貞豐野生茶樹葉表特征及解剖結構分析

李美鳳，彭 葉，溫貝貝，劉 元，劉建軍*

（1貴州大學茶學院，貴州貴陽 550025；2坡柳村晟興種養(yǎng)殖專業(yè)合作社，貴州貞豐 562205）

0 引言

【研究意義】茶（）是我國重要的經濟作物，在脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了重要作用。種質資源是茶樹品種創(chuàng)新的物質基礎，高抗、高品質、生長發(fā)育優(yōu)良的茶樹品種是茶產業(yè)高質量發(fā)展的基本保障（王新超等，2021），也是茶科技原始創(chuàng)新和新產品開發(fā)的戰(zhàn)略性資源（金基強等，2021）。貴州是茶樹起源地之一，境內野生茶樹和群體種資源豐富（安紅衛(wèi)等，2021）。貞豐野生茶樹所制茶香氣馥郁、滋味濃醇，風味獨特，挖掘貞豐野生茶樹優(yōu)良遺傳性狀，不僅為保護和利用貴州省野生茶樹資源提供數(shù)據(jù)支撐，也有助于篩選適宜貴州本地環(huán)境、高抗、品質優(yōu)良的茶樹新品種。【前人研究進展】貞豐野生茶樹主要分布于貴州省貞豐縣，屬于阿薩姆種（var.）（劉聲傳等，2013），所制茶名為娘娘茶，又名坡柳茶，滋味醇厚，芳香馥郁，在明末清初為皇室貢茶（劉曉霞等，2004）。貞豐野生茶樹遺傳性狀混雜，葉面積大，芽葉外表呈現(xiàn)出紫色、綠色和綠帶紫色，芽頭肥壯、茸毛密布，葉肉飽滿，新梢持嫩性強。研究表明，茶樹葉片結構和芽葉的生理性狀能反映其抗性與內含物質情況（農玉琴等，2020）。植物的光合作用、呼吸作用和蒸騰作用與葉片氣孔密切相關（陳龍干，2020）。芽葉茸毛富含豐富的氨基酸和咖啡堿等，其基部的腺細胞分泌芳香物質，濃密的茸毛還能干擾昆蟲產卵及其對芽葉的附著與取食（尹鵬等，2016），表明芽葉茸毛與品質成分和抗性相關。芳樟醇是茶葉重要的香氣物質，其含量與葉面積呈正相關（Zeng et al.，2021），花青素和兒茶素是茶葉重要的功能成分（de Moura et al.2022），花青素含量和單體兒茶素/聚合兒茶素比值與茶樹芽葉顏色緊密相關（Zhu et al.，2021），表明茶樹芽葉顏色和葉片面積能夠反映茶葉的品質。茶樹葉片的解剖結構分析表明，柵欄組織厚度與葉綠素、類胡蘿卜素含量呈正相關，海綿組織厚度與適制性相關（覃秀菊等，2009；傅秀敏等，2021）。葉面茸毛密度、葉表皮細胞厚度、角質層厚度、柵海比、葉片組織結構緊密度和葉片厚度等指標與抗寒、抗旱、抗病蟲害和持水能力呈正相關（李鴻雁等，2020；郭艷紅等，2021；譚殷殷等，2021；張東等，2021）。以上研究表明，通過分析茶樹芽葉形態(tài)及解剖結構可推測茶樹抗性、茶葉品質和適制性。【本研究切入點】茶樹嫩梢形態(tài)學和葉片解剖學特征被廣泛用于評價茶樹的抗逆性、品質性狀和適制性（朱燕和黃亞輝，2015），而該技術用于野生茶樹種質資源篩選卻鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】以福鼎大白茶和龍井43號為對照，對貞豐野生茶樹紫芽和綠芽株系的22項形態(tài)學特征和葉片解剖結構指標進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和多元分析，評價野生茶樹的綜合抗性、內含物質和適制性，為篩選品質優(yōu)良的貴州本地茶樹品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以福鼎大白茶和龍井43號為對照，取貞豐野生茶樹代表性紫芽株系和綠芽株系的完整枝條，用于比較和分析野生茶樹的成熟葉片、芽頭和節(jié)間距等形態(tài)學指標。取相應種質的一芽一葉嫩梢用于解剖學觀測。貞豐野生茶樹采于貴州省貞豐縣龍場鎮(zhèn)坡柳村5個不同野生茶樹群落，每個地點取3份。樣品的地理位置為北緯25°24′36″、東經105°32′24″，海拔1029.44～1111.38 m。福鼎大白和龍井43號采自坡柳村茶園。所有材料的采樣時間為2021年9月16日。

