煙草葉斑病新病原分離鑒定及其生物學特性測定

楊江敏，桑維鈞*，孔 菲，李昊熙，盧燕回，顧恒鋒，首安發，甘國喜，彭麗娟，楊茂發

（1貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質重點實驗室，貴州貴陽 550025；2中國煙草總公司廣西壯族自治區公司科技處，廣西南寧 530022；3廣西壯族自治區煙草公司賀州市公司，廣西賀州 542800）

0 引言

【研究意義】煙草（L.）隸屬茄科（Solanaceae）煙草屬（），是卷煙生產的主要原料（張希等，2021）。作為我國重要的經濟作物，煙草對促進農業經濟發展和增加煙農經濟收入具有重要意義。廣西位于我國西南部，地處中、南亞熱帶季風氣候區，熱量豐富，雨量充沛，各地年平均氣溫16.5～23.1 ℃，是我國煙草生產主要省區，其主產區為百色市、賀州市和河池市。葉斑病是煙草上最重要的病害，多數由真菌侵染引起，主要發生在煙葉成熟期，病菌主要通過傷口和自然孔口侵染葉片，煙葉組織被侵染發病后，病菌在組織上產生大量病原子實體，通過風、雨或氣流傳播，引起病原菌的再次侵染，嚴重影響煙葉的產量與烘烤質量（張思聶等，2021），而對病原菌種類進行準確鑒定是了解農作物病害流行規律，并有針對性地制定有效防控措施的前提。【前人研究進展】廣西煙草病害的系統鑒定始于20世紀90年代初（黃福新，1993）。截至目前，有關廣西煙區煙草侵染性病害的研究主要集中在煙草葉斑病、煙草病毒病、煙草黑脛病和煙草青枯病等（蒙姣榮等，2012；譚海文，2012；王五權等，2015），其中的煙草葉斑類病害包括赤星病、炭疽病和蛙眼病等國內其他煙區的常見病害（陳永德和覃春華，2010）。然而，受廣西煙草種植地區調整、耕作栽培制度及氣候條件變化等因素的影響，當地煙草病害呈現出種類復雜多樣、新病害不斷出現、危害損失加重、防控難度加大等趨勢（譚海文，2012）。在傳統形態學鑒定病原菌的基礎上，利用分子生物學方法對病原菌特定基因進行測序分析，可增加病害鑒定的準確性（Taylor et al.，2000）。譚海文等（2012）在病害調查中首次報道由多主棒孢（）引起廣西烤煙棒孢霉葉斑病，同時在關國經等（2000）形態學鑒定的基礎上首次通過rDNA-ITS對烤煙棒孢霉葉斑病的病原菌進行分子鑒定，并對該病原菌的生物學特性進行了補充研究，明確棒孢霉葉斑病在高溫多雨季節易暴發與病原菌喜溫好濕的特性有關。廖庭（2015）采用形態特征結合分子鑒定將由莖點霉引起的廣西煙草新葉斑病害的病原菌鑒定為，同時測定了該病原菌的生物學特性，為針對廣西煙草莖點霉葉斑病的防治研究提供了理論參考。真菌隸屬子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），格孢菌目（Pleosporales），亞隔孢殼科（Didymellaceae）。能引起巴西大豆（）豆莢炭疽病（Crous et al.，2019）和菊科雜草野茼蒿［（Benth.）S.Moore］葉斑病（He et al.，2021）。2020年，Cafà等通過基因組測序獲得第1個基因組序列，為真菌比較基因組學研究提供了新的基因信息資源。【本研究切入點】2021年3—6月廣西煙草生長季節，本課題組在賀州煙區開展病害調查過程中在煙草品種K326上發現一種癥狀明顯不同于赤星病和靶斑病等常見病害的煙草葉斑病，對于該病害病原菌的種類以及相關信息尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】采用組織分離法對從廣西賀州煙區采集的具明顯葉斑病癥狀的煙草葉片組織進行病原菌分離純化、致病性測定及培養性狀和形態特征觀察，結合多基因序列聯合分析［ITS、28S核糖體RNA基因（LSU）、β-微管蛋白基因（）和RNA聚合酶亞基基因（）］對病原菌進行鑒定，并研究不同溫度、培養基、pH、碳氮源和光照條件對病原菌菌絲生長的影響，以明確病原菌的分類地位和生物學特性，為病害的及時防控和后續研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 分別從賀州市鐘山縣（東經111°30′，北緯24°52′）和富川瑤族自治縣（東經111°16′，北緯24°49′）煙草品種K326上采集具明顯葉斑病癥狀的煙草葉片共70份，通過顯微鏡檢及病原菌分離培養，得到純化菌株用于后續試驗。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA，青島海博生物技術有限公司）；玉米汁瓊脂培養基（CMA，北京索萊寶科技有限公司）；察氏培養基（CDA，北京索萊寶科技有限公司）；燕麥培養基（OA，北京索萊寶科技有限公司）；番茄汁瓊脂培養基（TomA，自配）；煙葉汁瓊脂培養基（TobA，自配）；南瓜汁瓊脂培養基（PA，自配）；水瓊脂培養基（WA，自配）。自配培養基配方參照方中達（1998）的方法等量配比，所有培養基使用高壓蒸汽滅菌鍋（致微儀器有限公司）經121 ℃滅菌30 min，倒至9 cm的一次性培養皿中備用。

