云煙121健康與感黑脛病煙株根系及根際土壤叢枝菌根真菌差異研究

裴 妍，任 禛*，李秋樺，陳 秀，夏體淵，蔣明星，尹 敏

（1昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/云南省高校生物炭工程研究中心，云南昆明 650214；2昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650214；3云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650091）

0 引言

【研究意義】叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一類廣泛分布于土壤微生態(tài)環(huán)境的真菌（曹敏等，2020）。AMF與宿主植物建立共生體后，不僅可通過(guò)菌絲網(wǎng)絡(luò)幫助植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可提高宿主對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗能力（董琦等，2020；張學(xué)林等，2021）。煙草（L.）為茄科煙屬植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)煙草種植面積、產(chǎn)量及銷售量均居世界首位（王成己等，2021）。煙草根莖性病害是煙草生產(chǎn)上面臨的主要難題，其中煙草黑脛病危害最突出，其發(fā)生面積廣、防治難度大，每年因此病害造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千萬(wàn)元（汪漢成等，2021）。煙草黑脛病是主要由寄生疫霉（）侵染引起的土傳病害，該病害可在煙株各生長(zhǎng)階段發(fā)生，且分布廣泛，嚴(yán)重制約著煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展（張凱等，2015）。煙草是AMF的共生植物之一，有綜述報(bào)道在煙草根際土壤中存在豐富的AMF種類，共計(jì)13屬54種（曹本福等，2021）。煙草對(duì)菌根依賴性較強(qiáng)，AMF侵染煙株根系建立菌根共生體后，可促進(jìn)煙株對(duì)水分及礦物質(zhì)的吸收（姚娟等，2012），增加煙株生物量（Janou?kovú et al.，2006a，2006b），改善煙葉品質(zhì)（王茂勝等，2011），提高煙株對(duì)重金屬（Janou?ková et al.，2006）、干旱（周霞等，2012）和土傳病害（劉先良等，2014）等不良脅迫的抵抗能力；同時(shí)，AMF可有效解決育苗中煙苗抗旱、抗病能力弱的問(wèn)題，提高成活率（Pavithra and Yapa，2018）；此外，AMF還可保護(hù)煙草的土壤，可在一定程度上緩解連作障礙問(wèn)題（李亮和蔡柏巖，2016）。AMF對(duì)煙草具有重要的功能作用，因此，掌握煙草與AMF的共生特性，對(duì)煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有促進(jìn)作用。【前人研究進(jìn)展】AMF與煙株共生效應(yīng)的強(qiáng)弱與其侵染定殖狀況密切相關(guān)，但侵染狀況會(huì)受煙草品種、AMF種類、自然環(huán)境和人為農(nóng)事操作等多種因素的影響（李雪靜等，2017；Wang et al.，2018；Veresoglou et al.，2019；尼瑪此姆等，2020；朱亮等，2020）。煙草品種和AM種類是影響煙株AMF侵染的重要因素之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，云煙202、云煙87、云煙85和K326根部的主要AMF種類相同，但稀有AMF種類在4個(gè)煙草品種中存在明顯差異（任禛等，2016）。周霞等（2012）通過(guò)對(duì)煙草品種K326接種根內(nèi)球囊霉（）、幼套球囊霉（）BEG-168和BGC-HEB07A，探究AMF對(duì)烤煙生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)及抗旱性的影響，結(jié)果表明，接種AMF對(duì)煙苗生物量、營(yíng)養(yǎng)狀況、丙二醛和葉綠素含量及根系活力的影響因菌株不同而異，且與干旱程度有關(guān)。