1.2 試驗設計

1.2.1 葉表特征觀察 取每個種質健康枝條完整的新梢和成熟葉片，利用軟尺測定芽長（cm）、芽寬（cm）、葉長（cm）、葉寬（cm）和節(jié)間長（cm）。利用超景深顯微鏡（Keyence VHX-5000，基恩士有限公司）觀察芽葉表型。用手術刀分別取成熟葉不同區(qū)域5 mm×5 mm方形小塊，用鑷子將下表皮薄膜撕下，置于載玻片上，滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用顯微鏡攝像系統(tǒng)Olympus BX53和CellSens Entry觀察葉片不同區(qū)域的下表皮氣孔，計數(shù)、拍照。

1.2.2 葉片解剖結構觀測 石蠟切片參考陳雪等（2019）方法，主要步驟如下所示：（1）取材：取標準一芽一葉的第一葉，洗凈、用濾紙吸干水分，用FAA固定液固定24 h，然后用手術刀將葉片修平整放于脫水盒；（2）脫水：按照75%酒精4 h、85%酒精2 h、90%酒精2 h、95%酒精1 h、無水乙醇I 30 min、無水乙醇II 30 min的順序，依次進行脫水；（3）透明：醇苯5～10 min、二甲苯I 5～10 min、二甲苯II 5～10 min，至葉片透明；（4）浸蠟：65 ℃融化石蠟I 1 h，65 ℃融化石蠟II 1 h，65 ℃融化石蠟III 1 h；（5）包埋：在包埋框放入融化的蠟，再放入已脫水的葉片，置于-20 ℃凍臺冷卻至蠟凝固，將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊；（6）切片、拍照：將修整好的蠟塊放入-20 ℃冷凍臺冷卻，再置于石蠟切片機切4 μm厚片；用載玻片將已展平且漂浮于攤片機40 ℃溫水上的切片撈起，放入60 ℃烘箱內將水烤干蠟烤化，在顯微鏡下觀測拍照。

1.3 形態(tài)學和解剖學指標的數(shù)據(jù)處理

葉面積計算公式：葉面積=葉長×葉寬×0.75（Yin et al.，2016）。氣孔數(shù)為下表皮25 mm（5 mm×5 mm）單位面積的氣孔數(shù)量；隸屬函數(shù)值（）=（-）/（-），式中為指標測定值，和分別為參試茶樹某一指標的最大值和最小值（謝季堅和劉承平，2013）。相關指數(shù)=Σ/（-1）（馬婷等，2016），式中，為某指標與聚類分析同一分類中其他指標的相關系數(shù)，為每個分類中指標個數(shù)（韓剛等，2006）。

1.4 統(tǒng)計分析

利用聯(lián)川生物云平臺（https：//www.omicstudio.cn/index）對茶樹的葉面形態(tài)和解剖結構指標進行主成分分析，利用SPSS 26進行顯著性分析和層次聚類分析。

2 結果與分析

2.1 芽的形態(tài)特征觀測結果

單芽是名優(yōu)茶加工的重要原料，其芽頭粗細與百芽重、內含物質相關。對福鼎大白茶、龍井43號、綠芽株系和紫芽株系的芽頭進行測量，結果（表1）表明，芽長排序依次為紫芽株系（2.58 cm）＞綠芽株系（2.28 cm）＞福鼎大白茶（2.21 cm）＞龍井43號（1.49 cm），芽寬排序依次為綠芽株系（0.36 cm）＞紫芽株系（0.30 cm）＞福鼎大白茶（0.22 cm）＞龍井43號（0.16 cm）；綠芽株系的芽寬/芽長比值（0.16）顯著高于紫芽株系（0.12）、福鼎大白茶（0.10）和龍井43號（0.11）（＜0.05，下同），說明野生茶樹的芽頭更粗壯，且綠芽株系的芽頭壯于紫芽株系。顯微鏡觀察結果（圖1）顯示，綠芽株系茸毛極細密，其次為紫芽株系，福鼎大白茶最稀疏。

