不同采烤方式對烤煙上部葉脂質褐變的影響

孫皓月，賈宏昉，謝良文，馮長春，伍德洋，秦艷青，陳漢發，郭仕平*

（1河南農業大學煙草學院，河南鄭州 450000；2四川省煙草公司，四川成都 610000；3四川省煙草公司涼山州公司，四川西昌 615000）

0 引言

【研究意義】烤煙上部葉因組織結構密而厚、生長過程中優越的田間光照通風條件導致物質積累較多，烘烤過程中常面臨定色難、易掛灰及青筋煙比例高等問題（張譯丹等，2020）。褐變反應是烘烤中煙葉色澤與香氣品質形成的關鍵步驟，過度褐變易造成煙葉掛灰、黑糟，而葉色作為煙葉收購分級中的第二分組因素，對烤煙等級的評定具有重要影響。因此，采取有效的采烤措施，提高上部葉可用性及減少褐變反應，對保證卷煙產品的煙氣濃度和豐富煙香具有重要意義。【前人研究進展】利用帶莖采烤技術降低煙葉酶促褐變反應，改善上部煙葉烤后品質，是當前烤煙上部葉技術創新的重要研究方向（仙立國等，2020；鄒凱等，2021）。近年來，通過帶莖采烤減少煙葉掛灰褐變、提高上部葉可用性越來越受到重視，多關注于酶促褐變和水分遷移等（黃浩等，2014；蔣博文等，2018；魏碩等，2019）。帶莖烘烤中莖稈的自由水向葉片內部發生運移，在變黃后組織內部仍保持較高的自由水含量，在烘烤過程中能有效促進煙葉有機物質的降解與轉化，外觀質量明顯提高（王曉賓等，2008）。而在果蔬方面，許多研究表明褐變的發生與脂肪酸代謝有著密切的聯系，龍眼果皮脂氧合酶（LOX）活性和膜脂不飽和脂肪酸的降解加速能引起龍眼果皮褐變加深（陳藝暉等，2011）；通過降低板栗不飽和脂肪酸含量，可減輕加工貯藏過程中的褐變反應（楊芳等，2013）；通過調節玉米、余甘子的貯藏溫度，可減輕褐變，抑制脂肪酸積累（張福平等，2014；洪宇等，2020）；延緩雙孢蘑菇脂質過氧化進程，能降低其褐變指數（李靜等，2019）。上述研究結果均表明果蔬類的脂肪酸代謝和氧化是影響褐變進程的重要因素之一。【本研究切入點】煙葉烘烤過程中褐變是多因素綜合影響的結果，前人多關注于酶促褐變，對煙葉脂質氧化褐變研究甚少，不同采烤方式下脂質氧化對煙葉褐變的影響研究更是鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】設置4種采烤方式，從細胞生物學和分子方向對不同采烤方式下脂質氧化與烤煙上部葉的褐變關系進行系統研究，為提高烤煙上部葉可用性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021年在廣元市劍閣縣普安鎮基地開展，品種為云煙87。選擇在當地煙葉適熟季節，采收落黃均勻、長勢一致的煙葉，帶莖采收煙葉選取葉色均勻，葉面積大小、莖稈粗細基本一致煙葉及其莖稈為試驗材料，有效留葉數為18片（包括腳葉3片），煙株采收至上部葉6片時，自頂部向下標記為1～6葉位。

1.2 試驗設計

煙葉帶莖方式設4個處理：CK，常規分次采收（正常采烤）；T1，3～4葉位一次性帶莖割收（2片煙葉帶莖烘烤）；T2，2～5葉位一次性帶莖割收（4片煙葉帶莖烘烤）；T3，1～6葉位一次性帶莖割收（6片煙葉帶莖烘烤）。莖切口距離最近葉柄1～2 cm，每處理5桿置于同一密集烤房中棚觀察窗位置進行烘烤，在變黃關鍵期干球溫度達42 ℃、煙葉黃片青筋主脈發軟、烘烤72 h時取樣，選取每處理第3葉位的10片煙葉立即運往實驗室；采用半葉法將煙葉一分為二并去除主脈，一半葉片4 ℃保存用于超微結構觀察，另一半葉片放入液氮內速凍后置于-80 ℃冰柜儲存，用于酶活性與基因測定，每處理3次重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 褐變程度測定 選取放置取樣窗口的每處理5片煙葉，用于烘烤過程中顏色變化的測定。參考汪代斌等（2017）的方法，采用Photoshop像素法計算煙葉變褐部分面積與總葉片面積（圖1），從煙葉烘烤開始每隔24 h進行褐變比例統計，測定褐變程度，進而計算褐變速度。褐變面積/葉片面積＜15%為輕度褐變，褐變面積/葉片面積≥15%為中度及以上褐變。

