富硒芽孢桿菌對赤紅壤硒轉化及菜心硒吸收累積的影響

廖 青，邢 穎，梁潘霞，潘麗萍，黃太慶，陳錦平，江澤普，劉永賢

（廣西農業科學院農業資源與環境研究所/廣西富硒農業研究中心，廣西南寧 530007）

0 引言

【研究意義】硒是15種人體必需微量元素之一，在疾病防治、提高人體免疫系統和防止衰老方面具有重要意義。由于人體自身不能合成硒，因此通過土壤—植物—動物轉運補硒是目前最安全有效的人體補硒途徑（Premarathna et al.，2012；Chilimba et al.，2012）。土壤硒是人體和動植物獲得硒的主要來源。廣西富硒土壤面積達7.57萬km（唐廣生等，2021），為目前中國圈定出的最大面積的富硒土壤區域。然而，在廣西富硒土壤上種植的300多個作物樣品中，只有70多個樣品能達天然富硒水平，作物富硒率僅24%（劉永賢等，2015），且天然富硒作物硒含量處于富硒農產品標準硒含量要求范圍的中下限水平（黃太慶等，2018）。土壤高硒低效問題制約了廣西富硒農業產業的可持續發展。土壤硒的生物有效性受環境微生物的顯著影響（徐巧林等，2016），微生物對土壤硒形態的轉化起著重要作用，因此，研究微生物對富硒土壤中土壤硒形態轉化作用及其對作物硒吸收累積的影響，對于開發利用廣西富硒土壤資源及生產天然富硒農產品具有重要意義。【前人研究進展】作物對土壤硒的吸收受土壤硒含量、硒形態和硒價態等多種因素影響。土壤硒的形態和價態是土壤硒有效性和遷移轉化的重要因素（Shardendu et al.，2003），而土壤硒的形態、價態、遷移及有效性受環境微生物的高度影響（Barillas et al.，2011；徐巧林等，2016）。李杰等（2013）研究發現水稻對富硒土壤中硒的吸收累積低于低硒土壤，說明土壤總硒含量并不是決定植物硒含量最主要的因素，土壤有效硒含量才是植物硒含量的決定性因素。土壤中硒通常分為可溶態硒（SOL-Se）、可交換態及碳酸鹽結合態硒（EX-Se）、鐵錳氧化物結合態硒（FMO-Se）、有機結合態硒（OM-Se）和殘渣態硒（RES-Se）5種形態（Wang et al.，2012），其中SOL-Se和EX-Se易被植物吸收利用，為土壤有效硒（Hu et al.，2014）。土壤中硒價態包括Se、Se、Se和Se（Fernández-Martínez and Charlet，2009），其中能被植株吸收利用的硒價態有Se、Se（Qin et al.，2017）和部分Se（有機硒化合物，硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸）（Pilon Smits et al.，2017）。Durán等（2013）通過共接種耐硒菌（.B16）和叢枝菌根真菌（）促進小麥谷粒對硒酸鹽和亞硒酸鹽的吸收，從而大幅提高了小麥谷粒中的硒含量；張如等（2018）從湖北恩施硒礦區超積累硒植物中分離到1株耐硒內生菌，能將亞硒酸鈉（NaSeO）轉化為硒代胱氨酸（SeCys），并能提高植株對硒的吸收和轉運能力；Luo等（2019）在冬小麥苗期接種叢枝菌根真菌，發現其能明顯促進冬小麥嫩芽和根部對硒酸鹽或亞硒酸鹽的吸收。接種富硒菌株是作物硒生物強化的有效手段（Durán et al.，2013，2015）。【本研究切入點】目前關于富硒微生物提高作物硒吸收的研究報道，多是基于在作物栽培過程中添加外源硒，通過接種富硒微生物對添加的外源硒進行轉化，促進作物硒吸收，從而提高作物硒含量。然而，利用微生物直接活化土壤硒從而促進植物硒吸收利用的相關報道甚少。【擬解決的關鍵問題】以對環境適應性強的2株富硒芽孢桿菌為供試菌株，研究其對土壤硒形態、價態、pH及對菜心硒吸收累積的影響，探索微生物—土壤—植株的硒轉化效應，為高效利用廣西富硒土壤資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試富硒芽孢桿菌分別為YLB1-6（，硒轉化率為74.22%）和TXB2-5（，硒轉化率為55.31%），由廣西農業科學院農業資源與環境研究所從富硒土壤分離、篩選獲得，并由中國典型培養物保藏中心保存，菌株保藏編號分別為CCTCC NO.M2020342和CCTCC NO.M2020343。富硒芽孢桿菌培養所用培養基為滅菌的LB培養液和營養瓊脂。試驗土壤采自廣西桂平市，為花崗巖母質赤紅壤，土壤基本理化性狀：全硒0.95 mg/kg，全氮1.30 g/kg，全磷0.736 g/kg，全鉀4.76 g/kg，堿解氮129 mg/kg，速效磷46.0 mg/kg，速效鉀82.6 mg/kg，有機質16.0 g/kg，pH 6.3。供試菜心品種為市售豐農旺50天尖葉甜菜心。

