煙草黑脛病拮抗細菌的分離、鑒定及發酵條件優化

何明川，施春蘭，魏聰聰，曾舒泉，蘭明先，唐 萍，王志江，伍顯錄，陸光鈺，謝永輝*

（1云南農業大學植物保護學院，云南昆明 650201；2云南省煙草公司昆明市公司，云南昆明 650051；3紅塔煙草（集團）有限責任公司，云南玉溪 653100）

0 引言

【研究意義】煙草黑脛病是對煙草產業危害最嚴重的病害之一，主要由煙草疫霉菌（var.）引起，在煙草苗床期或移栽種植期均會侵染發病，主要侵染煙株的莖基部，隨后向莖髓部蔓延擴展，發病嚴重時整株枯死（Han et al.，2016；李小杰等，2019；李苗苗等，2020a）。目前在我國主要產煙區均有煙草黑脛病發生，常年發病率為10%～15%，嚴重時發病率高達80%，嚴重影響煙草的生產和煙農的經濟收入（Johnson et al.，2002；李梅云，2012）。現階段，防治煙草黑脛病以化學防治方法效果最顯著，但化學防治容易造成水源污染、土壤農藥殘留、病原菌產生抗藥性等一系列問題（羅華元等，2010）。生物防治具有無污染、無公害、高效等優點，在煙草病害綜合防治中占有越來越重要的地位（李義強等，2011；程睿君，2019）。目前防治煙草黑脛病的生防菌多來源于植株和根際土壤，但這些生防菌的定殖能力及對病原菌的抑制效果不穩定（何明川等，2021）。食腐昆蟲如美洲大蠊（）長期生活在遍布病原微生物的下水道、垃圾堆和污水管等惡劣環境，具有很強的繁殖力和抗病能力。有文獻報道，用抗生素消除美洲大蠊的腸道細菌后，美洲大蠊抵抗病原菌的能力明顯下降，易被感染而引起疾病，說明美洲大蠊腸道內存在大量對病原菌具有抗病作用的共生菌，其產生的活性物質有助于增強寄主對病原菌的抵抗力（陳至里等，2016；蔣詩林等，2021）。若能從美洲大蠊腸道篩選獲得具有高效拮抗病原菌作用的生防菌株并應用于煙草病害防控，對煙草產業的可持續發展具有重要意義。【前人研究進展】研究發現芽孢桿菌和假單胞菌對煙草黑脛病有較好的防治作用，這些細菌能分泌不同的拮抗物質，如分泌脂肽類化合物、聚酮類化合物和多肽類化合物等多種具有抑菌和殺菌作用的次級代謝產物以抑制病原菌的生長，致使病原菌的細胞壁溶解、菌絲生長形態畸形（黃大躍，2020；李巧玲等，2020；張德鋒等，2020；糾敏等，2021）。李苗苗等（2020b）采用平板試驗法和對扣法研究發現貝萊斯芽孢桿菌GY1、解淀粉芽孢桿菌GY10及枯草芽孢桿菌GY12均具有分泌嗜鐵素和蛋白酶的能力，且對煙草黑脛病等多種病原真菌有顯著的抑制作用。李永麗等（2021）以葡萄座腔菌為供試病原菌，測定菌株Pm9無菌發酵液對葡萄座腔菌孢子萌發和菌絲生長的影響，研究發現菌株Pm9能產生多種肽聚糖、聚酮糖類抗性化合物和細胞壁水解酶，可使葡萄座腔菌菌絲膨大畸形、抑制菌絲生長和孢子萌發。針對煙草黑脛病拮抗菌也有較多研究。千慧敏等（2019）通過平板對峙和含毒介質法篩選出1株拮抗菌銅綠假單胞菌PG3402，其可產生纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素等抗菌物質，盆栽試驗結果表明，菌株PG3402對煙草黑脛病的防效與對照藥劑相當。張蒙蒙等（2022）從發生煙草黑脛病病株根際土壤選出2株拮抗菌，鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌和貝萊斯芽孢桿菌，2株菌株均能分泌合成地非西丁（difficidin）和豐原素（fengycin），對煙草黑脛病生防效果分別達50.5%和61.5%。近年來，有關芽孢桿菌發酵條件的報道較多，但不同的發酵條件產生的生防效果不同。汪晶晶等（2018）研究發現解淀粉芽孢桿菌GM-1-2的最佳發酵條件為培養溫度28 ℃，培養時間30 h，優化發酵液對白色念珠菌抑菌帶寬度由20.00 mm增加至38.67 mm；吳志美等（2019）研究發現具有除草活性成團泛菌ZLSY20菌株的最適發酵條件為培養溫度32 ℃，發酵時間24 h；黎燕珊等（2021）報道貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株的最佳發酵條件為培養溫度37 ℃，培養時間48 h，優化后的發酵液對煙草疫霉的防效為59.03%，高于優化前的55.24%；張曉勇等（2021）發現貝萊斯芽孢桿菌SB023發酵的最佳條件為培養溫度28～30 ℃，培養時間36 h，優化發酵液對杧果炭疽病病原菌的抑菌活性顯著高于優化前。【本研究切入點】目前煙草黑脛病拮抗菌的獲取對象仍局限于煙草植株，從其他植物中分離獲得拮抗菌的報道也較少見，而有關食腐昆蟲腸道生防菌的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】采用稀釋涂布平板法從美洲大蠊腸道分離對煙草黑脛病菌具有高效拮抗作用的菌株，采用16S rDNA和基因序列分析對分離獲得的拮抗菌株進行分類鑒定，并對拮抗菌株進行發酵條件優化及煙草黑脛病盆栽防效測定，旨在為拓寬煙草黑脛病生防菌的來源渠道及煙草黑脛病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 生防菌：從山東第一醫科大學飼養的美洲大蠊腸道內分離獲得。病原菌：煙草疫霉，從昆明市富民縣款莊鎮煙草黑脛病發病嚴重煙株分離獲得。

