瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ原核表達及其多克隆抗體制備

曹穎穎，李寶瑩，王 婷，梁 亮，運晨霞，唐海波，冷 靜

（廣西中醫(yī)藥大學/廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室/廣西特色實驗動物病證模型重點實驗室，廣西南寧 530200）

0 引言

【研究意義】樹鼩（）是在進化關系上除靈長類動物外與人類最接近的物種（Novacek，1992；Waddell et al.，2001），在生理機能、生化代謝和基因組等方面均與人類相似，且已證實樹鼩能被多種人類疾病相關的病毒感染，在一些特殊人類疾病動物模型上具有獨特優(yōu)勢（Glebe et al.，2003；Yan et al.，2012）。但作為一種新興的實驗動物，樹鼩的基礎生物學數(shù)據(jù)及專有的商品化檢測試劑匱乏，極大限制了其推廣應用。因此，制作樹鼩源性抗體等檢測試劑對促進樹鼩實驗動物模型的應用及研究具有重要意義。【前人研究進展】自Lindblad-Toch等（2011）利用美國Board研究所公布的不完整樹鼩基因組數(shù)據(jù)重構(gòu)29個哺乳動物系統(tǒng)發(fā)育關系發(fā)現(xiàn)樹鼩是最接近靈長類的物種以來，滇西亞種樹鼩在基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學及解剖學等方面已得到一定研究（Li et al.，2012；Fan et al.，2013），且證實在構(gòu)建腫瘤模型（Park et al.，2000）、乙肝病毒感染模型（Park et al.，2000）、抑郁癥模型（Fuchs，2005；王靜等，2011）等方面具有廣闊的應用前景。在樹鼩專有生物制劑研究方面，干細胞生長因子、白細胞介素6、載脂蛋白AV等細胞因子及蛋白已有表達純化的研究報道（王艷等，2013；龍瓊等，2019）。干擾素（Interferon，IFN）是研究最早的一類細胞因子，具有種屬特異性（Samarajiwa et al.，2009；吳丹等，2013），其家族成員中的IFN-α、IFN-β和IFN-γ已廣泛應用于人類病毒性疾病與癌癥治療。IFN屬于多效性細胞因子，與相應受體結(jié)合并激發(fā)細胞信號級聯(lián)反應，通過激活多種干擾素刺激基因（Interferon-stimulated gene，ISG）的轉(zhuǎn)錄與表達，而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用（Osterlund et al，2005；羅嬋等，2015）。針對樹鼩IFN的研究主要有：李明利等（2012）以樹鼩全基因組數(shù)據(jù)為基礎，通過基因預測和蛋白建模等方法對樹鼩IFN家族的基本構(gòu)成進行了系統(tǒng)分析；丁晨等（2018）通過構(gòu)建原核重組表達載體克隆表達出滇西亞種樹鼩IFN-γ，且證實復性純化后具有良好的免疫原性。【本研究切入點】滇西亞種和瑤山亞種樹鼩是主要分布在我國云南和廣西的2個樹鼩亞種，相對于滇西亞種樹鼩，瑤山亞種樹鼩的基礎生物學研究匱乏，其免疫系統(tǒng)研究尚缺少商品化的樹鼩特異性抗體等生物制劑，且不同亞種樹鼩間的遺傳差異和分化程度尚無詳細數(shù)據(jù)。【擬解決的關鍵問題】通過RT-PCR擴增瑤山亞種樹鼩的和基因，構(gòu)建原核表達載體進行誘導表達，經(jīng)免疫小鼠獲得多克隆抗體并鑒定其反應性，以期為進一步研究樹鼩病毒感染動物模型打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