1.3.2 超微結構分析 參考鄭小雨等（2020）的方法，在變黃期42 ℃烘烤72 h時選取各處理葉片第5～第7支脈之間右側相同的位置，用手術刀切成1 mm×1 mm小塊，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH 7.2～7.4，0.1 mol/L PBS緩沖液配制）中固定。透射電鏡觀察角質層：用1%鋨酸（pH 7.2～7.4，0.1 mol/L PBS緩沖液配制）固定，經100%丙酮脫水后用Epon812環氧樹脂包埋聚合；用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片機（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）切出超薄切片，經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，再用JEM-1400Plus型透射電鏡（日本電子株式會社）進行觀察并拍照，每處理觀察10個視野。用Photoshop 2020進行標注處理。

1.3.3 LOX活性測定 LOX活性按照酶活試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書方法進行測定。

1.3.4 脂肪酸含量測定 烘烤中煙葉脂肪酸等成分參考YC/T 288—2009《煙草及煙草制品 多元酸（草酸、蘋果酸和檸檬酸）的測定 氣相色譜法》的方法進行測定。

1.3.5 烤后煙葉分級 參考GB 2635—1992《烤煙》對烤后煙葉進行分級，計算烤后煙葉的等級結構。

1.3.6 基因表達量分析 在變黃期42 ℃烘烤72 h時選取各處理葉片，采用TRIzol法提取煙葉總RNA，通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。根據Gen-Bank發布的、、、、和脂肪酸代謝相關基因，以L25煙草核糖體蛋白作內參基因（GenBank：L18908.1）（表1），采用2算法（黃化剛等，2016）進行分析，每個樣品3次重復。

1.4 統計分析

使用檢驗比較2個樣本組，結果以平均值±標準誤差表示，使用SPSS 21.0進行統計分析，Origin 2022制圖。

2 結果與分析

2.1 烘烤過程中煙葉褐變比例與烤后煙葉褐變比例統計結果

通過對比發現，烘烤過程中不同采烤處理的上部葉顏色變化趨勢基本相同（圖2-A），煙葉褐變速度排序為：6片煙葉帶莖烘烤處理＜4片煙葉帶莖烘烤處理＜2片煙葉帶莖烘烤處理＜正常采烤處理（圖2-B）。由此可知，與正常采烤處理相比，隨著帶莖葉片數的增加，褐變反應逐漸減輕，說明帶莖處理在降低褐變程度上起著一定作用。

由圖2-C可知，不同采烤處理煙葉褐變比例排序為：2片煙葉帶莖烘烤處理＞正常采烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞6片煙葉帶莖烘烤處理，其中4片和6片煙葉帶莖烘烤處理煙葉烤后褐變比例較正常采烤處理分別減少1.34%和4.22%（絕對值）。與正常采烤處理煙葉相比，2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理分別提高上等煙比例20.71%、22.02%和43.99%，其中6片煙葉帶莖烘烤處理的中上等煙比例最高，較正常采烤處理提高1.67%（絕對值）。

2.2 煙葉細胞超微結構觀察結果

如圖3所示，變黃期42 ℃烘烤72 h時，帶莖烘烤處理明顯降低煙葉角質層厚度。正常采烤處理上部葉角質層較厚，達0.436 μm，2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理較正常采烤處理分別減少34.09%、43.86%和46.40%，其中6片煙葉帶莖烘烤處理的角質層最薄，顯著低于正常采烤處理（＜0.05，下同）。說明對比正常采烤處理上部葉，帶莖處理煙葉角質層更薄。

2.3 煙葉的脂肪酸含量分析結果

不同采烤處理對上部葉變黃期42 ℃烘烤72 h時脂肪酸含量的影響如圖4-A所示，烤后煙葉均檢測到7種脂肪酸，C14：1（肉豆蔻酸）含量表現為6片煙葉帶莖烘烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞2片煙葉帶莖烘烤處理＞正常采烤處理，但C18：2（亞油酸）、C16：0（棕櫚酸）、C18：0（硬脂酸）、C20：0（花生酸）、C18：1（油酸）和C18：3（亞麻酸）含量均表現為正常采烤處理高于帶莖采烤處理。正常采烤處理煙葉的脂肪酸總量分別是2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理的1.12、1.15和1.17倍。其中6片煙葉帶莖烘烤處理的C16：0和C18：2含量較正常采烤處理分別降低15.73%和12.72%，差異達顯著水平；C16：0、C18：2和C18：0含量均表現為正常采烤處理＞2片煙葉帶莖烘烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞6片煙葉帶莖烘烤處理，含量隨葉片數增加而下降。6片和2片煙葉帶莖烘烤處理的C18：1和C18：3含量分別為5.19和5.40 mg/g，較正常采烤處理煙葉含量分別降低20.64%和17.42%，分別達極顯著（＜0.01，下同）和顯著差異。