1.1.2 供試培養基 營養瓊脂培養基（NA）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。蛋白胨酵母培養基（LB）：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。細菌基礎培養基（CM）：葡萄糖5 g/L，（NH）SO2 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO·7HO 2 g/L，KHPO4 g/L，KHPO6 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。牛肉膏酵母葡萄糖培養基（NYBD）：牛肉浸膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。蛋白胨酵母蔗糖培養基（YSP）：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。燕麥培養基（OA）：燕麥30 g/L，瓊脂18 g/L，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑及儀器 蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母浸粉和NaCl等分析純試劑購自廣東環凱微生物科技有限公司；PCR儀，Eppendorf AG 22331 Hamburg型；SPX-300B-Ⅱ型生化培養箱購自北京市永光明醫療儀器有限公司；恒溫搖床購自上海知楚儀器有限公司；紫外可見分光光度計購自島津儀器（蘇州）有限公司。

1.2 拮抗菌分離和鑒定

1.2.1 拮抗菌分離 先將美洲大蠊成蟲以75%酒精漂洗3次，每次2 min，然后用無菌水漂洗3次，解剖獲得完整的美洲大蠊消化道。將美洲大蠊消化道剪碎后放入無菌離心管中，用研磨棒充分研磨，加入1 mL無菌水，制備梯度稀釋菌懸液。取10、10、10和10稀釋度的菌懸液100 μL分別涂布于NA培養基上，每個梯度3次重復。倒置平皿于28 ℃·培養箱中培養3 d。在超凈工作臺上用無菌挑針將NA培養基上長出的單菌落挑取于LB培養基上劃線培養；純化3～4次，將菌株保存于4 ℃冰箱備用（馮志珍等，2012；駱米娟等，2016）。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 采用平板對峙法篩選拮抗菌。使用無菌打孔器（直徑6 mm）在已活化的煙草疫霉平板上打孔，再用無菌鑷子取1塊菌餅接種于另一新的OA培養基中央；用無菌牙簽在距菌餅2 cm左右處十字線對稱接種分離獲得的細菌，以只接煙草疫霉的OA培養基為對照，3次重復，于28 ℃培養5 d后觀察并記錄抑菌圈大小。復篩方法同初篩，再次篩選抑菌圈大且效果穩定的菌株（周建云等，2017）。

1.2.3 拮抗菌株菌落形態及生理生化特性測定在LB培養基上接種拮抗菌株，28 ℃培養3 d，待長出單菌落后觀察形態。根據《微生物學實驗》對拮抗菌株的生理生化特性進行測定（王進等，2014）。

