鼠逃逸潛伏期較正常組延長，穿越平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組逃逸潛伏期較癲癇組縮短，穿越平臺次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1、表3。

圖1 藏紅花素對癲癇大鼠定位巡航實驗軌跡的影響(A為正常組；B為癲癇組；C為藏紅花素5 mg/kg組；D為藏紅花素10 mg/kg組；E為藏紅花素20 mg/kg組；F為丙戊酸鈉300 mg/kg組)

2.3 藏紅花素對癲癇大鼠海馬組織病理學改變的影響 正常組大鼠大腦海馬組織形態(tài)結構未見異常；癲癇組可見細胞排列紊亂，核膜核仁邊界不清，胞漿固縮深染、空泡變性等病理學改變；藏紅花素5 mg/kg組、藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組大鼠大腦海馬組織病理學改變較癲癇組均有所改善，藏紅花素20 mg/kg組優(yōu)于其余組。詳見圖2。

圖2 藏紅花素對癲癇大鼠海馬組織病理學改變的影響(HE，×400)(A為正常組；B為癲癇組；C為藏紅花素5 mg/kg組；D為藏紅花素10 mg/kg組；E為藏紅花素20 mg/kg組；F為丙戊酸鈉300 mg/kg組)

2.4 藏紅花素對癲癇大鼠海馬組織MDA含量和SOD、CAT活性的影響 癲癇組大鼠海馬組織MDA含量較正常組升高，SOD、CAT活性較正常組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組較癲癇組MDA含量降低，SOD、CAT活性升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組MDA含量降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

2.5 藏紅花素對癲癇大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響 癲癇組海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量較正常組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組較癲癇組TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組TNF-α、IL-6含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表5。

單位：pg/mL

3 討 論

癲癇具有自發(fā)發(fā)作和反復發(fā)作的特點，病程遷延，常導致認知功能障礙，嚴重影響癲癇病人生活質量，造成心理負擔。癲癇及其并發(fā)癥病理機制復雜，既往研究證實癲癇發(fā)作過程導致海馬神經(jīng)元氧化應激和炎癥損傷是引發(fā)認知功能障礙的重要因素。因此，抑制氧化應激和炎癥為切入點探討保護海馬神經(jīng)元的藥物，是提高癲癇病人學習記憶能力的有效方法。

藏紅花取其花柱上部及柱頭入藥，性平味甘微酸，《本草綱目》記載：“藏紅花具活血之功效，可治驚悸”，《品匯精要》記載：“藏紅花主散郁調血，寬胸膈，開胃進食”。藏紅花素是藏紅花主要活性成分之一，可通過血腦屏障。有研究報道，藏紅花素可抑制氧化應激和炎癥損傷，對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮一定的保護作用[7]。丙戊酸鈉是臨床廣泛應用的不含氮抗癲癇藥物，對各種類型癲癇小發(fā)作、大發(fā)作、陣攣性癲癇、混合型發(fā)作等均具有抑制作用，是癲癇動物實驗常用的陽性對照藥物[12]。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品誘導復制實驗性癲癇大鼠模型，注射匹羅卡品前給予不同劑量的藏紅花素或丙戊酸鈉進行干預，結果顯示，藏紅花素可延長癲癇發(fā)作潛伏期，縮短持續(xù)時間，降低發(fā)作等級，改善海馬組織病變，且藏紅花素20 mg/kg組效果優(yōu)于丙戊酸鈉300 mg/kg組，提示藏紅花素具有抗癲癇和海馬組織保護作用。

尹小花等[13]研究報道，癲癇發(fā)作過程神經(jīng)元異常興奮和異常放電導致活性氧簇大量生成，引起內源性抗氧化酶SOD、CAT等過度消耗，活性氧簇不能及時被還原清除而攻擊破壞核酸、多肽、蛋白質等生物大分子及生物膜脂質雙分子層結構，即氧化應激損傷，且該過程將生成具有毒性的MDA[14-15]。神經(jīng)元異常興奮可刺激炎性因子過度釋放，引發(fā)炎癥進而導致海馬組織損傷。TNF-α、IL-1β可趨化粒細胞、小膠質細胞等，進一步分泌炎性因子，進而加重炎癥損傷[16-17]；IL-6能誘導活性氧簇釋放，進一步加重氧化應激損傷[18]。本研究結果顯示，藏紅花素可提高癲癇大鼠海馬組織抗氧化酶活性，降低MDA和炎性因子含量，藏紅花素20 mg/kg組對SOD活性和MDA、TNF-α、IL-6含量的影響優(yōu)于丙戊酸鈉300 mg/kg組，提示藏紅花素對癲癇大鼠海馬組織的保護作用可能與抑制氧化應激和炎癥有關。

綜上所述，藏紅花素可能通過抑制氧化應激和炎癥反應，減輕癲癇大鼠海馬組織損傷，對癲癇大鼠學習記憶能力發(fā)揮保護作用，本研究結果為藏紅花素防治癲癇所致認知功能障礙提供了理論依據(jù)。