Cosme等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，煙草接種根內(nèi)根孢囊霉（，RI）和摩西斗管囊霉（，F(xiàn)M）及二者混合物，在不同菌劑處理下叢枝的定殖率存在明顯差異。自然環(huán)境因素和人為農(nóng)事操作亦會(huì)對(duì)AMF的侵染定殖產(chǎn)生一定影響。Veresoglou等（2019）證實(shí)AMF的定殖率會(huì)隨著緯度梯度的升高呈減少趨勢(shì)，且AMF與植物共生關(guān)系也會(huì)逐漸消弱。李榮波等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀是影響根際土壤AMF孢子密度和侵染狀況的重要因子。在農(nóng)事管理中，灌溉澆水量過(guò)多會(huì)使AMF的侵染率及其與宿主的共生效應(yīng)減弱（Langeroodi et al.，2017）。而適度的干旱和適當(dāng)減量施用化肥均會(huì)使根系產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)促進(jìn)AMF的侵染，其共生效應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng)（宋福強(qiáng)，2018；葛詩(shī)蓓等，2020）。煙草黑脛病的發(fā)生與土壤微生物具有密切關(guān)系。向立剛等（2019，2020）研究發(fā)現(xiàn)，相比健康煙株，感染黑脛病煙株的根際土壤真菌群落豐富度和多樣性均降低，細(xì)菌群落豐富度明顯提高。同時(shí)，AMF的存在可提高農(nóng)作物對(duì)疫霉病害的抵抗能力，當(dāng)AMF與宿主根系形成菌根后，菌根與病原真菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)，使病原菌侵染位點(diǎn)減少，進(jìn)而疫霉病菌數(shù)量下降，間接地提高農(nóng)作物對(duì)疫霉病菌的抵抗力（Vigo et al.，2000）。Vigo等（2000）通過(guò)對(duì)番茄根際接種摩西斗管囊霉，發(fā)現(xiàn)引起根腐病的病原菌寄生疫霉（）在菌根化根系中的入侵位點(diǎn)數(shù)明顯少于對(duì)照。婁璇（2019）通過(guò)對(duì)辣椒植株接種根內(nèi)根孢囊霉（），其疫霉病發(fā)病率、病情指數(shù)均有所降低，防治效果達(dá)54%。【本研究切入點(diǎn)】AMF在提高農(nóng)作物對(duì)疫霉病害抗性方面發(fā)揮著重要作用，但AMF對(duì)農(nóng)作物的定殖會(huì)受到生物和非生物因素的影響。疫霉病菌作為生物因素，其存在可導(dǎo)致土壤中真菌和細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但是否影響到共生真菌AMF在農(nóng)作物根域的定殖及其類群結(jié)構(gòu)尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以煙草品種云煙121為研究對(duì)象，采用顯微形態(tài)觀察法對(duì)健康和患黑脛病煙株根系A(chǔ)MF侵染水平及根際土壤AMF孢子密度進(jìn)行測(cè)定，并應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析2種煙株根系A(chǔ)MF多樣性和群落結(jié)構(gòu)的差異，進(jìn)一步采用冗余分析（RDA）和Spearman相關(guān)性系數(shù)揭示根際土壤理化性質(zhì)對(duì)AMF屬水平相對(duì)豐度及AMF多樣性的影響，明確疫霉侵襲對(duì)煙草和AMF共生關(guān)系的影響，為后續(xù)AMF在緩解煙株土傳病害方面的應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)田概況 試驗(yàn)于2020年3月在云南省煙草公司紅河州分公司橄欖坡煙草綠色防控示范基地（海拔1451 m，北緯24°22′35″，東經(jīng)103°27′34″）進(jìn)行。試驗(yàn)用地約1 ha，前作為蘿卜，將試驗(yàn)地均分為3份，植煙前采用五點(diǎn)取樣法對(duì)土壤樣品進(jìn)行取樣，測(cè)定土壤理化性質(zhì)，結(jié)果顯示3塊試驗(yàn)地土壤理化性質(zhì)間無(wú)顯著差異（＞0.05，下同），說(shuō)明3塊試驗(yàn)地土壤背景較一致（表1）。于2020年4月開始種煙，煙草品種均為云煙121，田間管理方法一致。