在烘烤變黃關鍵期，LOX活性表現為正常采烤處理＞2片煙葉帶莖烘烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞6片煙葉帶莖烘烤處理，其中6片煙葉帶莖烘烤處理與正常采烤處理間存在顯著差異（圖4-B）。說明6片煙葉帶莖烘烤處理煙葉在一定程度上飽和與不飽和脂肪酸的積累較多，脂質降解氧化和脅迫應答能力更強。

2.4 不同采烤處理煙葉脂肪酸代謝相關基因表達量的變化

以正常采烤處理煙葉的基因表達量為1，通過對4種采烤處理變黃期42 ℃烘烤72 h時6個脂肪酸代謝基因進行表達分析（圖5），發現對比正常采烤處理煙葉，4片和6片煙葉帶莖烘烤處理各脂肪酸代謝基因表達量均下調，且趨勢相似，帶莖與不帶莖處理煙葉之間的表達差異較大，帶莖烘烤處理中6片煙葉的脂肪酸代謝影響作用最大，其表達量均遠小于正常采烤處理煙葉，、、和基因相對表達量分別顯著降低56.03%、46.35%、53.79%和55.02%，和相對表達量分別極顯著降低87.28%和90.96%。

2.5 煙葉脂質氧化指標相關分析結果

分析變黃期42 ℃烘烤72 h時煙葉脂肪酸含量、角質層厚度和LOX活性之間的相關性，結果（圖6）顯示，角質層厚度與C16：0呈顯著正相關，與C18：0和脂肪酸總量呈極顯著正相關，相關系數分別為0.977、0.991和0.997。C16：0、C18：1+C18：3與LOX活性分別呈顯著和極顯著正相關，說明變黃期LOX活性對烤后煙葉棕櫚酸、油酸和亞麻酸含量的積累具有正向作用。

3 討論

本研究以不同采烤處理的云煙87上部葉為試材，烘烤中煙葉隨時間變化和帶莖處理葉片數量增加而褐變速度減緩，煙葉褐變程度減輕，且4片和6片煙葉帶莖處理的上等煙比例提高，煙葉烤后褐變比例分別減少1.34%和4.22%（絕對值），與黃浩等（2014）的研究結果一致，即6片煙葉帶莖烘烤處理效果最佳。煙葉角質層主要由角質和蠟質組成，角質是一種由甘油、羥基脂肪酸及環氧脂肪酸組成的聚酯聚合物。大量研究表明植物脂肪酸代謝（脂質氧化）與角質層形成密切相關，角質層可作為研究脂肪酸代謝的一個參考指標（張婧等，2015；陳偉等，2016；楊綠竹等，2020）。表皮角質能有效調控表皮細胞的滲透性，阻止葉片中水分的非氣孔性散失（徐呈祥等，2021），脂質含量和角質厚度均發揮著重要作用。電鏡檢測結果表明，在烘烤變黃關鍵期，正常采烤處理煙葉的角質層較厚，帶莖處理煙葉角質層厚度隨葉片數增加而逐漸減少，說明帶莖處理對烘烤中煙葉角質蠟質具有重要影響。隨著烘烤溫度的逐漸升高，角質層對外界環境因子的響應較敏感，通過改變角質層厚度構建有效防御機制，可減少脅迫因子的作用，延緩煙葉內部的水分散失，與張譯丹等（2020）研究烘烤過程中表皮微觀形態特征的結果相一致。