1.1.3 接種材料 生長至5～6葉期的盆栽K326品種健康煙株。

1.2 病原菌的分離

依據方中達（1998）的組織分離法對病原菌進行分離培養。操作步驟：用經火焰殺菌冷卻后的手術刀從葉片病健交界處切取大小約5 mm的病組織，經70%酒精消毒處理10 s，再由0.1%升汞溶液浸泡3～5 min，用無菌水沖洗3次后放在無菌濾紙上吸干水分，將組織接于PDA培養基上，28 ℃恒溫培養3 d，挑取組織周圍的白色菌絲進行純化。

1.3 病原菌致病性測定

將純化得到的病原菌菌株分別接種于PDA培養基上，暗培養3 d。在超凈工作臺上，用直徑5 mm的無菌打孔器打取菌碟，將菌碟左右對稱無傷接種于煙株第4～6片葉上，以接種空白PDA碟為對照，每盆接3片葉。將接種葉片用自封袋套袋，盆壁貼標簽，置于28 ℃恒溫培養箱中，保持濕度75%以上，5 d后觀察葉片發病情況，對發病葉片進行病原菌分離，通過柯赫氏法則驗證病原菌。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態學鑒定 參照郭強等（2019）的方法，將菌株分別接種于PDA和OA培養基上，28 ℃恒溫暗培養7 d后，觀察記錄菌落形態、顏色、菌絲疏密程度等，挑取菌絲體制作玻片，在光學顯微鏡下觀察病原菌菌絲形態和產孢結構特征。

1.4.2 分子生物學鑒定 將分離菌株接種于帶有滅菌半透膜的PDA培養基上，28 ℃暗培養5 d后，收集新鮮菌絲，參照真菌DNA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］的步驟進行病原真菌DNA提取。使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3'）（江艷等，2018）；TUB2Fd（5'-GTBCACCTYCA RACCGGYCARTG-3'）/TUB4Rd（5'-CCRGAYTGR CCRAARACRAAGTTGTC-3'）（Wondenberg et al.，2009）；RPB2-5F2（5'-GGGGWGAYCAGAAGAAGG C-3'）/fRPB2-7cR（5'-CCCATRGCTTGYTTRCCC AT-3'）（Sung et al.，2007）；LROR（5'-GTACCCGCT GAACTTAAGC-3'）/LR7（5'-TACTACCACCAAGAT CT-3'）（Hou et al.，2020）對菌株的rDNA-ITS序列及、、LSU基因進行PCR擴增，擴增條件參照Chen等（2015）、江艷等（2018）的方法進行。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

從GenBank中收集已知的其他相關病原菌的序列信息，通過MAFFT v.7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）進行序列比對，使用TrimAl v.1.3進行序列剪切，以MEGA 7.0將剪切后的序列按照ITS、LSU、、的順序進行拼接，應用IQ-TREE v.1.6.12將拼接后的序列采用最大似然法（Bootstrap值為1000次）構建系統發育進化樹。