1.1.2 樣品采集 2020年8月分別采集健康和患黑脛病煙株根系和根際土壤。在每塊試驗(yàn)田分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康與患黑脛病煙株，從煙株基部開始，使用土壤刀逐層挖去上層土壤，直至側(cè)根暴露為止，之后將煙株完整取出，立刻帶回實(shí)驗(yàn)室，在根頸處截?cái)啵瑢⒏街诟瞪系母H土壤抖落至密封袋中保存?zhèn)溆茫謩e用于土壤理化性質(zhì)和AMF孢子密度測(cè)定。將去除根際土壤的根系在輕緩的流水下沖洗，沖洗干凈后自然風(fēng)干，將根系剪成1 cm的根段，分別用于菌根侵染狀況測(cè)定和DNA提取。健康煙株分別標(biāo)記為H、H、H；患病煙株分別標(biāo)記為D、D、D。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤pH用pH儀測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀法測(cè)定；土壤堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；土壤有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤速效鉀含量采用原子吸收分光光度法測(cè)定。

1.2.2 菌根侵染狀況和土壤AMF孢子密度測(cè)定 菌根侵染狀況參照Koske和Gemma（1989）的方法進(jìn)行檢測(cè)，將數(shù)據(jù)輸入MYCOCALC軟件，對(duì)菌根侵染數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。土壤AMF孢子密度測(cè)定采用濕篩—傾析法和蔗糖離心法進(jìn)行分離，在解剖鏡下計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 煙草根系DNA提取和測(cè)序 根系DNA提取：稱取煙草根系樣品各2 g，將樣品置于無(wú)菌研缽中，加入適量液氮，將其研磨成粉末狀。采取CTAB法對(duì)煙草根系總DNA進(jìn)行提取；提取的DNA在1.0%瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳檢測(cè)其質(zhì)量。以各樣品總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系20.00 μL：10×Buffer 2.50 μL，DNA模板（20 ng/L）2.00 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.50 μL，特異引物（10 mmol/L）1.50 μL，聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，ddHO補(bǔ)足至20.00 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit建庫(kù)，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司運(yùn)用Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 分析方法

選擇97%相似度的OTU 分類學(xué)水平，利用Mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)，應(yīng)用Excel 2003對(duì)各分類單元數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；用Qiime（v1.9.1）計(jì)算Beta多樣性距離矩陣；通過(guò)R語(yǔ)言工具繪制Shannon指數(shù)稀釋曲線、Venn圖和PCA分析；應(yīng)用Canoco 4.5分析AMF在屬水平上的相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性；應(yīng)用SPSS 22.0的Spearman相關(guān)性系數(shù)對(duì)土壤理化性質(zhì)與煙株根系A(chǔ)MF多樣性的相關(guān)性進(jìn)行分析。同時(shí)，應(yīng)用SPSS 22.0對(duì)土壤理化性質(zhì)、根系侵染率、根際土壤AMF孢子密度和Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行配對(duì)樣本檢驗(yàn)，差異顯著水平為0.05。

1.4 序列登入

H、H、H、D、D和D上傳在NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)分別為SRR14278382、SRR14278381、SRR 14278380、SRR14278385、SRR14278384、SRR1427 8383。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康與患病煙株根際土壤理化性質(zhì)比較分析

從表3可看出，健康和患病煙株根際土壤pH呈中性，均為7.17；云煙121根際土壤的有機(jī)質(zhì)含量均趨于中等水平，其中健康煙株為23.24 g/kg，患病煙株為14.46 g/kg，健康煙株根際土壤的有機(jī)質(zhì)含量更高，但二者差異未達(dá)顯著水平（＞0.05，下同）；患病煙株根際土壤的有效磷、速效鉀和堿解氮含量均明顯高于健康煙株，且有效磷和速效鉀含量顯著高于健康煙株（＜0.05，下同）。可見(jiàn)，黑脛病的侵染可改變煙株根際土壤的理化性質(zhì)，降低有機(jī)質(zhì)含量，明顯增加速效養(yǎng)分含量。

2.2 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF侵染率及土壤AMF孢子密度比較分析結(jié)果