1.2 試驗設計

1.2.1 富硒芽孢桿菌的活化 從斜面菌種挑取菌種，轉接到營養瓊脂培養基上，于37 ℃下培養24～48 h進行活化。從培養好的平板上挑取菌種，轉接到營養瓊脂培養基上，于37 ℃下培養24 h。

1.2.2 菌懸液的制備 將活化好的菌株轉接到LB培養液中，于37 ℃、200 r/min搖床培養24 h后，將菌株培養液以5000 r/min轉速離心10 min收集菌體，用無菌的0.85%氯化鈉清洗菌體2次后，再用適量無菌水重懸，使菌懸液的最終含量約為1×10CFU/mL。制備好的菌懸液用于盆栽接種試驗。

1.2.3 菜心種子處理 種子用75 %乙醇（沒過種子）浸泡1 min，倒出乙醇溶液，然后用0.4%次氯酸鈉（沒過種子）浸泡2 min消毒后倒出，再用滅菌蒸餾水清洗3次，無菌條件下晾干，備用。

1.2.4 土壤處理 土壤自然風干、磨碎并過5 mm篩，用于盆栽試驗。

1.2.5 盆栽試驗 試驗共設置3個處理：對照（CK，無菌水）、添加YLB1-6處理（YLB1-6）、添加TXB2-5處理（TXB2-5），每個處理3盆（重復），共9盆。盆栽試驗于2020年11—12月在廣西農業科學院本部科研基地塑料大棚中進行。采用內徑18 cm、高度12 cm的塑料圓盆進行盆栽試驗，每盆裝土1.75 kg，加入300 mL蒸餾水濕潤土壤。于2020年11月7日，每盆播種10顆處理過的菜心種子，待菜心苗長出4片真葉時進行間苗，每盆保留長勢相當的6株菜心苗。間苗后，加入制備好的菌懸液至菜心植株根部，每盆施入菌懸液量為10 mL，并以施加等量無菌水作為CK。盆栽試驗中澆水全部使用無菌水。盆栽置于塑料大棚內，植株生長期間保持自然光照及通風，棚內溫度控制在15～35 ℃，保持土壤濕度約為田間持水量的70%。于2020年12月27日收獲菜心。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植株相關指標測定 植株采樣：將各盆菜心連根采收后，蒸餾水將其洗凈并用吸水紙擦干，再用不銹鋼剪刀將菜心地上部與地下部剪開，分別稱取各盆菜心地上部與地下部鮮重；然后將植株樣品105 ℃殺青30 min后，60 ℃烘至恒重，分別稱干重后粉碎備用。經HNO-HClO（V∶V=4∶1）消解后，再用6 mol/L HCl還原，參照GB 5009.93—2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》，采用氫化物原子熒光光譜法測定菜心各部分中的Se含量。

菜心硒轉移系數（TF）=地上部硒含量/地下部硒含量；每盆菜心硒總累積量（μg/盆）=地上部硒累積量+地下部硒累積量=［地上部硒含量×菜心地上部鮮樣質量+菜心地下部硒含量×菜心地下部鮮樣質量］×1000，式中，×1000為將mg換算成μg。