瑤山亞種樹鼩購自廣西中醫(yī)藥大學人工馴化養(yǎng)殖實驗中心，麻醉后靜脈采血用于外周血淋巴細胞分離；昆明小鼠［SCXK（湘）2019-0004］購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物試驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查通過（DW20201206-123），嚴格遵循3R原則。原核載體pET28a（+）由廣西中醫(yī)藥大學劉鵬副教授惠贈，pcDNA3.1（+）由廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室保存提供；大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；淋巴細胞分離液購自沃卡威（北京）生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體2000及限制性內(nèi)切酶H I和I購自賽默飛世爾科技公司；分子克隆相關試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG抗體購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體購自美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 瑤山樹鼩和基因克隆及真核/原核表達質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)GenBank已公布的滇西亞種樹鼩和基因序列設計引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用TRIzol法提取樹鼩外周血淋巴細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以引物IFN-β-1（5'-ATGTTCTACAGAAGC ATCCT-3'）和IFN-β-2（5'-TCAGTCTCGGAGGTAG TCTA-3'）、IFN-γ-1（5'-ACCAGGGCTACCGATTTG A-3'）和IFN-γ-2（5'-TTATCTGGAAGCTCTCCGAC C-3'）擴增包含ORF的瑤山亞種樹鼩和基因片段，然后克隆至pMD18-T載體上，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，經(jīng)測序驗證后再以亞克隆引物pcDNA3.1-IFN-β-U（5'-CGGATCCGCCACCATGT TCTACAGAAGCATCC-3'，劃線部分為H I酶切位點）和pcDNA3.1-IFN-β-L（5'-CCTCGAGTCAGT CTCGGAGGTAGTCTAT-3'，劃線部分為I酶切位點）、pcDNA3.1-IFN-γ-U（5'-CGGATCCGCCACC ATGAAGTATACAAGTTATA-3'，劃線部分為H I酶切位點）和pcDNA3.1-IFN-γ-L（5'-CCTCGAGTT ATCTGGAAGCTCTCCGAC-3'，劃線部分為I酶切位點）進行PCR擴增并回收目的條帶，采用限制性內(nèi)切酶H I和I在37 ℃下酶切目的條帶和質(zhì)粒pcDNA3.1（+），酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-（圖1-A）和pcDNA3.1-（圖1-B）；經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，將得到的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染倉鼠腎細胞（BHK-21）進行真核表達。原核表達載體（圖1-C和圖1-D）的構(gòu)建同真核表達載體。在基因測序完成后利用DNAStar對IFN-β和IFN-γ氨基酸序列進行比對，在不影響蛋白主要免疫活性及免疫原性的前提下剔除掉疏水氨基酸序列，最終設計引物如下，pET28a-IFN-β1（5'-CGGATCC ATGGACTGCCTCAAGGACCGTAT-3'，劃線部分為H I酶切位點）和pET28a-IFN-β2（5'-CCTCGAG ACAGCTGCTGTACTCCTTGG-3'，劃線部分為I酶切位點）、pET28a-IFN-γ1（5'-CGGATCCATGCCA TTTATGAAAGAAGTACA-3'，劃線部分為H I酶切位點）和pET28a-IFN-γ2（5'-CCTCGAGTCTGGA AGCTCTCCGACCTC-3'，劃線部分為I酶切位點），構(gòu)建的原核表達載體pET28a-和pET28a-轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞進行原核表達（唐海波等，2014；趙祥秀等，2020）。

1.2.2 重組蛋白表達純化及鑒定 挑取轉(zhuǎn)化了原核表達載體pET28a-和pET28a-的菌株單克隆，接種至含100 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床（220 r/min）培養(yǎng)至OD約0.6，取出1 mL留樣保存，其余加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃下誘導表達6 h，收集菌體，取出1 mL留樣保存，剩余菌體進行超聲波破碎，破碎后4 ℃下12000 r/min離心15 min分離上清液和沉淀，同樣取適量上清液和沉淀留樣保存。將上述每步留取的樣品進行SDS-PAGE電泳，鑒定融合蛋白的表達效果及表達形式。鑒定后的融合蛋白采用含1、2、3和4 mol/L尿素的洗滌液進行洗滌，SDS-PAGE電泳摸索最佳包涵體洗滌條件，洗滌獲得的包涵體以梯度遞降尿素濃度透析的方法復性，-80 ℃保存?zhèn)溆茫舷让鞯龋?010）。Western blotting檢測鑒定融合蛋白：純化復性后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以鼠抗His標簽抗體為一抗、堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG抗體為二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。

1.2.3 抗體制備及反應性檢測 將弗氏佐劑與純化復性后的融合蛋白（IFN-β和IFN-γ）乳化后免疫昆明小鼠（100 μg/只），免疫周期為第1、7、28、35和45 d，免疫方式為背部皮下多點注射。首次免疫用弗氏完全佐劑與融合蛋白乳化，第2、3、4和5次免疫則用弗氏不完全佐劑與融合蛋白乳化。第5次免疫后1周經(jīng)眼球采血并分離血清，通過Western blotting和IFA檢測制備獲得多克隆抗體的反應性。Western blotting檢測以不同稀釋度的抗IFN-β和IFN-γ多克隆抗體為一抗，未免疫小鼠血清為陰性對照，堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG抗體為二抗，BCIP/NBT顯色觀察。間接免疫熒光（IFA）檢測采用轉(zhuǎn)染24 h后的單層BHK-21細胞，按1∶100分別稀釋制備的抗IFN-β、IFN-γ多克隆抗體及未免疫小鼠陰性血清為一抗，以1∶300稀釋FITC標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，在熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ基因克隆結(jié)果