在云煙121健康和患病煙株根系及根際土壤中均檢測(cè)到AMF的存在（表4），且健康和患病煙株根系的AMF侵染率均較高，在70.00%以上。從表4可看出，健康與患病煙株根系A(chǔ)MF的侵染率、侵染密度和叢枝豐富度雖無(wú)顯著差異，但健康煙株根系A(chǔ)MF侵染狀況明顯好于患病煙株；另外，在每10 g健康和患病煙株根際風(fēng)干土壤中，AMF的孢子密度均在20.00個(gè)以上，且健康煙株根際土壤AMF孢子密度顯著高于患病植株，說(shuō)明健康煙株根際土壤的AMF孢子更豐富，與煙株根系A(chǔ)MF侵染狀況相符。

2.3 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF高通量測(cè)序結(jié)果

2.3.1 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF序列統(tǒng)計(jì)比較分析 從表5可看出，健康和患病煙株根系A(chǔ)MF經(jīng)測(cè)序分別獲得72495和73058條原始序列，經(jīng)質(zhì)控后可得到70762和71658條有效序列，平均序列長(zhǎng)度為218.00和216.00 bp，按照97%的相似度進(jìn)行聚類分析，分別得到738.00和636.00個(gè)OTUs。從檢驗(yàn)結(jié)果可看出，健康煙株根系的OTUs數(shù)量顯著高于患病煙株，健康煙株根系的AMF種類更豐富。

2.3.2 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF稀釋曲線比較分析 Shannon指數(shù)稀釋曲線可反映樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。從圖1可看出，采樣點(diǎn)供試樣品的稀釋曲線已趨于平穩(wěn)，表明樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，能客觀反映煙株根系中AMF群落的真實(shí)情況，可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從OTU水平上的Shannon指數(shù)值結(jié)果可看出，各健康植株樣品明顯高于患病植株樣品，說(shuō)明健康煙株根系A(chǔ)MF多樣性更豐富。

2.3.3 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF多樣性比較分析Alpha多樣性可用于反映樣品的物種豐富度及多樣性。由表6可看出，健康煙株根系A(chǔ)MF的ACE、Shannon和Chao指數(shù)均顯著高于患病煙株，同時(shí)Simpson指數(shù)顯著低于患病煙株，說(shuō)明在患病煙株根系中連續(xù)抽樣得到相同AMF物種的概率較高，其AMF多樣性較低，且與健康煙株間達(dá)顯著差異水平；此外，所測(cè)健康與患病煙株根系樣品覆蓋率分別為99.89%和99.91%，均在99.00%以上，說(shuō)明本次檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能客觀代表樣品中AMF的多樣性。

2.3.4 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF種群歸類比較分析 在患病與健康煙株根系中共獲得1410個(gè)AMFOTUs，排除不可歸類，其余均為球囊菌綱（Glomeromycetes）的種類。所有可歸類的AMF分別歸屬于4個(gè)目：原囊霉目（Archaeosporales）、多孢囊霉目（Diversisporales）、球囊霉目（Glomerales）和類球囊霉目（Paraglomerales）；5個(gè)科：原囊霉科（Archaeosporaceae）、多孢囊霉科（Diversisporaceae）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）、球囊霉科（Glomeraceae）和類球囊霉科（Paraglomeraceae）；6個(gè)屬：球囊霉屬（）、類球囊霉屬（）、多孢囊霉屬（）、原囊霉屬（）、盾巨孢囊霉屬（）和巨孢囊霉屬（）。從不同分類階層總數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，在目、科水平上，健康與患病煙株根系A(chǔ)MF的組成數(shù)目差異不明顯，但在屬水平上，健康煙株根系A(chǔ)MF種類多于患病煙株。