2.2 新梢節(jié)間特征測量結果

節(jié)間長是植物遺傳多樣性的指標之一。從表1可知，4個種質的新梢不同葉位節(jié)間長排序均為綠芽株系＞紫芽株系＞福鼎大白茶＞龍井43號。貞豐野生茶樹的節(jié)間長顯著長于栽培品種，綠芽株系在第二三葉、三四葉和四五葉的節(jié)間長顯著長于紫芽株系。節(jié)間長分析結果表明，野生茶樹與栽培品種具有顯著遺傳差異性，野生茶樹群落內也存在顯著的遺傳變異。

2.3 葉片形態(tài)特征觀測結果

葉面積是植物光合作用能力的重要參數(shù)。從表2可知，4個種質成熟葉片的葉形、葉尖、葉緣和葉脈形態(tài)相近，但葉色和葉片質地不同，表明其遺傳特征具有差異性。由表1可知，葉面積最大的是綠芽株系（52.87 cm），其次為紫芽株系（40.27 cm），龍井43號最小（10.69 cm）。貞豐野生茶樹的葉面積顯著大于福鼎大白茶和龍井43號，表明貞豐野生茶樹光合效率更高，代謝產物更豐富。

葉面觀察發(fā)現(xiàn)，貞豐野生茶樹葉面柔軟、光澤性強，隆起程度大，說明其葉肉生長旺盛，葉肉組織發(fā)達。紫芽株系的葉脈對數(shù)平均為10.40對，綠芽株系平均為11.67對，顯著多于福鼎大白茶（7.01對）和龍井43號（6.33對）的葉脈對數(shù)（表1），表明與福鼎大白茶和龍井43號相比，貞豐野生茶樹的遺傳變異性大。紫芽株系為紫芽紫葉紫莖，表明花青素含量高；綠芽株系為綠芽綠葉綠莖，顏色比福鼎大白茶和龍井43號深，表明葉綠素含量更高。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，綠芽株系葉表茸毛長且極密，完全覆蓋葉肉；紫芽株系葉表茸毛長，較密；福鼎大白茶和龍井43號葉表茸毛稀疏（圖1），表明貞豐野生茶樹芽葉抗病蟲害能力較強。4個種質葉表氣孔數(shù)差異不顯著，相同視野內紫芽株系葉片氣孔數(shù)為76.53，綠芽株系為74.27，顯著高于福鼎大白茶（67.67）和龍井43號（49.27）（表1），表明貞豐野生茶樹光合作用、呼吸作用和蒸騰效率強于福鼎大白茶和龍井43號。

2.4 葉片解剖特征觀測結果

葉片的解剖結構能直觀反映植物的生長狀態(tài)、抗性和干物質含量。由成熟葉片的組織切片（圖2、表3）可看出，綠芽株系和紫芽株系的角質層和葉片厚度均顯著厚于福鼎大白茶和龍井43號；綠芽株系和紫芽株系的上表皮細胞呈矩形，整齊緊密地排列，福鼎大白茶和龍井43號的上表皮細胞則形狀不一，排列不整齊。4個種質的柵欄組織均由2～3層柱形細胞緊密排列而成。