以瑤山亞種樹鼩外周血淋巴細胞為材料提取總RNA，Oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，分別擴增獲得564 bp的基因片段（圖2-A）及501 bp的基因片段（圖2-B），與預期的目的基因片段長度相符。將和基因克隆至pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，取少量轉(zhuǎn)化菌株涂布于LA培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌液PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示獲得對應的目的條帶（圖2-C和圖2-D），表明和基因已成功克隆至pMD18-T載體上。對陽性克隆質(zhì)粒進行測序分析，發(fā)現(xiàn)與GenBank已公布滇西亞種樹鼩基因（XM-006140329）、基因（KC905628）的核苷酸序列相似性分別為99.6%和100.0%。基于和基因的核苷酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3和圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與嚙齒類大鼠、小鼠的IFN相比，樹鼩的IFN-β和IFN-γ更接近人類IFN。

2.2 瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ真核/原核表達載體

以添加有酶切位點的亞克隆引物擴增重組質(zhì)粒pMD18-T-和pMD18-T-，回收PCR擴增產(chǎn)物再次與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行菌液PCR鑒定，陽性克隆測序分析正確后分別酶切pcDNA3.1（+）和亞克隆陽性質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，膠回收帶有酶切位點的、基因片段及酶切后的線性pcDNA3.1（+）空載體，用T4 DNA連接酶將目的基因片段連接至真核表達載體pcDNA3.1（+）上，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定和酶切鑒定，結(jié)果（圖5）顯示均為陽性質(zhì)粒。經(jīng)測序分析，瑤山亞種樹鼩和基因在真核表達載體中讀碼正確，說明真核表達載體pcDNA3.1-和pcDNA3.1-構(gòu)建成功。原核表達載體構(gòu)建方式同真核表達載體，分別命名為pET-28a-和pET-28a-。

2.3 融合蛋白IFN-β和IFN-γ表達純化及鑒定結(jié)果

以原核表達載體pET-28a-和pET-28a-轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞并誘導表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以30 ℃下0.5 mmol/L IPTG誘導6 h獲得的融合蛋白表達量最高（圖6-A和圖6-B）。為驗證融合蛋白的表達方式，經(jīng)超聲波破碎后進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果在細胞沉淀中檢測到融合蛋白IFN-β和IFN-γ，說明融合蛋白主要以包涵體形式表達（圖6-C和圖6-D）。以含不同濃度尿素的洗滌液洗滌包涵體進行初步純化，結(jié)果（圖7）顯示，包涵體經(jīng)含1、3和4 mol/L尿素的洗滌液洗滌后，仍有較多雜蛋白存在于目的蛋白中；而經(jīng)含2 mol/L尿素的洗滌液洗滌后可獲得純度相對較高的融合蛋白，故確定2 mol/L尿素為最佳包涵體洗滌濃度。由于誘導表達融合蛋白的pET-28a（+）系統(tǒng)上帶有多聚組氨酸（6×His）標簽，因此可利用攜帶His標簽的抗體進行Western blotting檢測，結(jié)果表明，純化的融合蛋白與預測的目的蛋白基本一致（圖8），說明瑤山亞種樹鼩和基因在原核表達載體中正確表達。

2.4 多克隆抗體Western blotting檢測結(jié)果

以復性后的融合蛋白IFN-β和IFN-γ與佐劑乳化后分別免疫昆明小鼠，第5次免疫后1周采集血液分離血清，所得血清即為多克隆抗體。Western blotting檢測結(jié)果（圖9）顯示，制備獲得的IFN-β多克隆抗體在稀釋度為1∶8000時仍能與0.1 μg的融合蛋白IFN-β結(jié)合，IFN-γ多克隆抗體在稀釋度為1∶8000時仍能與1.0 μg的融合蛋白IFN-γ結(jié)合，均具有良好的反應性。

2.5 多克隆抗體IFA檢測結(jié)果

通過IFA進一步驗證制備獲得的多克隆抗體與IFN-β和IFN-γ的結(jié)合能力，結(jié)果（圖10）顯示，經(jīng)真核表達載體pcDNA3.1-和pcDNA3.1-轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞分別與制備獲得的IFN-β和IFN-γ多克隆抗體共孵育后，均能觀察到特異的綠色熒光，而與陰性血清共孵育的轉(zhuǎn)染BHK-21細胞未觀察到綠色熒光。