2.3.5 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF在目水平上比較分析 在目水平上（圖2），健康與患病煙株根系A(chǔ)MF可歸類目均為原囊霉目、多孢囊霉目、球囊霉目和類球囊霉目。在健康煙株根系中，球囊霉目為優(yōu)勢(shì)目，占比48.46%；其次為類球囊霉目，占比40.60%；多孢囊霉目和原囊霉目數(shù)量相對(duì)較少，占比分別為10.76%和0.17%。在患病煙株根系中，類球囊霉目為優(yōu)勢(shì)目，占比為53.55%；其次為球囊霉目和多孢囊霉目，占比分別為24.46%和20.90%，原囊霉目占比較少，僅占總數(shù)的1.08%。可見(jiàn)，在目水平上健康與患病煙株根系A(chǔ)MF種類相同，但占比不同，優(yōu)勢(shì)目種類亦不相同。

2.3.6 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF在科水平上比較分析 在科水平上（圖3），健康與患病煙株根系A(chǔ)MF可歸類科均為原囊霉科、多孢囊霉科、巨孢囊霉科、球囊霉科和類球囊霉科。其中，健康煙株根系中球囊霉科為優(yōu)勢(shì)科，占比48.50%；其次為類球囊霉科和多孢囊霉科，占比分別為40.63%和10.01%；巨孢囊霉科和原囊霉科數(shù)目相對(duì)較少，占比分別為0.75%和0.09%。在患病煙株根系中，類球囊霉科為優(yōu)勢(shì)科，占比53.70%；其次為球囊霉科和多孢囊霉科，占比分別為24.53%和20.57%；原囊霉科和巨孢囊霉科占比較少，僅占0.92%和0.27%。可見(jiàn)，在健康與患病煙株根系中，在科水平上AMF種類相同，但優(yōu)勢(shì)科不同，與目水平的結(jié)果指向一致。

2.3.7 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF在屬水平上比較分析 由圖4可知，在屬水平上，健康煙株根系A(chǔ)MF可歸類屬為球囊霉屬、類球囊霉屬、多孢囊霉屬、原囊霉屬、盾巨孢囊霉屬和巨孢囊霉屬；患病煙株根系A(chǔ)MF可歸類屬為球囊霉屬、類球囊霉屬、多孢囊霉屬、原囊霉屬和盾巨孢囊霉屬。其中，健康煙株根系中球囊霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，占比48.50%；其次為類球囊霉屬和多孢囊霉屬，占比分別為40.63%和10.02%；原囊霉屬和盾巨孢囊霉屬占比相對(duì)較少，僅占0.52%和0.08%；巨孢囊霉屬為健康煙株根系中特有的群落，僅占0.22%。在患病煙株根系中，類球囊霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，占比53.69%；其次為球囊霉屬和多孢囊霉屬，占比分別為24.53%和20.57%；而原囊霉屬和盾巨孢囊霉屬占比不足1.00%，僅0.92%和0.27%。綜上所述，在屬水平上，健康與患病煙株根系A(chǔ)MF優(yōu)勢(shì)屬存在差異，且巨孢囊霉屬為健康煙株根系A(chǔ)MF特有的屬。

2.3.8 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF Venn圖比較分析Venn圖可直觀地體現(xiàn)健康與患病煙株根系A(chǔ)MF群落OTU組成的差異及共有物種的情況。由圖5可知，健康煙株根系中特異性AMF群落OTU數(shù)量為393，占總OTU序列數(shù)的27.87%，患病煙株根系中特異性AMF群落OTU數(shù)量為259，占總OTU序列數(shù)的18.37%；此外，健康與患病煙株根系共有的OTU數(shù)量為758，占總OTU序列數(shù)的53.76%。其中，球囊霉屬、類球囊霉屬、多孢囊霉屬、原囊霉屬和盾巨孢囊霉屬為健康和患病煙株根系共有屬，巨孢囊霉屬為健康煙株根系特有屬。

2.3.9 健康與患病煙株根系A(chǔ)MF群落PCA分析為進(jìn)一步探明黑脛病侵染對(duì)煙草根系A(chǔ)MF群落結(jié)構(gòu)的影響，基于OTU水平進(jìn)行PCA分析。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，健康與患病煙株在PC1維度上分為2組，說(shuō)明黑脛病的侵染可明顯改變煙株根系的AMF群落結(jié)構(gòu)；患病煙株3個(gè)重復(fù)間更加聚集，而健康煙株3個(gè)重復(fù)間較分散，患病與健康煙株根系2組樣品間分化明顯，說(shuō)明健康與患病煙株根系A(chǔ)MF群落結(jié)構(gòu)存在差異。