由表3可知，綠芽株系和紫芽株系的上表皮厚度（20.33～21.72 μm）和下表皮厚度（12.83～16.59 μm）均顯著厚于福鼎大白茶和龍井43號。綠芽株系的柵欄組織最厚（82.09 μm），福鼎大白茶（76.49 μm）和紫芽株系（70.39 μm）次之，龍井43號（48.41 μm）最薄。與福鼎大白茶和龍井43號相比，綠芽株系和紫芽株系的海綿組織明顯更厚，柵海比略低于龍井43號（1.07）和福鼎大白茶（1.01）。福鼎大白茶的葉片組織結構緊密度最高（0.35），其次為綠芽株系（0.34），紫芽株系（0.30）最低。紫芽株系的主脈厚度為740.02 μm，顯著厚于其他3個種質。與福鼎大白茶和龍井43號相比，綠芽株系和紫芽株系的主脈木韌比更高。

2.5 貞豐野生茶樹與福鼎大白茶和龍井43號各項指標的主成分分析

如圖3所示，主成分分析結果表明，第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）貢獻率達64.82%，表明前2個主成分的特征解釋了4個種質間約65%的差異。4個種質相分離，表明4個種質具有遺傳差異性，其中，貞豐野生茶樹與福鼎大白茶和龍井43號距離較遠，表明野生茶樹與栽培茶樹遺傳差異大；紫芽株系與綠芽株系距離較近，表明紫芽株系與綠芽株系遺傳基礎更接近。

2.6 貞豐野生茶樹與福鼎大白茶和龍井43號的綜合抗性和內含物質評估與比較

2.6.1 抗性指標和品質指標的層次聚類分析 所測指標中，葉脈對數(shù)、主脈厚度、葉面積、角質層厚度和海綿組織厚度與耐熱性和抗旱性相關，葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度和柵欄組織厚度與抗旱性和抗寒性相關，柵海比和葉片結構組織緊密度則與抗寒性相關。根據(jù)指標與抗性間的相關性，通過分層聚類對各指標進行分析，選擇相互獨立且具代表性的指標做抗性分析。當聚為四大類時，指標的類間距較大，各類特點較突出，相關性較小（圖4-A）。第Ⅰ類包主脈厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，第Ⅱ類包括葉面積、上表皮厚度、葉脈對數(shù)、角質層厚度，第Ⅲ類為下表皮厚度，第Ⅳ類包括柵海比、葉片組織結構緊密度。

選擇與光合作用、產量、次生代謝合成、分解和貯存相關的各項指標，包括葉面積、芽寬、芽寬/芽長、角質層厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片厚度、芽長和柵海比等指標進行聚類分析，結果（圖4-B）顯示，當聚為三大類時，指標的類間距較大，各類特點較突出，相關性較小。第Ⅰ類包括葉面積、芽寬、芽寬/芽長、角質層厚度，第Ⅱ類包括柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片厚度、芽長，第Ⅲ類為柵海比。

2.6.2 抗性指標和品質指標的篩選 計算得出各指標間的相關系數(shù)（表4），將相關系數(shù)和層次聚類中某指標所在類的指標個數(shù)帶入相關指數(shù)計算公式=Σ/（-1）。相關指數(shù)決定各類代表性指標的選擇，指數(shù)越大，代表性越強。由表5可知，與抗性相關的指標中，第Ⅰ類的主脈厚度相關指數(shù)最大，可作為此類的代表指標；第Ⅱ類的葉面積相關指數(shù)最大，可作為此類的代表指標；第Ⅲ類的下表皮厚度為單獨指標；第Ⅳ類的柵海比和葉片組織結構緊密度2個指標的相關指數(shù)相等，但種質間柵海比最大差異值為0.18，遠大于葉片組織結構緊密度的最大差異值0.05，因此，選擇柵海比為代表指標更合適。由表6可知，與內含物質相關的指標中，第Ⅰ類的芽寬相關指數(shù)最大，可作為此類的代表指標；第Ⅱ類的海綿組織厚度相關指數(shù)最大，可作為此類的代表指標；第Ⅲ類的柵海比為單獨指標。