植物角質蠟質的起始合成在表皮細胞的質體中進行，主要由長鏈脂肪酸組成（Li et al.，2013）。進一步對比4種采烤處理變黃期42 ℃烘烤72 h時煙葉7種脂肪酸含量，發現大多呈現出相同趨勢，即隨著帶莖處理葉片數的增加，脂肪酸含量下降，其中棕櫚酸、亞油酸、油酸和亞麻酸含量存在較大差異。說明不同采烤處理中脂肪酸總量主要受棕櫚酸、亞油酸、油酸和亞麻酸含量的影響，但不同脂肪酸在烘烤后沉積存在特異性，且可能與脂肪酸各自不同的生理功能有關。LOX是參與煙葉生長過程中脂肪酸代謝途徑的關鍵酶（羅子敬等，2017），其通過誘導不飽和脂肪酸中亞麻酸和亞油酸的氧化從而影響葉片的脂質氧化進程（李君蘭等，2022），帶莖處理煙葉中LOX活性明顯降低。相關分析結果表明，角質層厚度與脂肪酸總量、LOX活性與油酸和亞麻酸均呈極顯著正相關，提示油酸、亞麻酸和LOX可能是煙葉脂肪酸代謝的主要貢獻物質。本研究發現，帶莖處理在烘烤過程的濕熱條件下，能減弱LOX活性，煙葉細胞器和質膜的超微結構發生改變或解體的速度減慢，氧化衰老速度緩慢，減少了不飽和脂肪酸油酸、亞麻酸、亞油酸及飽和脂肪酸硬脂酸相對含量的積累，從而減輕煙葉褐變程度，其中6片煙葉帶莖采烤處理的效果最佳。

煙葉烘烤過程中發生的一系列脂肪酸氧化生理生化變化，是復雜的內在分子機制調控結果。在本研究中，煙葉在高溫高濕環境下脂肪酸代謝相關基因表達情況與其采烤處理密切相關。選取的6個基因中，對比正常采烤處理煙葉，4片與6片煙葉帶莖烘烤處理表達量均下調，且趨勢相似。醛脫氫酶（ALDHs）是一個超家族蛋白，其依賴于NAD（P），能氧化許多內源依賴性酶、脂肪族和芳香族醛，生成羧酸（劉美蘭等，2017），基因在帶莖處理變黃期42 ℃烘烤72 h時顯著下調。脂氧合酶基因家族（LOXs）參與調控LOX活性和功能，在調控脂質氧化過程中發揮重要作用（胡位榮等，2005），2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理中基因的相對表達量分別降低12.17%、22.59%和56.03%，與LOX活性降低結果一致。脂質轉移蛋白（LTPs）被證明可能有助于角質單體通過細胞壁向角質層的轉運（李曉佩等，2020），對比正常采烤處理煙葉，隨著帶莖烘烤處理煙葉葉片數量的增加，基因相對表達量逐漸下調，與帶莖處理煙葉烘烤過程中表皮蠟質積累量減少結果一致，表明該基因在蠟質層形成過程中起關鍵作用；MYB轉錄因子參與蠟質的生物合成與轉錄，對蠟質合成途徑中信號傳導與調控起著十分重要的作用（張敏等，2017），蠟質突變體基因（）類基因催化反應是超長鏈脂肪酸延伸的最后一步（Zheng et al.，2005），類基因通過等基因的上調來激活蠟質合成（Dubos et al.，2010）。、和上游調控因子表達量在不同采烤處理中變化趨勢相似，且具有顯著差異，暗示和家族基因在脂肪酸代謝途徑中發揮關鍵作用。

目前煙葉調制過程中變黃末期與定色階段的褐變研究，多集中于酚類底物在多酚氧化酶作用下迅速轉化為大量醌，最終引起褐變的酶促褐變反應。在果蔬儲存和加工中脂質氧化引起褐變等相關研究也逐漸成為熱點，除了酚類物質，糖苷類和脂質類也可能是褐變的底物，但在煙葉烘烤中的影響鮮見相關報道，特別是對煙葉脂質氧化研究甚少。綜上，本研究初步從細胞生物學、物質代謝和分子層面系統分析不同采烤處理在上部葉脂質氧化與煙葉褐變中的差異，可為證明脂質氧化參與煙葉褐變提供理論依據。雖然本研究初步證實了帶莖采烤處理對相關脂肪酸代謝基因有抑制表達作用，通過減緩脂質氧化影響煙葉的褐變，且效果顯著，但相關機制十分復雜，在分子水平上的證據仍不充分，后期將通過目的基因克隆和轉基因技術，對脂肪酸代謝關鍵基因在調控煙葉褐變過程中的功能和作用機理做進一步研究。

4 結論

脂肪酸代謝是影響煙葉褐變的重要原因之一。6片煙葉帶莖采烤處理在烘烤高溫高濕環境中能通過降低煙葉LOX脂質氧化活性、減少煙葉脂肪酸積累及抑制相關脂質基因的表達來調控減緩煙葉褐變速度。