2.3.10 土壤理化性質(zhì)對(duì)煙株根系A(chǔ)MF多樣性的影響 通過(guò)Spearman相關(guān)性系數(shù)評(píng)估煙株根際土壤理化性質(zhì)與根系A(chǔ)MF多樣性的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可看出，速效鉀和有效磷對(duì)AMF多樣性和豐富度的影響最大，其中，有效磷、速效鉀和堿解氮與AMF豐富度指數(shù)（Chao指數(shù)和ACE指數(shù)）均呈負(fù)相關(guān)，且有效磷和速效鉀與之相關(guān)性達(dá)極顯著水平（＜0.01，下同）；有效磷、速效鉀和堿解氮與AMF多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）均呈負(fù)相關(guān)，且有效磷和速效鉀與之相關(guān)性達(dá)顯著水平；有效磷、速效鉀和堿解氮與AMF多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)）均呈正相關(guān)，且有效磷和速效鉀與之相關(guān)性達(dá)顯著水平；pH、有機(jī)質(zhì)與多樣性和豐富度指數(shù)相關(guān)性均未達(dá)顯著水平。

2.3.11 土壤理化性質(zhì)對(duì)煙株根系A(chǔ)MF屬水平上相對(duì)豐度的影響 由圖7可知，pH、有效磷、速效鉀、堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量均對(duì)AMF優(yōu)勢(shì)屬的豐度有一定影響。第1排序軸和第2排序軸解釋信息量分別為76.4%和18.8%，其中，有效磷對(duì)AMF屬水平上的相對(duì)豐度影響最大，其次為速效鉀；有效磷、速效鉀和堿解氮均與類球囊霉屬、原囊霉屬和多孢囊霉屬的相關(guān)豐度呈正相關(guān)，與盾巨孢囊霉屬、巨孢囊霉屬和球囊霉屬的相關(guān)豐度呈負(fù)相關(guān)；pH與盾巨孢囊霉屬、巨孢囊霉屬和球囊霉屬的相關(guān)豐度呈正相關(guān)，與類球囊霉屬、原囊霉屬和多孢囊霉屬的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)；有機(jī)質(zhì)含量與巨孢囊霉屬、多孢囊霉屬和球囊霉屬的相關(guān)豐度呈正相關(guān)，與其他屬的相關(guān)豐度呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