1.5 病原菌生物學特性測定

1.5.1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 使用直徑5 mm的滅菌打孔器在培養3 d的菌落邊緣打取菌碟，將菌碟的菌絲面朝下接種于PDA培養基中央，分別置于5、10、15、20、25、28、30和35 ℃恒溫培養箱中暗培養（劉利佳等，2021）。每處理3次重復，7 d后觀察菌落生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑，下同。

1.5.2 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響 將5 mm的菌碟菌絲面朝下接種于8種不同培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養（何世芳等，2021）。

1.5.3 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響 以Czapek為基礎培養基，分別用等量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、肌醇、山梨糖醇和可溶性淀粉替代培養基中的蔗糖；同理，以等量的蛋白胨、硝酸銨、牛肉浸粉、氯化銨、尿素、甘氨酸和丙氨酸替代培養基中的硝酸鈉，制備不同碳、氮源培養條件（茍攀寧等，2021）。

1.5.4 不同pH對病原菌菌絲生長的影響 以PDA為基礎培養基，使用1% HCl和1% NaOH溶液調節培養基的pH為8個不同梯度（4、5、6、7、8、9、10和11）（姚錦愛等，2021）。

1.5.5 不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響 將5 mm的菌碟接種于PDA培養基上，分別置于3種光照條件（全光照、全黑暗、12 h光暗交替）的培養箱中恒溫培養。

材料計劃應詳盡并略有富余，一般應為計劃用量的102%，數量較少的關鍵管件應加倍計劃，計劃應周密、全面，必須有復核手續，避免出現因材料短缺造成停工、窩工現象，確保工程順利施工。

1.5.6 病原菌菌絲致死溫度測定 將5 mm的菌碟放入裝有1 mL無菌水的1.5 mL無菌離心管中，分別置于40、45、50、55、60和65 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min（先預熱1 min），取出后立即放入裝有常溫水的燒杯中冷卻；將處理后的菌碟接于PDA培養基中央，28 ℃恒溫培養。連續觀察7 d，確定菌絲致死溫度，以1 ℃為溫度梯度，重復上述試驗，最終確定致死溫度范圍（徐輝等，2020）。

1.6 統計分析

運用Excel 2010求取試驗數據的平均值、標準偏差以及構建柱形圖，采用SPSS Statistics 26的Duncan’s新復極差法進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

病害主要發生在烤煙成熟期，病原菌侵染葉片形成病斑。田間癥狀表現為病斑不規則或近橢圓形，中央灰白色，邊緣棕褐色且有黃綠色暈圈（圖1）。隨著病害的加重，病斑不斷擴大，易破裂形成穿孔，表面產生小黑點。

圖1 煙草葉斑病病害田間癥狀Fig.1 Field symptoms of tobacco leaf spot disease

2.2 病原菌分離純化結果

采用組織分離法對病樣進行病原菌分離，純化獲得7株菌株，其中，來自鐘山縣菌株4株，編號分別為GHZS80、GHZS21、GHZS8和GHZS3；來自富川縣菌株3株，編號分別為GHFC63、GHFC54和GHFC2。

2.3 病原菌致病性測定結果

健康盆栽煙株在無傷接種病原菌3 d后，接種部位開始變黃，周圍長出白色菌絲；接種7 d后，水漬狀病斑出現，逐漸變為褐色（圖2-A），與田間自然發病癥狀相似，對照未表現癥狀（圖2-B）。對發病的葉片進行分離觀察，得到與原接種菌株培養性狀和形態特征一致的病原菌，且7株菌株間的致病力無明顯差異。依據柯赫氏法則，確定接種菌為煙草葉斑病致病菌。

圖2 煙草葉斑病病原菌對煙草品種K326的致病性測定Fig.2 Pathogenicity determination of pathogen of tobacco leaf spot to K326 tobacco variety