1.3.2 土壤相關指標測定 土壤去除植物及碎屑物質，自然風干后，部分過1 mm篩，部分過100目篩。過1 mm篩的土樣用于pH測定，pH的檢測依照《土壤分析技術規范》電位法。過100目篩的土樣用于硒形態和硒價態測定。各土壤硒形態即SOL-Se、EX-Se、FMO-Se、OM-Se及RES-Se采用連續浸提法（瞿建國等，1997；邢穎等，2018）提取；土壤有效態硒（AVASe）為SOL-Se與EX-Se之和。土壤硒價態，包括SOLSe和EX-Se中的Se、Se、Se的提取、測定方法參考Wang等（2012）的方法，具體步驟為：（1）上清液中Se含量直接測定；（2）Se含量通過差減法求得，在上清液中加入6 mol/L HCl ，100 ℃水浴加熱15 min還原后測定，此時測定的硒含量為Se與Se之和，扣除（1）中Se濃度后即為提取液中的Se含量；（3）Se含量也是通過差減法求得，在上清液中加入1 mL 5%KSO，90 ℃水浴加熱1 h氧化，然后再加入6 mol/L HCl，100 ℃水浴加熱15 min還原后測定，此時測定的硒含量為Se、Se和Se之和，扣除（2）中Se和Se濃度后即為提取液中的Se含量。土壤硒形態和硒價態均采用氫化物發生—原子熒光光譜法測定。

1.4 統計分析

使用Excel 2007對試驗數據進行處理；用SPSS 17.0進行方差分析，應用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 富硒芽孢桿菌對土壤硒形態的影響

如表1所示，接種富硒芽孢桿菌促進了土壤硒形態的轉化。與未接種相比，接種富硒芽孢桿菌處理其土壤RES-Se含量均極顯著減少（＜0.01，下同），而AVA-Se含量均有不同程度的增加，YLB1-6處理表現為極顯著增加，TXB2-5處理顯著增加（＜0.05，下同）；但接種不同富硒芽孢桿菌，土壤各形態硒含量變化并不一致。經菌株YLB1-6處理后，土壤RES-Se含量較CK減少13.18%（絕對值，下同），而EX-Se含量顯著增加，SOL-Se和FMO-Se含量極顯著增加，AVA-Se較CK增加4.21%，AVA-Se的增加來源于SOL-Se和EX-Se的增加；TXB2-5處理中，土壤RESSe較CK減少9.56%，而SOL-Se含量顯著增加，OMSe含量極顯著增加，AVA-Se含量較CK增加2.99%，AVA-Se的增加主要來源于SOL-Se的增加。分析結果表明，富硒芽孢桿菌的施入打破了土壤硒形態的平衡，激活土壤中無效態硒，促進RES-Se向不同硒形態的轉化并提高土壤AVA-Se含量，但不同芽孢桿菌對土壤硒的形態轉化存在一定的差異。

2.2 富硒芽孢桿菌對土壤硒價態的影響

由表2可知，供試富硒赤紅壤的土壤有效硒以可溶態Se（SOL-Se）和Se（SOL-Se），以及可交換態及碳酸鹽結合態Se（EX-Se）和Se（EX-Se）存在，不存在可溶態Se（SOL-Se）和可交換態及碳酸鹽結合態Se（EX-Se）。CK中土壤硒各價態含量表現為EX-Se＞EX-Se＞SOL-Se＞SOL-Se；接種富硒芽孢桿菌的處理其土壤硒各價態含量表現為EXSe＞EX-Se＞SOL-Se＞SOL-Se。SOL-Se價態中，YLB1-6處理的SOL-Se較CK極顯著增加，TXB2-5處理的SOL-Se較CK顯著增加，但2種菌株處理SOL-Se與CK相比均無顯著變化（＞0.05，下同）；EX-Se價態中，2種菌株處理的EX-Se與CK相比變化均無顯著差異，而EX-Se均較CK極顯著增加；相較CK和TXB2-5菌株處理，YLB1-6菌株處理的土壤SOL-Se和EX-Se含量增加更為顯著。上述結果表明，富硒赤紅壤條件下，接種富硒芽孢桿菌后所增加的AVA-Se主要是來自SOL-Se和EX-Se含量增加，且YLB1-6處理對于提高AVA-Se價態含量的效果優于TXB2-5處理。

2.3 富硒芽孢桿菌對環境pH的影響

前期研究中，菌株用滅菌LB培養液培養，并以未接種菌株的滅菌LB培養液作為對照，培養后測定培養液pH，結果（表3）發現，未接種菌株的培養液pH為7.43，而接種YLB1-6和TXB2-5菌株后培養液pH分別為8.03和7.66，與未接種菌株的培養液pH相比，分別提高8.08%和3.10%，推測菌株在生長代謝過程中能分泌堿性物質。盆栽接種菌株試驗后測定各處理土壤pH，與CK相比，YLB1-6和TXB2-5處理的土壤pH分別提高4.31%和1.75%，其中YLB1-6處理達極顯著水平。