AMF作為植物常見(jiàn)的共生真菌，可定殖于90%以上的維管植物中（曹敏等，2020）。煙草是可與AMF建立共生關(guān)系的農(nóng)作物之一，前人研究表明在煙草根際土壤和根內(nèi)存在著豐富的AMF資源（曹本福等，2021）。李昕竺（2013）采用DGGE法在攀枝花市鹽邊縣5個(gè)不同煙草生產(chǎn)區(qū)土壤中共發(fā)現(xiàn)3屬29種AMF孢子。王婷婷（2013）采用顯微形態(tài)觀察法在貴州省主要煙草產(chǎn)區(qū)土壤共分離、鑒定出4屬20種AMF。本課題組前期采用分子克隆文庫(kù)方法在4個(gè)云南主栽煙草品種根系共發(fā)現(xiàn)21個(gè)OTUs（任禛等，2016）。而本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，在健康與感黑脛病煙株根系中共檢測(cè)到1410個(gè)AMFOTUs。可見(jiàn)，采用高通量測(cè)序技術(shù)可在煙草根系中獲得更多的AMF種類。由于AMF缺乏明顯的種屬特性，在顯微鏡下難以區(qū)別鑒定，給AMF多樣性研究帶來(lái)一定的局限性；同時(shí)，DGGE和克隆文庫(kù)構(gòu)建等分子生物學(xué)方法則存在擴(kuò)增片段短、信息量不足的問(wèn)題；而Illumina高通量測(cè)序具有通量高、準(zhǔn)確率高的優(yōu)勢(shì)（秦楠等，2011；施軍瓊等，2020），可克服這些方法的局限，擴(kuò)大人們對(duì)煙草AMF類群的認(rèn)知。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序首次在煙株根系A(chǔ)MF中發(fā)現(xiàn)多孢囊霉屬，多孢囊霉屬為健康與患病煙株共有屬，且相比健康煙株，患病煙株的多孢囊霉屬相對(duì)豐度增加10.55%。朱亮等（2020）研究表明，多孢囊霉屬與磷含量的相關(guān)性最大，且與磷含量呈正相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致。初步推測(cè)可能是煙株患病后有效磷含量顯著增加，這可能是導(dǎo)致患病煙株根系中多孢囊霉屬豐度增加的原因之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)巨孢囊霉屬為健康煙株特有屬，Duc和Posta（2018）通過(guò)對(duì)番茄植株接種珠狀巨孢囊霉（），發(fā)現(xiàn)珠狀巨孢囊霉雖然定殖率較低，但對(duì)其枯萎病和潰瘍病病原（subsp.）的抗性較高。因此，巨孢囊霉屬可能會(huì)提高植物對(duì)病害的抗性，但是否會(huì)提高煙株對(duì)黑脛病的抗性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究報(bào)道AMF侵染率和孢子密度與農(nóng)作物病害的發(fā)病率、病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（尼瑪此姆等，2020），因此，農(nóng)作物被病害侵襲就有可能影響AMF的侵染率和孢子密度。本研究發(fā)現(xiàn)，健康煙株根系的AMF侵染率、侵染密度和叢枝豐富度明顯高于患病煙株，且前者根際土壤中的AMF孢子密度顯著高于后者。婁璇（2019）在對(duì)辣椒疫病發(fā)病率與AMF侵染率的關(guān)系研究中同樣證實(shí)健康幼苗的AMF侵染率高于患病幼苗。AMF與引發(fā)煙株黑脛病和辣椒疫病的疫霉均為真菌微生物，且均為土傳病害，感病煙株其根際土壤中必然存在著大量病原菌，這些病原菌可與AMF在土壤中競(jìng)爭(zhēng)生存空間及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，兩者此消彼長(zhǎng)，可導(dǎo)致AMF孢子密度下降。在煙株根內(nèi)，AMF侵染水平下降除與病原菌相互競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)外，還可能與根際土壤中AMF孢子密度減少所引發(fā)的競(jìng)爭(zhēng)能力減弱有關(guān)。同時(shí)，土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，感病煙株根際土壤中的有效磷、速效鉀和堿解氮含量等均高于健康煙株，初步推測(cè)可能是煙草黑脛病為維管束系統(tǒng)性病害，患病后煙株根部和莖基部的維管束壞死（張凱等，2015），使土壤養(yǎng)分無(wú)法從植株地下部運(yùn)輸?shù)降厣喜浚瑢?dǎo)致土壤養(yǎng)分殘留量較大，患病煙株根際土壤中大量元素的速效含量偏高。但土壤理化性質(zhì)—土傳病害—AMF間的相關(guān)關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