1.2.4 16S rDNA和基因測序及系統發育進化樹構建 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（百邁客生物科技有限公司）提取拮抗菌株基因組DNA。使用16S通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC A-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），基因引物UP-1（5'-GAAGTCATCATGACCGT TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'）和UP-2r（5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC RTCNGCRTCNGTCAT-3'）對拮抗菌株的16S rDNA和基因進行PCR擴增［引物由生工生物工程（上海）股份有限公司）合成］。反應體系50 μL：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，ddHO18 μL。擴增程序：94.8 ℃預變性2.5 min；98 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃20 s，進行30個循環；72 ℃延伸2 min。PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送昆明擎科生物公司測序。測序結果在NCBI上進行BLAST比對，并選擇同源性較高的序列使用ClustalX 1.83和MEGA 7.0構建系統發育進化樹（李小杰等，2019）。

1.3 拮抗菌株的發酵條件優化

1.3.1 種子液制備 接種拮抗菌株單菌落于裝有50 mL/250 mL LB培養液的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒溫培養箱中培養24 h后備用（王進等，2014）。

1.3.2 培養基優選 配制YSP、NYBD、NA、LB和CM 5種培養基各100 mL，分別接入100 μL種子液，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h后，取出測定不同培養基中細菌的OD，篩選出最佳培養基（何明川等，2021）。每處理3次重復（下同）。

1.3.3 不同碳源對拮抗菌株生長速度的影響 采用1.3.2篩選出的最佳培養基，分別用麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉作為碳源，其余成分保持不變，接入拮抗菌在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳碳源（何明川等，2021）。

1.3.4 不同氮源對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養基，分別用氯化銨、酵母、硝酸銨、甘氨酸和蛋白胨作為氮源，其余成分保持不變，接入拮抗菌在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳氮源（何明川等，2021）。

1.3.5 接菌量對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養基，種子液為液體培養基的體積百分比2%、4%、6%、8%和10%，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳接菌量（蘭明先等，2021）。

1.3.6 裝液量對拮抗菌株生長的影響 分別配制最佳培養基30、60、90、120和150 mL，接入種子液，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳裝液量（蘭明先等，2021）。

1.3.7 pH對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養基，分別調節pH為4、5、6、7、8、9和10。接入種子液，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳pH（蘭明先等，2021）。

1.3.8 最佳接菌量、裝液量和初始pH正交試驗設計L（3）正交表，設3因素3水平正交試驗對篩選出的拮抗菌株適宜生長接菌量、裝液量及初始pH進行正交試驗，篩選拮抗菌株的最佳接菌量、裝液量和初始pH（黎燕珊等，2021）。

1.3.9 轉速對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養基，接入種子液，振蕩培養時調節轉速分別為120、150、180、210和240 r/min，培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳轉速（蘭明先等，2021）。

1.3.10 溫度對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養基，接入種子液，分別在20、24、28、32、36和40 ℃培養24 h后，取出測定培養基中細菌的OD，篩選出最佳培養溫度（蘭明先等，2021）。

1.3.11 培養時間對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養基，接入種子液，培養條件采用上述優化條件，開始培養24 h內每隔2 h測量一次培養基中細菌的OD，24 h后每隔12 h測量一次OD，繪制細菌生長曲線，篩選出最適培養時間（何明川等，2021）。

1.3.12 溫度、培養時間和轉速正交試驗 設計L（3）正交表，設3因素3水平正交試驗對篩選出的拮抗菌株適宜生長溫度、培養時間和轉速進行正交試驗，篩選拮抗菌株的最佳培養溫度、培養時間和轉速（黎燕珊等，2021）。

1.3.13 優化后的培養基與發酵條件對拮抗菌菌株生長的影響 分別配制原始基礎培養基和優化培養基100 mL，加入種子液10 mL，在不同發酵條件下培養24 h后，測定培養基中細菌的OD。