2.4 富硒芽孢桿菌對菜心硒吸收、轉移的影響

植株收獲后，采集菜心地上部和地下部，分別進行硒含量分析。由圖1可知，CK、YLB1-6和TXB2-5處理菜心地上部硒含量分別為0.021、0.042和0.037 mg/kg。經富硒芽孢桿菌處理，菜心地上部硒含量均顯著高于CK，其中，YLB1-6處理地上部硒含量為CK的2.00倍，TXB2-5處理地上部硒含量為CK的1.76倍，說明接種富硒芽孢桿菌的處理能明顯促進菜心地上部對土壤硒的吸收。此外，通過接種富硒芽孢桿菌，菜心地上部（可食部分）硒含量符合DB 45/T 1061—2014《富硒農產品硒含量分類要求》的蔬菜類富硒標準，即0.01～0.10 mg/kg，說明接種富硒芽孢桿菌是提高菜心可食部分硒含量的安全、有效的手段。接種富硒芽孢桿菌的2個處理菜心地下部硒含量差異明顯，YLB1-6處理的菜心地下部硒含量與CK無顯著差異，而TXB2-5處理卻極顯著高于CK，為CK的1.36倍。此外，每個處理菜心不同部位硒含量均表現為地下部＞地上部，CK的地下部硒含量為地上部的2.71倍，YLB1-6和TXB2-5處理地下部硒含量分別為地上部的1.22倍和2.09倍，菜心地下部為吸收土壤硒的主要器官，地上部硒來源于地下部硒的往上轉移。

TF代表菜心植株中的硒由地下部轉運至地上部的能力。由圖2可知，CK、YLB1-6和TXB2-5處理的TF值分別為0.37、0.82和0.48，YLB1-6和TXB2-5處理的TF值較CK分別提高121.62%和29.73%，YLB1-6處理的TF值較CK和TXB2-5顯著提高。可見YLB1-6處理更有利于菜心中硒往地上部轉移，其中原因可能與YLB1-6處理下土壤SOL-Se和EX-Se含量較高有關，這2種硒價態在作物硒吸收轉移上相對于有效態硒中其他價態更具有優勢。而TXB2-5處理下菜心雖然地上部及地下部硒含量均明顯提高，但地下部硒含量更高，硒往地上部轉移的能力不及YLB1-6處理。2種富硒芽孢桿菌處理對菜心硒吸收、轉移存在差異，可能是由于菌株所代謝轉化的硒形態價態及其自身分泌物質差異所引起。

2.5 富硒芽孢桿菌對菜心生物量及硒累積量的影響

對各處理菜心生物量進行測定，如表4所示，接種富硒芽孢桿菌菜心地上部均表現為增產趨勢，但與CK間鮮樣質量差異未達顯著水平，YLB1-6和TXB2-5 處理鮮樣質量較CK 分別增加4.38%和1.16%；接種富硒芽孢桿處理地下部鮮樣質量與CK相比，YLB1-6處理增加14.87%，而TXB2-5處理減少11.61%，但各處理間差異均未達顯著水平。從菜心鮮樣總質量來看，各處理間也無顯著差異。可見，接種富硒芽孢桿菌對菜心生物量影響不大。

本研究進一步對菜心各部位硒累積量進行分析，由表5可知，YLB1-6和TXB2-5處理的菜心地上部硒累積量分別比CK增加104.82%和78.89%，且與CK間差異分別達極顯著和顯著水平，說明接種富硒芽孢桿菌能有效地促進菜心地上部硒的累積。各處理間地下部硒累積量并無顯著差異；從菜心硒總累積量來看，與CK相比，YLB1-6處理的硒總累積量增加87.04%，差異達極顯著水平，TXB2-5處理的硒總累積量增加68.83%，與CK間差異顯著。

3 討論

廣西主要富硒土壤中赤紅壤總硒含量最高，平均含量0.964 mg/kg（邢穎等，2018），而有效態硒含量卻很低，僅占總硒的1.73%，赤紅壤高硒低效特征尤為突出。富硒赤紅壤具有強酸性、高鐵鋁氧化物及大量黏粒吸附固定的特性，制約了富硒赤紅壤硒資源的利用。土壤中硒的形態、價態及遷移、生物有效性與微生物息息相關。微生物通過對硒的轉運、還原、同化、氧化和甲基化等代謝作用，參與土壤硒各價態（Se、Se、Se、Se）的轉化及有機態硒的形成，是土壤硒轉化的決定性因子（Dowdle and Oremland，1998；Winkel et al.，2012）。利用微生物活化土壤中硒，提高硒的有效性，是開發利用土壤自然硒資源的有效途徑。本課題組在對土壤耐硒菌株進行分離篩選及鑒定時發現，芽孢桿菌對硒具有較強的耐受性，環境適應性較強（廖青等，2017）。且室內接種菌株土壤培養試驗表明，接種富硒菌株能活化土壤硒，增加水溶態硒或交換態硒含量，從而提高土壤有效硒含量（龍云川等，2017；廖青等，2018）。