AMF多樣性和群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到土壤因子、不同宿主植物、氣候因子和CO濃度等因素的影響（Johnson，2010；Ma?ek et al.，2011；蔣勝競(jìng)等，2014；李雪靜等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，與感染黑脛病的煙株相比，健康煙株根系A(chǔ)MF-OTUs數(shù)量更豐富，且ACE、Shannon和Chao指數(shù)更高，差異均達(dá)顯著水平。可見(jiàn)，感染黑脛病可顯著降低煙草根系A(chǔ)MF的多樣性。有研究報(bào)道，黃龍病菌侵染贛州柑橘可降低其根系A(chǔ)MF的Chao、Shannon和Sobs等多樣性指數(shù)（宋放等，2019），本研究結(jié)果與之一致，均證實(shí)病原菌存在對(duì)AMF多樣性的負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)，本研究證實(shí)，在目和科水平上，健康煙株和患病煙株根系A(chǔ)MF種類相同，但具體分布不同，優(yōu)勢(shì)種類亦不相同；在屬水平上2種煙株根系A(chǔ)MF群落結(jié)構(gòu)差異明顯，球囊霉屬是健康煙株根系的優(yōu)勢(shì)屬，而類球囊霉屬是感病煙株根系的優(yōu)勢(shì)屬；PCA分析結(jié)果表明健康與患病煙株根系A(chǔ)MF群落存在明顯差異。結(jié)合上述結(jié)果，本研究認(rèn)為黑脛病侵染不僅可降低煙草根系A(chǔ)MF侵染的種類及多樣性，還可改變AMF的群落結(jié)構(gòu)。宋放等（2019）亦證實(shí)黃龍病存在可明顯改變柑橘根系A(chǔ)MF的菌種組成和相對(duì)豐度。初步推測(cè)，一方面，由于患病煙株其根際土壤及根內(nèi)均存在一定程度的病原菌，病原菌的存在改變了煙草根系周圍微生態(tài)環(huán)境，且與AMF發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致患病煙株根系A(chǔ)MF多樣性下降；另一方面，不同AMF種類對(duì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)性存在差異，有些非主要的AMF，由于其能更好地適應(yīng)脅迫環(huán)境而轉(zhuǎn)變成為主要種類，有些AMF對(duì)脅迫環(huán)境較敏感，其數(shù)量下降或消失，最終導(dǎo)致感黑脛病煙株根系A(chǔ)MF組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

在土壤中，速效養(yǎng)分是可被植物直接吸收利用的養(yǎng)分形態(tài)，其與AMF間的關(guān)系更為密切。本研究結(jié)果表明，煙株根際土壤中的有效磷、速效鉀和堿解氮均與根系A(chǔ)MF多樣性指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其中有效磷和速效鉀與之相關(guān)性達(dá)顯著水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在土壤的速效養(yǎng)分中，有效磷和速效鉀對(duì)根系A(chǔ)MF多樣性和豐富度影響最大。可見(jiàn)，土壤中的有效磷含量對(duì)煙株根系A(chǔ)MF組成結(jié)構(gòu)的影響更明顯。劉敏等（2020）對(duì)柄扁桃根圍土壤理化性質(zhì)與土壤中AMF群落組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AMF豐富度與土壤速效磷和土壤含水量呈顯著負(fù)相關(guān)，且AMF多樣性與速效磷和速效氮含量間呈顯著負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致，均證實(shí)土壤速效養(yǎng)分含量與AMF多樣性和豐度間的負(fù)相關(guān)性，尤其是磷元素的影響更重要。研究者認(rèn)為導(dǎo)致這種現(xiàn)象可能存在兩方面的原因：一方面，在土壤速效養(yǎng)分含量較高的條件下，植物可更多地利用自身根系去吸收營(yíng)養(yǎng)，從而降低對(duì)AMF的依賴性，兩者共生關(guān)系弱化，影響AMF生長(zhǎng)及對(duì)煙株根系的侵染（Liu et al.，2019）；另一方面，AMF是對(duì)磷較敏感的真菌微生物，土壤有效磷含量較高往往會(huì)抑制AMF的發(fā)育和功能，導(dǎo)致AMF生長(zhǎng)受阻，多樣性下降（He et al.，2010）。本研究?jī)H初步探究了土壤速效養(yǎng)分與AMF多樣性和豐富度的相關(guān)性，但不同濃度的速效養(yǎng)分對(duì)AMF的影響有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

與健康煙株相比，感染黑脛病煙株根際土壤速效養(yǎng)分含量增加，土壤AMF孢子密度下降；煙株根系A(chǔ)MF侵染率減少，AMF種類及多樣性下降，且根系A(chǔ)MF群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。