1.4 室內防效試驗

采用拮抗菌菌液灌根處理煙苗測定其對黑脛病的防效。煙草疫霉在燕麥培養基上培養21 d后，刮取菌絲加入10 mL 0.1% KNO溶液浸泡3 d，然后加入20 mL無菌水攪碎，4 ℃下放置30 min取出后調整孢子濃度為1×10CFU/mL，再加入1%葡萄糖溶液備用；拮抗細菌菌液分為優化前和優化后2個處理（1×10CFU/mL）。灌根處理6葉期的煙苗，在3組煙苗根際周圍分別均勻傾倒拮抗菌菌株優化前發酵菌液、優化后發酵菌液和無菌水（CK），每株10 mL，2 d后接種煙草疫霉游動孢子懸浮液10 mL；每處理15株煙苗，3次重復。14 d后調查煙草植株發病情況，統計發病率和病情指數，計算防治效果（蘭明先等，2021）。

病害分級標準參考GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》。0級，全株無病；1級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎；3級，莖部病斑環繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑；5級，莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環繞莖圍，或1/2～2/3葉片凋萎；7級，莖部病斑全部環繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎；9級，病株基本枯死。

1.5 統計分析

采用Excel 2010對試驗數據進行處理及圖表制作；運用DPS 3.01進行方差分析，Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

從食腐昆蟲美洲大蠊腸道初步分離得到200株細菌，經平板對峙有5株菌株對煙草疫霉具有較好的拮抗作用（表1），其中菌株MC2-1的抑菌效果最強，抑菌帶寬為8.00 mm，平均抑菌率為62.87%（圖1），因此選取菌株MC2-1進行后續研究。

2.2 拮抗菌株的形態特征及生理生化特性測定結果

菌株MC2-1的菌落直徑1.57～6.37 mm，圓形，白色，凹透鏡隆起，表面干燥有褶皺且邊緣完整，菌體桿狀有芽孢（圖2）。生理生化特性測定結果（表2）顯示，菌株MC2-1淀粉水解試驗、明膠液化試驗、葡萄糖發酵結果為陽性；菌株革蘭氏染色、油脂水解試驗、石蕊牛奶試驗、乳糖發酵等結果為陰性。根據形態觀察及生理生化特性測定結果，初步確定菌株MC2-1為芽孢桿菌屬（）。

2.3 拮抗菌株16S rRNA和gyrB基因序列鑒定結果

通過GenBank上傳菌株MC2-1序列得到登錄號MC2-1（OK047708），將菌株的16S rDNA和基因測序序列與數據庫已知序列比對，菌株MC2-1與貝萊斯芽孢桿菌（）的16S rDNA和基因序列同源性高達99%；基于16S rDNA（圖3）和基因（圖4）序列的系統發育進化樹分析結果顯示，菌株MC2-1均與貝萊斯芽孢桿菌處于同一分支，因此將菌株MC2-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌株發酵條件優化結果

2.4.1 不同培養基對拮抗菌株生長的影響 由圖5可知，菌株MC2-1在NYBD、YSP、LB、NA和CM等5種不同培養基中的菌體量差異顯著（=3.032，=0.0405），其中在NYBD培養基中的菌體量最多，OD為2.23，顯著高于在CM培養基中的菌體量（＜0.05，下同），但與其余3種培養基中的菌體量差異不顯著（0.05，下同）。因此，選擇NYBD培養基為菌株MC2-1發酵基礎培養基。

2.4.2 不同碳源對拮抗菌株生長的影響 由圖6可知，菌株MC2-1分別在以麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉作為唯一碳源的培養基上菌體量差異顯著（=7.353，=0.005），其中以麥芽糖為碳源時的菌體量最多、菌株生長最快，OD為2.56。因此，選擇麥芽糖作為最佳碳源。

2.4.3 不同氮源對拮抗菌株生長的影響 由圖7可知，菌株MC2-1分別在以氯化銨、酵母浸粉、硝酸銨、甘氨酸和蛋白胨為唯一氮源的培養基上菌體量差異顯著（=10.321，=0.0014），其中以酵母浸粉為氮源時的菌體量最大、菌株生長最快，OD為2.43，顯著高于以甘氨酸為氮源時的菌體量，但與氯化銨、硝酸銨和蛋白胨為氮源時的菌體量差異不顯著。因此，選擇酵母浸粉作為最佳氮源。

2.4.4 不同接菌量對拮抗菌株生長的影響 由圖8可知，在不同接菌量培養基中菌株MC2-1的菌體量差異不顯著（=1.574，=0.2552），其中以接菌量為10%時的OD最大，為2.61，隨著接菌量的增加，發酵液中拮抗菌的菌體濃度呈逐漸上升趨勢。