為進一步了解所分離的富硒芽孢桿菌對土壤中硒的轉化作用，以及對植物硒吸收、轉移、累積和植物生物量的影響，本研究開展富硒芽孢桿菌接種的盆栽試驗。接種不同富硒芽孢桿菌，菜心地上部硒含量均較CK有明顯提高，其原因可能是接種富硒芽孢桿菌的處理，促進了土壤RES-Se向AVA-Se轉化，土壤SOL-Se和EX-Se顯著增加，而植物對這些Se（主要是有機硒化合物）的吸收速率極高（Kikkert and Berkelaar，2013）；另外，陳大清（2004）研究表明不同形態硒在植物中的轉運速率Se＞Se＞Se，Se和Se能較快速地向作物地上部轉移，在這2種價態硒的共同作用下作物地上部累積較多的硒。菜心地下部對土壤硒的吸收、轉移能力存在差異，可能與土壤中存在的Se總量差異有關，因為相對于Se和Se，植物對Se的轉移能力較低，根部吸收Se后易轉化為其他形態而累積在植物根部，不易轉移到地上部（Jiang et al.，2015）。因此，與CK和YLB1-6處理相比，TXB2-5處理菜心地下部硒含量較高。植株硒累積量與植株鮮樣質量及其硒含量有關（黃太慶，2018；熊軍，2019），是表征土壤硒活化能力的重要指標。菜心增加的硒累積量是富硒芽孢桿菌活化土壤硒能力強弱的體現，本研究發現接種富硒芽孢桿菌顯著提高了菜心硒累積量，且YLB1-6處理菜心硒累積量高于TXB2-5處理，說明YLB1-6菌株活化土壤硒的能力強于TXB2-5菌株。另外，研究表明，外源適量施硒對菜心產量無顯著影響（莫海珍，2006；郭巨先，2020）；本研究中，在沒有外源硒補充的條件下，接種富硒芽孢桿菌提高了土壤有效硒含量、促進了菜心硒吸收，但對菜心生物量無顯著影響，與前人研究有類似的結論，可能是由于硒并非菜心生長必需的營養元素，對菜心產量無顯著正效應。

土壤pH是影響土壤有效硒的重要因素之一，土壤pH可控制硒與土壤組分的吸附和解吸過程，也可以通過氧化還原電位、土壤微生物種類和活性等影響硒的有效性（Goh and Lim，2004）。本研究中，接種富硒芽孢桿菌后，土壤pH均有不同程度的提高，土壤pH的改變，反過來也會影響土壤中硒形態的轉化，從而影響硒的有效性。本研究中，接種富硒芽孢桿菌后，土壤pH均有不同程度的提高，土壤SOL-Se含量也明顯增加，與張艷玲等（2002）的研究結果相一致。不同富硒芽孢桿菌均能對RES-Se進行轉化，但轉化后的硒形態有所不同，可能是不同富硒芽孢桿菌所代謝產生的物質成分不同，其與硒結合的產物不同所致。此外，土壤pH還可通過氧化還原電位、微生物活性種類等間接影響土壤硒價態變化，這可能是接種富硒芽孢桿菌后，土壤SOL-Se和EXSe增加的原因。

目前，利用富硒菌株促進植物硒吸收的相關研究多是在添加外源硒的基礎上開展，而本研究通過在天然富硒土壤中接種富硒芽孢桿菌盆栽試驗，證實富硒芽孢桿菌能有效地活化土壤硒，對于促進作物地上部對土壤硒的吸收、累積有較好的效果，為作物硒生物強化提供了更多的技術手段。

4 結論

富硒芽孢桿菌具有活化土壤硒的能力，能促進土壤殘渣態硒向有效態硒轉化，并促進菜心地上部對土壤硒的吸收累積。與TXB2-5相比，YLB1-6更有利于植株體內硒向地上部轉移，具有更好的田間應用價值。