2.6.3 葉片形態(tài)特征、解剖結構特征與其綜合抗性和品質的隸屬函數(shù)分析 基于綜合抗性相關指數(shù)篩選出與抗性相關的4項代表指標，以及品質相關指數(shù)篩選與內含物質相關的3項代表指標，應用隸屬函數(shù)值法對4個種質的綜合抗性和品質進行評價，計算結果見表7和表8。由表7可知，抗性代表指標的隸屬函數(shù)平均值排序依次為綠芽株系（0.4743）＞紫芽株系（0.4618）＞福鼎大白茶（0.4312）＞龍井43號（0.3858）。由表8可知，內含物質代表指標的隸屬函數(shù)平均值排序依次為綠芽株系（0.4599）＞紫芽株系（0.4325）＞福鼎大白茶（0.4290）＞龍井43號（0.3888）。上述結果表明，貞豐野生茶樹綜合抗性強，內含物質豐富，綠芽株系的品質和抗性優(yōu)于紫芽株系。

3 討論

本研究對貴州貞豐地區(qū)野生茶樹、國家級良種福鼎大白茶和龍井43號的芽長、芽寬、葉面積和節(jié)間長等22項指標進行測量、比較和分析，發(fā)現(xiàn)野生茶樹資源綜合抗性更強，內含物質更豐富，可作為優(yōu)異種質資源進行開發(fā)和利用。

3.1 貞豐野生茶樹與栽培品種的遺傳差異性分析

野生茶樹具有遺傳多樣性，是茶樹品種創(chuàng)新的來源。抗性強、特異性成分突出的野生茶樹資源是開展品種改良的基礎，已成為近年來茶產業(yè)發(fā)展的重要手段（金基強等，2021）。形態(tài)學性狀的鑒定和描述是種質資源研究最直接、最基本的方法和途徑（郁香荷等，2011）。對綠芽株系、紫芽株系、福鼎大白茶和龍井43號共4個種質的22個檢測指標進行主成分分析，結果發(fā)現(xiàn)綠芽株系和紫芽株系與福鼎大白茶和龍井43號在形態(tài)學上差異巨大，但在野生茶樹內差異較小，表明野生茶樹與栽培品種的遺傳距離較大，與Niu等（2019）對貴州古茶樹的遺傳結構分析結果一致。芽寬、節(jié)間長、葉面積、氣孔數(shù)、葉色、葉片質地、葉片厚度、角質層厚度、柵欄組織厚度、上表皮厚度、主脈木韌比和葉脈對數(shù)等指標是野生茶樹與栽培型茶樹遺傳差異最顯著的農藝性狀，其與光合能力、干物質含量和品質性狀密切相關（王守生等，2002；農玉琴等，2020；Kodikara et al.，2020）。上述結果表明，野生茶樹在抗性和內含物質方面與栽培品種差異顯著，且野生茶樹群體內部存在遺傳差異性，其中綠芽株系在營養(yǎng)生長方面更具有優(yōu)勢。

3.2 貞豐野生茶樹綜合抗性評價

形態(tài)學特征和解剖學結構與抗性顯著相關（張玉葉等，2021）。茶樹芽葉表面茸毛密度越大，抗病蟲害能力就越強（尹鵬等，2016），綠芽株系和紫芽株系芽葉表面茸毛濃密，密度遠遠大于福鼎大白茶和龍井43號，表明野生茶樹抗蟲能力強。葉片角質層可有效防止水分散失，對細胞的受凍、解凍起著緩沖作用，角質層越厚，植物抗旱、抗寒和耐熱的能力越強（Ben Salem-Fnayou et al.，2011；王煙霞等，2021）。相同面積葉片氣孔數(shù)量越多，散熱能力越強（孟慶杰等，2004）。葉脈對數(shù)和主脈厚度影響植物體內水分和營養(yǎng)物質的運輸效率，葉片的葉脈對數(shù)越多，主脈越厚，表明植物對水分控制能力和抗旱耐熱能力越強（梁文斌等，2010）。本研究中野生茶樹的角質層厚度、氣孔數(shù)量、葉脈對數(shù)和主脈厚度顯著多于或厚于福鼎大白茶和龍井43號，表明野生茶樹抗旱、抗寒和耐熱能力更強。葉片表皮、柵欄組織厚度和葉片組織結構緊密度與植物逆境適應性呈正相關，與抗寒性也具有一定關系（劉夢穎和劉光立，2018；郭文文等，2020）。本研究中野生茶樹的上、下表皮均顯著厚于福鼎大白茶和龍井43號，綠芽株系的柵欄組織顯著厚于福鼎大白茶和龍井43號，而紫芽株系的柵欄組織厚度、綠芽株系和紫芽株系的葉片組織結構緊密度介于福鼎大白茶和龍井43號之間，即野生茶樹在以葉片組織結構緊密度為特征的抗性指標上弱于福鼎大白茶，但強于龍井43號，紫芽株系以柵欄組織厚度為特征的抗性指標上也介于2個國家級良種之間。盡管如此，分析表明，野生茶樹的綜合抗性顯著高于福鼎大白茶和龍井43，表明貞豐野生茶樹可作為提供抗性基因的優(yōu)異種質資源。

