一株具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌對煙葉的影響

胡逸超，蘇 贊，雷 薇，陳義昌，鄒克興，陳 琦*，鄒承武

（1廣西中煙工業有限責任公司技術中心，廣西南寧 530001；2南寧國拓生物科技有限公司，廣西南寧 530001；3廣西大學農學院/植物科學國家級實驗教學示范中心，廣西南寧 530004）

0 引言

【研究意義】未處理的煙葉和成品煙均可能滋生煙草甲（），對煙草工業造成較大危害。據估計，煙草甲造成的損失占每年煙草總量的0.7%～1.0%（Famham et al.，2007；Edde，2019；夏麗媛等，2020）。目前主要采用熏蒸法防控煙草甲，此法雖然毒殺煙草甲的效果顯著，但越來越多的研究表明煙草甲具有對磷化氫的基因遺傳抗性，導致磷化氫使用量不斷提高，引起了行業對食品安全的擔憂，制定了更嚴格的法規制約磷化氫使用（齊緒峰等，2006a；呂建華等，2016）。因此，開發綠色環保的煙草甲防控技術成為新的研究熱點。【前人研究進展】蘇云金芽孢桿菌（，）在產孢的過程中會產生伴孢晶體，即殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins），對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目及同翅目等昆蟲有特異性毒殺作用，而對環境和非靶標生物安全，因此廣泛應用于農業生產的植物保護領域（Sanchis and Bourguet，2008；崔瑩瑩，2009；Sanahuja et al.，2011；Jouzani et al.，2017；胡逸超等，2020）。煙草甲作為鞘翅目昆蟲，從倉儲煙葉中分離對煙草甲幼蟲具有殺蟲活性的菌株用于生物防治煙草甲，預示了制劑在防治倉儲煙葉害蟲方面有廣闊的應用前景（齊緒峰等，2006b）。有研究人員從2652株菌株中篩選出28株菌株產生的伴孢晶體具有毒殺煙草甲的作用，其中致死率最高的菌株毒殺率達45.3%（Tsuchiya et al.，2002）。胡逸超等（2019）從廣西50份倉儲煙葉中篩選獲得1株菌株，其對煙草甲的毒殺率高達72.5%。使用產生的芽孢進行噴施是較為長效的防控煙草甲的方法，目前尚無研究表明的使用會對人體或動物產生危害（Sanahuja et al.，2011）。有研究指出，菌劑應用到煙葉上不影響煙葉的化學成分及評吸效果，但未見詳細數據報道（Blanc et al.，2014）。在煙葉中添加微生物除了可用于防控蟲害，還可能加速醇化速度或優化煙葉質量。Zhao等（2007）研究表明，微生物對于醇化過程中煙葉的香氣改善和刺激性氣味去除具有重要作用。微生物可通過代謝物和酶的作用促進煙葉中生物大分子的轉化，從而減少煙堿、亞硝胺等有害成分，增加香味，改善品質特性（Maldonado-Robledo et al.，2003；Liu et al.，2015）。微生物菌劑的應用不僅會縮短煙葉發酵周期，還可改善煙葉香氣（張亞恒等，2015）。芽孢桿菌處理會降低煙葉中的多種亞硝胺類物質（Wei et al.，2014）。由此可見，人為添加微生物可能會影響煙葉的醇化效果。【本研究切入點】目前，已有使用菌株對煙草甲進行防控的研究（齊緒峰等，2006b），但關于使用菌株對煙草各項品質指標及煙葉微生物多樣性的影響尚未見文獻報道。本團隊前期研究發現1株對煙草甲具有較強毒殺率的菌株（胡逸超等，2019，2020），擬通過研究該菌株在煙草倉庫中使用是否對煙葉的各項品質指標和煙葉微生物多樣性造成影響，評估菌株用于煙草倉庫毒殺煙草甲的應用前景。【擬解決的關鍵問題】對噴施菌劑并進行醇化后的煙葉進行化學成分和評吸分析，并通過16S rDNA擴增子高通量測序分析煙葉的細菌群落結構變化，以期為煙葉倉庫中應用菌劑防控煙草甲的可行性和安全性評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用煙：2018年廣西B3F復烤煙葉（廣西中煙工業有限責任公司武鳴倉庫）。試驗菌株：從倉庫貯煙中分離的具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌GXZY032（胡逸超等，2019）。