2.4.5 不同裝液量對拮抗菌株生長的影響 由圖9可知，菌株MC2-1在不同裝液量的培養基中菌體量差異顯著（=35.307，=0.0001），其中裝液量為30 mL時菌液的OD最大，為2.71，隨著裝液量的增加，菌液的OD逐漸下降。

2.4.6 不同pH對拮抗菌株生長的影響 由圖10可知，不同pH對菌株MC2-1的生長影響差異顯著（=1420.398，=0.0001），其中菌株MC2-1在pH 4時生長受到明顯抑制，pH在5～7時生長較好，pH 6時的菌體量最大，OD為2.63，pH高于6后菌液的OD逐漸下降。

2.4.7 接菌量、裝液量和初始pH正交試驗結果接菌量、裝液量和初始pH正交試驗結果（表3）顯示＞＞，說明pH對菌株MC2-1生長速度的影響最大，其余依次為裝液量和接菌量，其最佳組合為A3B1C3，即最佳發酵條件為接菌量10%、裝液量30 mL、初始pH 7。

2.4.8 不同轉速對拮抗菌株生長的影響 由圖11可知，不同轉速對菌株MC2-1的生長影響差異顯著（=78.511，=0.0001），隨著轉速的增加，發酵液中的菌體量呈先升高后降低的趨勢，當轉速為180 r/min時OD達最大值，為2.46，當轉速高于或低于180 r/min時發酵液中的菌體量均有所下降。

2.4.9 不同培養溫度對拮抗菌株生長的影響 由圖12可知，不同培養溫度對菌株MC2-1的生長影響差異顯著（=51.092，=0.0001），隨著培養溫度的升高，發酵液中菌體量呈先逐漸升高后下降的趨勢，36 ℃時菌株生長最快，OD為2.66。

2.4.10 不同培養時間對拮抗菌株生長的影響 如圖13所示，菌株MC2-1在不同培養時間條件下的生長速度存在顯著差異（=1504.837，=0.0001），隨著培養時間增加發酵液中菌體量逐漸上升，在培養時間為13～16 h時菌體量增長最快，培養16 h后菌體量增長速度放緩，在60 h時達最大值，OD為2.56，繼續延長搖床培養時間，細菌生長速度開始減慢。

2.4.11 培養時間、溫度和轉速正交試驗結果 培養時間、溫度和轉速正交試驗結果（表4）顯示＞＞，說明溫度的變化對菌株MC2-1生長速度影響最大，其余依次為培養時間和轉速，其最佳組合為A2B2C2，即菌株MC2-1最佳培養時間為60 h、最佳培養溫度為36 ℃、轉速180 r/min。

2.4.12 優化后的培養基與發酵條件對拮抗菌株生長的影響 如表5所示，優化后的培養基和發酵條件下菌液濃度均顯著高于原始培養基和發酵條件的菌液濃度，表明優化后的培養條件可提高菌株MC2-1的菌體量。

2.5 室內盆栽防效試驗結果

室內盆栽試驗結果（表6）顯示，對照處理煙草黑脛病的病情指數為80.95，經優化后發酵液處理煙草黑脛病的病情指數為29.63，顯著低于優化前的38.27；同時，優化后發酵液對煙草黑脛病的防治效果為63.92%，顯著高于優化前的53.72%。