3 討論

IFN作為機體抵御病毒感染的第一道防線，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抑制細胞增殖等多重作用（Kotenko et al.，2003；Brand et al.，2005；Osterlund et al.，2005；Ank et al，2006；李聰聰?shù)龋?021）。樹鼩是一種外形與松鼠類似而遺傳上最接近靈長類的動物，在病毒感染模型方面相對于嚙齒類實驗動物有著不可替代的作用。本研究通過RT-PCR擴增獲得瑤山亞種樹鼩的和基因片段（包含整個ORF），遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)瑤山亞種樹鼩的（I型）和（II型）基因與人類、食蟹猴的基因處于更接近的分支上，進一步驗證其進化上的優(yōu)勢。此外，樹鼩能被多種與人類疾病有關的病毒感染（Xu et al.，2007；Li et al.，2008）。與靈長類實驗動物相比，樹鼩具有形體小、繁殖快及成本低等特點，在醫(yī)學研究中的價值已受到越來越多的關注。迄今為止，科學家們對樹鼩的解剖學、生殖生理學、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)及動物模型等已進行大量研究（Eichmann and Holst，1999；Fuchs and Flügge，2002；Pradidarcheep et al.，2003；Norton et al.，2010）。在病毒學研究方面，樹鼩已成為研究肝炎病毒、輪狀病毒等病毒感染及致病機制的理想動物模型（Collins et al.，2007；Norton and Siegwart，2013）。近年來，針對滇西亞種樹鼩的基礎生物學研究較深入，但樹鼩作為病毒感染動物模型其免疫系統(tǒng)、免疫應答相關細胞因子的研究相對匱乏，且市面上缺乏樹鼩特異性抗體等生物制劑，致使流式細胞術(shù)、免疫組織化學等研究難以開展，嚴重限制了樹鼩作為病毒感染動物模型在相關研究領域的應用。

本研究通過構(gòu)建原核表達載體成功誘導表達獲得瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ蛋白，且證實獲得的融合蛋白主要以包涵體形式表達。原核表達載體pET-28a（+）攜帶有His標簽，為后期的蛋白純化及檢測提供了方便。瑤山亞種樹鼩和基因長度分別為564和501 bp，通過預測瑤山樹鼩IFN-β和IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：IFN-γ蛋白N端富含疏水性氨基酸，IFN-β蛋白N端和C端均富含疏水性氨基酸，可能與IFN的分泌功能有關。在不影響蛋白主要免疫活性及免疫原性的前提下，本研究在設計引物時截去N端疏水性氨基酸，通過原核表達載體成功誘導表達獲得融合蛋白IFN-γ，但未表達出融合蛋白IFN-β。為此，在重新設計引物時同時去除N端和C端疏水性氨基酸，最終成功通過原核表達載體誘導表達獲得融合蛋白IFN-β，且免疫原性及活性完好。由于富含疏水性氨基酸肽段在原核載體中不易表達，因此試驗設計時在保留免疫活性及免疫原性的基礎上應盡可能去除富含疏水性氨基酸肽段的表達。

在融合蛋白純化方面，本研究嘗試在變性條件下采用Ni-NTA進行純化，但發(fā)現(xiàn)融合蛋白IFN-β和IFN-γ均未能被吸附在樹脂上，大部分融合蛋白隨穿透液流出，可能是融合蛋白以包涵體形式表達時其構(gòu)象將6×His標簽包裹在內(nèi)部，而His標簽在8 mol/L尿素變性條件下仍暴露不夠充分（趙慧等，2009）。孟先明等（2010）曾報道，在Ni-NTA純化不理想時可嘗試通過采用含有不同濃度尿素的洗滌液充分洗滌包涵體以獲得較高純度的目的蛋白。為此，本研究將0.5 mmol/L IPTG誘導6 h的重組菌株在液氮反復凍融3次后以超聲波裂解菌體，由于大部分菌體自身蛋白為可溶性蛋白，通過離心可去除絕大部分可溶性蛋白，實現(xiàn)包涵體與可溶性蛋白分離，收集獲得的包涵體中雜蛋白含量較少。包涵體洗滌液中含有TritonX-100，可將吸附在包涵體表面的一些不溶雜蛋白除去，再以含不同尿素濃度的洗滌液進行洗滌，結(jié)果顯示，經(jīng)含l、3和4 mol/L尿素的洗滌液洗滌后SDS-PAGE電泳的雜帶還是相對較多，而以含2 mol/L尿素的洗滌液洗滌后可獲得純度相對較高的融合蛋白，且損失較少，故確定包涵體洗滌液中的尿素最佳濃度為2 mol/L。融合蛋白IFN-β和IFN-γ經(jīng)乳化后免疫小鼠，成功制備獲得多克隆抗體，Western blotting和IFA檢測結(jié)果均顯示，制備獲得的2個多克隆抗體具有良好的反應性，可為構(gòu)建樹鼩抗感染模型及開展抗病毒作用機制研究等提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

通過原核表達系統(tǒng)可在大腸桿菌中成功誘導表達獲得瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ，復性后的融合蛋白具有良好的反應性和免疫原性，免疫小鼠制備獲得的多克隆抗體反應性良好且抗體效價高，可作為檢測工具用于研究瑤山亞種樹鼩病毒感染模型。