1.2 Bt菌劑制備及試驗設計

菌株GXZY032挑取單菌落經小體積培養活化后，按照1∶100的比例接種于1000 mL NB培養基中。培養72 h（30 ℃，200 r/min），通過顯微鏡鏡檢計數確認芽孢含量達10個/mL后，離心（8000 r/min，30 min）收集菌體及芽孢，用無菌水洗滌2次后去除上清，將菌體進行冷凍干燥，制成粉劑。按照1 kg煙葉施用0.1 g菌劑的比例，將菌劑均勻噴施到煙葉上。用牛皮紙包裝煙葉，每件煙葉重約100 kg，于2018年4月放置于廣西中煙工業有限責任公司武鳴廠區倉庫內進行醇化，倉庫溫度維持在6～32 ℃，濕度控制在49%～94%。不施用菌劑的煙葉作為對照組，施用菌劑的煙葉作為處理組，每組均設3個重復。

1.3 煙葉化學成分測定及感官質量評價

1.3.1 樣品采集 煙葉進行醇化后，于第12個月開始，每隔2個月取樣一次，采用五點取樣法進行取樣，取樣位置至少距離上層煙葉15 cm，每次取樣500 g，共采集7次。

1.3.2 煙葉化學成分測定 分別參考YC/T 468—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動法》、YC/T 161—2002《煙草及煙草制品 總氮的測定 連續流動法》、YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》、YC/T 217—2007《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續流動法》、YC/T 162—2002《煙草及煙草制品 氯的測定 連續流動法》和YC/T 216—2013《煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續流動法》的方法測定煙葉總植物堿、總氮、總糖、還原糖、鉀、氯和淀粉含量。化學成分分析使用AutoAnalyzer 3 HR連續流動分析儀（德國Seal Analytical公司），主要化學試劑均為分析純。

1.3.3 感官質量評價 依據YC/T 530—2015《烤煙 煙葉質量風格特色感官評價方法》的方法，由廣西中煙工業有限責任公司組織評吸專家對煙葉進行單體煙評吸，對香氣質、香氣量、雜氣、刺激性、透發性、柔細度、甜度、余味、濃度和勁頭等指標進行評價，評吸人數及評吸分數參照楊松等（2018）的方法。

1.4 煙葉細菌多樣性分析

1.4.1 樣品采集 采集施用菌劑并醇化24個月后的煙葉作為處理組，以同時期未施用菌劑的煙葉作為對照組，每組設3個重復。

1.4.2 DNA提取 采用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，參照說明書提取樣品基因組DNA。所得基因組DNA經NanoDrop 2000（美國ThermoFisher公司）檢測純度，Qubit3.0 Fluorometer熒光計（美國ThermoFisher公司）測定濃度。

1.4.3 16S rDNA擴增子測序 采用引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3'）擴增細菌16S rDNA基因的V3～V4區（Sinclair et al.，2015），所得PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測及濃度檢測，等量混池后使用TruSeq DNA PCR-free Sample Preparation Kit（美國Illumina公司）進行文庫構建，具體操作步驟參照說明書。所得文庫使用NovaSeq6000（美國Illumina公司）進行雙端測序（Paired-End），雙向各測250 bp。

1.5 數據分析

使用FLASH 1.2.7對測序所得reads進行拼接（Mago? and Salzberg，2011），Qiime 1.7.0過濾低質量tags，以UCHIME Algorithm獲得Effective tags（Edgar et al.，2011），再用Uparse 7.0.1001進行聚類（Edgar，2013），相似性達97%的序列歸為一個分類單位（Operational taxonomic units，OTU），選取頻率最高的序列作為OTU序列。使用Mothur根據SILVA中的SSU數據庫（Quast et al.，2013）對OTUs進行各分類水平注釋，利用PyNAST 1.2（Yilmaz et al.，2013）對OTU序列發生關系進行計算，對各樣品的數據進行均一化處理。根據所有樣品的物種注釋結果和OTUs豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表。使用Qiime 1.7.0計算各樣品的Alpha多樣性指數。利用OTUs之間的系統發生關系，計算Unweighted unifrac（Unifrac）距離（Lozupone and Knight，2005），以OTUs豐度信息對Unifrac距離進一步構建Weighted Unifrac距離（Lozupone et al.，2007）。通過多變量統計學方法進行主坐標分析（Principal co-oridinates analysis，PCoA）。