3 討論

煙草黑脛病目前尚無有效的防治方法，而生物防治具有安全、有效、持久等優點，是近年來的研究熱點之一（崔麗等，2016；李文鵬等，2020；黎燕珊等，2021）。抑制煙草黑脛病的生防菌常從土壤和煙株中分離得到（何明川等，2021），如王革等（2001）從土壤中分離得到1株木霉菌株長枝木霉（），程睿君（2019）從土壤中分離到1株解淀粉芽孢桿菌（），這些篩選得到的拮抗細菌存在定殖成活率較低，對煙草黑脛病菌的抑制率不理想等問題。而微生物與昆蟲正常生命活動有著密切關系，在宿主昆蟲的生長發育、營養利用及免疫等方面發揮著重要作用，因此昆蟲腸道豐富的微生物資源具有巨大的應用前景（陳至里等，2016）。美洲大蠊食性復雜，長期生活在有大量病原菌的陰暗潮濕環境中，其腸道的共生菌可能產生抗菌物質來增強其對病原菌的抵抗力，對病原菌的抑制效果可能更加穩定（蔣詩林等，2021）。有研究表明，從美洲大蠊腸道分離到的拮抗菌有芽孢桿菌屬、放線菌屬和銅綠假單胞菌屬等，其中放線菌屬報道較多，其抑菌譜廣，能產生多種抗菌成分，對病原真菌和細菌均有較好的抑制作用（區佩渝等，2019）。本研究從美洲大蠊腸道內初步分離得到200株細菌，經平板對峙試驗鑒定有5株細菌對煙草疫霉具有抑制作用，其中菌株MC2-1的抑菌效果最強，對煙草疫霉的抑制率達62.87%。通過形態觀察、生理生化特性及16S rDNA和基因序列分析，初步鑒定菌株MC2-1為貝萊斯芽孢桿菌。

優化生防菌培養條件可提高菌株的菌體量和抑菌物質產量，進而提高生防效果（洪鵬等，2013）。本研究從發酵培養基成分及發酵條件探索菌株MC2-1最適生長條件，結果顯示，NYBD培養基為菌株MC2-1最佳培養基，與蘭明先等（2021）研究發現澤蘭實蠅幼蟲消化道菌株ZLSY5的最佳培養基為NYBD相似。其中，培養菌株MC2-1的最佳碳源為麥芽糖、最佳氮源為酵母浸粉，雖然不同的碳源、氮源均能被菌株MC2-1利用，但對菌株菌體量積累影響差異顯著。在發酵條件優化方面，明確菌株MC2-1在20～40 ℃均能生長，且在36 ℃生長最好，與黎燕珊等（2021）的研究結果相似；菌株MC2-1在pH 5～7生長較好，pH 6時生長最佳，與張曉勇等（2021）的研究結果相近；裝液量、轉速和接菌量對菌株MC2-1的影響較大，當裝液量為30 mL、接菌量為10%、轉速為180 r/min時最適于菌株生長。綜上所述，明確菌株最佳培養條件有利于菌株的繁殖生長和拮抗物質產生，提高對病原菌的抑制效果。

芽孢桿菌的生物防治能力主要通過抑制植物病原菌生長、誘導植物產生系統抗性、與病原菌競爭生態位等來體現（厲彥芳等，2019；于水清等，2021）。貝萊斯芽孢桿菌是一類常見、有較好拮抗作用的細菌，在生長與繁殖過程中會產生許多具有抑菌活性的代謝產物，如蛋白酶、幾丁質酶、纖維素酶、表面活性素、伊枯草菌素和Bacillaene等（王偉等，2019）。其中，表面活性素和伊枯草菌素能破壞病原菌的細胞膜，進而抑制病原菌的生長；蛋白酶和幾丁質酶能降解真菌細胞壁中的蛋白質和幾丁質，從而起到抑菌作用（張德鋒等，2020）。Trinh等（2019）從黑胡椒根際中分離得到貝萊斯芽孢桿菌RB.DS29，該菌產生的幾丁質酶和蛋白酶能破壞病原真菌如疫霉菌（）的細胞壁，對病原真菌具有較好的抑制作用。本研究的煙草黑脛病室內盆栽防效試驗結果顯示，拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌菌株MC2-1經優化的培養條件培養后，對煙草黑脛病的拮抗效果顯著提高。菌株MC2-1對煙草疫霉作用機理、在田間的拮抗效果及對煙株是否有促生長作用等有待進一步探究。

4 結論

貝萊斯芽孢桿菌菌株MC2-1對煙草疫霉具有較好的抑制作用，其最佳培養基為NYBD，最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母浸粉；優化培養基配方為：牛肉浸膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，麥芽糖10 g/L；最佳培養條件為：接菌量10%、裝液量30 mL、初始pH 7、轉速180 r/min、培養溫度36 ℃、培養時間60 h。發酵條件優化后，菌株MC2-1對煙草黑脛病的平均室內防效可達63.92%。菌株MC2-1具有開發成為煙草黑脛病生防菌的潛力。