3.3 貞豐野生茶樹品質及適制性評價

茶樹芽和葉是茶樹進行光合作用、代謝物質合成與貯存的重要場所。芽和葉的形態(tài)學和解剖學特征能反映茶葉品質成分含量，是鑒定茶葉品質性狀的重要手段（王飛權等，2019）。芽頭是高級綠茶的原料，芽寬、芽長及其比值與芽頭肥瘦、芽頭品質成分含量成正比。芽葉茸毛富含茶氨酸和咖啡堿，也是茶葉毫香的來源（郭桂義等，2011；宋亞康等，2017）。本研究中貞豐野生茶樹的芽寬、芽長及其比值均顯著大于福鼎大白茶和龍井43號，且全芽覆蓋濃密茸毛，表明野生茶樹芽頭肥壯，內含物質豐富，是做高檔翠芽茶的優(yōu)質原料。李家華和朱力圖（2021）認為葉面積為40～60 cm的茶樹為大葉種。紫芽株系和綠芽株系平均葉面積分別為40.27和52.87 cm，均為大葉種群體種株系。綠芽株系的平均葉面積是紫芽株系的1.31倍，表明綠芽株系的代謝物質比紫芽株系更豐富。柵欄組織中葉綠體較多，液泡較小，而海綿組織則相反（李娟等，2008）。葉綠體中富含類胡蘿卜素，在茶葉加工過程中，類胡蘿卜素裂解為α-/β-紫羅酮、二氫海葵內酯、大馬士酮、茶螺烯酮等重要的香氣物質（傅秀敏等，2021）。液泡是貯存茶多酚的場所，海綿組織越厚，液泡體積越大，茶多酚含量則越高，反之亦然。野生茶樹的海綿組織均厚于福鼎大白茶和龍井43號，表明野生茶樹茶多酚含量較高，適制性范圍比福鼎大白茶和龍井43號更廣。綠芽株系的柵欄組織顯著厚于其他三種株系，紫芽株系介于福鼎大白茶和龍井43號之間，表明綠芽株系類胡蘿卜素香氣前體物質含量最豐富，紫芽株系類的胡蘿卜素含量可能低于福鼎大白茶、高于龍井43號。陳岱卉（2009）、覃秀菊等（2009）認為，柵欄組織在2～3層、厚75～125 μm、柵海比高于0.5且上表皮較厚的茶樹品種，在烏龍茶做青過程中有利于葉緣損傷和做青工藝的開展。而本研究結果顯示，綠芽株系具有3層柵欄組織，均厚82.09 μm，柵海比0.98，上表皮均厚20.33 μm，表明綠芽株系還適合加工烏龍茶。綜合各種品質性狀代表指標，隸屬函數(shù)值計算結果顯示，綠芽株系內含物質含量明顯高于其他3個種質，其次為紫芽株系，表明貞豐野生茶樹內含物質豐富，推測是娘娘茶醇和口感與馥郁香氣的物質基礎。

4 結論

通過對22項形態(tài)學特征和葉片解剖結構指標進行分析發(fā)現(xiàn)，在綜合抗性、品質和適制性方面，貞豐野生茶樹優(yōu)于福鼎大白茶和龍井43號，綠芽株系優(yōu)于紫芽株系。貞豐野生茶樹綠芽株系具有選育優(yōu)異種質資源的潛力。