組間差異顯著性分析采用Student’stest（test）分析，＜0.05視為差異顯著。根據分析所獲得的數據，采用Prism 8.4.0繪制柱狀圖及散點圖。

2 結果與分析

2.1 Bt菌劑處理對煙葉常規化學成分的影響

菌劑處理對煙葉常規化學成分的影響見表1。處理組煙葉的總糖、還原糖、總植物堿和淀粉平均含量高于對照組，而鉀和總氮平均含量低于對照組。差異顯著性分析結果顯示，7種常規化學成分在2組之間無顯著性差異（＞0.05，下同），表明菌劑處理不會在醇化時造成煙葉總糖、還原糖、氯、總植物堿、鉀、總氮和淀粉等化學成分的明顯變化。

2.2 Bt菌劑處理對煙葉感官質量的影響

菌劑處理對煙葉感官質量的影響見圖1。隨著醇化時間的延長，對照組和處理組煙葉香氣量（圖1-B）、濃度（圖1-I）和勁頭（圖1-J）的得分表現出一定的降低趨勢。綜合來看，處理組煙葉的香氣質（圖1-A）、刺激性（圖1-D）、透發性（圖1-E）、柔細度（圖1-F）、甜度（圖1-G）、余味（圖1-H）和勁頭的平均評分稍低于對照組，其中香氣質、透發性和甜度的平均評分在處理組和對照組間存在顯著差異（＜0.05，下同）；處理組煙葉的香氣量、雜氣（圖1-C）和濃度的平均評分高于對照組，其中香氣量和雜氣的平均評分在處理組和對照組間分別達顯著和極顯著（＜0.01）差異水平。因此，經菌劑處理的煙葉香氣量增加、雜氣減少。評吸總評分顯示，對照組的總評分為50.46分，處理組的總評分為49.70分，二者間差異不顯著（=0.5489）。

2.3 Bt菌劑處理對煙葉細菌群落的影響

2.3.1 細菌群落結構 基于16S rDNA擴增子測序技術，共得到處理組和對照組樣品有效片段（Effective tags）665994條，平均長度為414 bp，聚類分析共得到347條OTU。所有的OTU注釋分類后，共有11門20綱51目90科225屬68種。

圖2顯示，與對照組相比，經菌劑處理后的煙葉細菌群落結構發生明顯改變。在綱水平上，處理組桿菌綱（Bacilli）的相對豐度最高（95.9%），其次為甲型變形菌綱（Alphaproteobacteria）（2.8%）；而對照組的丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）相對豐度最高（47.6%），甲型變形菌綱（33.7%）次之（圖2-A）。在目水平上，處理組的主要組成有芽孢桿菌目（Bacillales，95.9%）、紅細菌目（Rhodobacterales，1.2%）和立克次氏體目（Rickettsiales，1.0%）等；對照組的主要組成有腸桿菌目（Enterobacteriales，31.3%）、立克次氏體目（16.9%）和芽孢桿菌目（Bacillales，15.6%）等（圖2-B）。在科水平上，處理組中相對豐度前三的分別為芽孢桿菌科（Bacillaceae，96.0%）、紅細菌科（Rhodobacteraceae，1.2%）和無形體科（Anaplasmataceae，0.7%）；而對照組中相對豐度前三的科分別為腸桿菌科（Enterobacteriaceae，33.7%）、芽孢桿菌科（16.7%）和無形體科（8.9%）（圖2-C）。在屬水平上，芽孢桿菌屬（，95.9%）、沃爾巴克氏體屬（）（0.7%）和弧菌屬（）（0.4%）等是處理組煙葉中主要的細菌屬；而志賀氏大腸桿菌屬（）（22.9%）、芽孢桿菌屬（15.5%）和沃爾巴克氏體屬（8.3%）是對照組煙葉中主要的細菌屬（圖2-D）。

2.3.2 Alpha和Beta多樣性分析 采用Alpha多樣性分析，比較樣品的細菌多樣性指數（表2）。代表群落豐富度的指數Observed species和Chao1顯示，處理組的細菌群落豐富度顯著低于對照組。代表群落多樣性的指數Shannon和Simpson顯示，處理組的細菌群落多樣性低于對照組，但不存在顯著差異。所有樣品的覆蓋度指數Coverage均為99.9%，說明樣品的測序結果合理且具有代表性。

基于主坐標分析（PCoA）對處理組和對照組煙葉細菌群落的Beta多樣性進行分析，結果表明，處理組的細菌群落結構離散程度較對照組高（圖3-A），2組之間的分離現象明顯，說明2組間的群落結構差異較顯著（圖3-B）。

3 討論

本團隊在前期研究中，獲得1株具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌（胡逸超等，2019）。在煙葉醇化的前期噴施該菌株，可減少倉庫中煙草甲的危害。醇化對于煙葉的香味具有重要作用，不同的醇化條件會導致煙葉的致香成分發生變化，從而影響煙葉的評吸質量（黃靜文等，2010）。已有研究表明，細菌發酵的作用會對煙葉化學成分產生影響，不同菌株產生的效果不盡相同（高文霞等，2011；龍章德等，2014）。有研究發現，微生物的應用可能縮短煙葉發酵周期，改善煙葉香氣（張亞恒等，2015；Liu et al.，2021）。在煙葉的風干過程中，添加芽孢桿菌可降低煙葉的有害物質亞硝胺含量（Wei et al.，2014）。綜上所述，對于醇化過程的任何改變，包括添加微生物菌株，均有可能改變煙葉的醇化效果。雖然有研究報道應用到煙葉不影響其化學成分及評吸效果（Blanc et al.，2014），同時本研究所采用的菌株主要目的為防控煙草甲危害，但使用該菌劑處理煙葉是否會影響其品質尚未知。本研究的主要目的是闡明GXZY032菌株對煙葉醇化的影響，為后期該菌株的應用提供效益或安全方面的評價。

本研究結果表明，在長達2年的醇化中，使用蘇云金芽孢桿菌GXZY032未對煙葉的化學成分造成顯著影響。在感官質量的評估中發現，噴施GXZY032后，煙葉香氣量提升、雜氣改善；香氣質、透發性和甜度則表現出一定程度的下降。盡管這5個感官質量評分在統計學上具有顯著差異，但其平均值差異均小于5%。以往也有研究表明，采用不同方法進行煙葉醇化時，會造成某一感官指標更優而另一指標評分降低的現象（Li et al.，2020）。采用蘇云金芽孢桿菌干粉，主要是考慮芽孢在煙草倉庫中能存活的時間較久，可達到長期控制煙草甲的作用。本研究結果表明，芽孢形態的菌劑可能在煙葉醇化的過程中對感官質量有一定影響，但影響程度較低。綜上所述，可見菌株GXZY032對煙葉化學成分和感官質量的影響較小，不會造成煙葉品質的明顯下降，說明在倉儲中使用該菌株防控煙草甲影響煙葉品質的風險較小。

煙葉中常見的細菌種類較多，主要有芽孢桿菌（）、假單胞菌（Pseudomonas）、鞘脂單孢菌（）、寡養單胞菌（）、歐文氏菌（）、泛菌（）、乳球菌（）、梭菌（）、葡萄球菌（）、腸桿菌（）和類芽孢桿菌（）等（Zhao et al.，2007；Huang et al.，2010；Su et al.，2011；Chopyk et al.，2017；Ye et al.，2017）。Zhou等（2020）研究表明，醇化的煙葉微生物組成中，丙型變形菌綱、腸桿菌目和腸桿菌科含量在各自分類水平上均為豐度最高的物種，屬于最主要的細菌種類；本研究對照組中相對豐度最高的物種在綱、目和科這3個水平上與Zhou等（2020）的研究結果一致，說明不同倉庫的醇化煙葉之間，優勢細菌存在一定相似性。本研究中，菌株處理后的煙葉細菌群落Alpha和Beta多樣性指數均降低，群落結構也較對照組表現出明顯的差異，表明人為添加菌株改變了煙葉的細菌群落多樣性和結構，與前人研究結果（Polenogova et al.，2021；Zhang et al.，2021）一致。處理組中相對豐度最高的OTU為芽孢桿菌且含量高達95.9%，可能與人為添加菌株會造成該菌株在煙葉中的定殖，進而產生細菌素，抑制其他細菌的生長有關（Cherif et al.，2008）。同時，菌株處理明顯降低了煙葉腸桿菌目的相對豐度。腸桿菌目的細菌作為一種食品污染指示菌，在食品中豐度降低有利于食品安全（Amorim and Nascimento，2017）。然而，也有研究表明，人為添加蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑在食品中會有殘留，對于其殘留可能帶來的風險引起了人們對食品安全的擔憂（Frederiksen et al.，2006；Johler et al.，2018）。為防控煙草甲而添加的蘇云金芽孢桿菌是否會影響香煙的安全使用，仍需進一步研究。

4 結論

經蘇云金芽孢桿菌處理后，煙葉中的細菌群落結構發生顯著變化，但對煙葉化學成分和感官質量的影響較小，不造成煙葉品質的下降，說明在倉儲中使用該菌株防控煙草甲的經濟風險較小。