2.4 病原菌培養性狀及形態特征描述

病原菌在PDA培養基上生長迅速，培養5 d后菌落呈現出同心圓，正面內層菌落深灰色，向外棕黃色，最外層黃膚色，菌絲較緊密，氣生菌絲稀疏，平板背面表現為中間黑褐色，向外棕褐色，邊緣淺灰色（圖3-A）；培養25 d后菌落變黑色（圖3-C）。在OA培養基上菌落深灰色，菌絲稠密，氣生菌絲較PDA上發達（圖3-B）。分生孢子器黑色，單房近球形，平均大小為109.300～440.330 μm×94.280～318.250 μm（n=8），產孢器上具喙狀結構（大小約為169.130 μm×31.953 μm）（圖3-D）；分生孢子無色，近似橢圓形，無隔膜，平均大小為3.520～3.830 μm×1.840～2.230 μm（n=80）（圖3-E）；菌絲具分支有橫隔，菌絲末端或中央分化出無色鏈珠狀膨大細胞（圖3-F）。

圖3 病原菌培養性狀及形態特征Fig.3 Culture traits and morphological characteristics of pathogens

2.5 病原菌分子生物學鑒定結果

將7株菌株的ITS、LSU、和序列測序結果進行處理和整合后提交至GenBank數據庫，獲得登錄號（表1）。從GenBank中下載與7株菌株同源性較高以及同屬內其他種的代表菌株的ITS、、、LSU序列（表2），以CBS 108.49作外群聯合構建系統發育進化樹，結果（圖4）顯示，7株菌株與LFN0148和YTH-12以100%的支持率聚為一支，能明顯與其他種區分。對7株菌株的ITS、LSU、和序列信息進行BLAST比較分析，結果表明，各菌株在基因序列上未存在差異。菌株GHZS80、GHZS21、GHZS8、GHZS3、GHFC63、GHFC54、GHFC2與菌株LFN0148和YTH-12相比，ITS、LSU、和的同源性均達100%。因此，結合菌株的形態學特征，將7株菌株鑒定為。

圖4 基于ITS、LSU、RPB2和TUB2構建的煙草葉斑病病原菌系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of tobacco leaf spot pathogens based on ITS，LSU，RPB2 and TUB2

表1 菌株登錄號Table 1 Strain login ID

表2 從GenBank下載的相關菌株序列及信息Table 2 Sequence and information of relative fungal strains downloaded from GenBank

2.6 病原菌生物學特性測定結果

圖5 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different temperatures on mycelium growth of pathogens

2.6.2 培養基對病原菌菌絲生長的影響 在CMA、CDA、TomA、TobA和PA 5種培養基上，菌株GHZS8的生長速度最快，與其余6株菌株的菌落直徑差異顯著；菌株GHZS8的最適生長培養基為PA，菌株GHZS80、GHZS21、GHZS3、GHFC63、GHFC54和GHFC2的最適生長培養基均為PDA（圖6）。綜合各方面因素，7株病原菌的適宜培養基為PDA、OA和PA培養基。

圖6 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響Fig.6 Effects of different media on mycelium growth of pathogens

2.6.3 碳源對病原菌菌絲生長的影響 7株菌株的最適碳源均為可溶性淀粉，且菌株GHZS8的生長速度最快，與其余6株菌株的菌落直徑差異顯著；在以乳糖為唯一碳源的培養基上菌株GHZS3生長最快，菌株GHFC63生長最慢；菌株GHZS8在除乳糖外的所有碳源條件下均表現出優勢，生長速度均最快，與其余6株菌株的菌落直徑差異顯著（圖7）。

圖7 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響Fig.7 Effects of different carbon sources on mycelium growth of pathogens

2.6.4 氮源對病原菌菌絲生長的影響 以蛋白胨為唯一氮源時，菌株GHZS21、GHZS3和GHFC2的生長速度最快，優于在其他氮源培養基上的菌落直徑；以牛肉浸粉為唯一氮源時，菌株GHZS80、GHZS8、GHFC63和GHFC54的生長速度最快，優于在其他氮源培養基上的菌落直徑；菌株GHZS8在分別以蛋白胨、甘氨酸、丙氨酸、硝酸銨、牛肉浸粉和尿素為唯一氮源的培養基上生長速度均顯著快于其他菌株，在以氯化銨為氮源的培養基上生長最慢，說明氯化銨為菌株GHZS8生長的最不適宜氮源（圖8）。

圖8 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth of pathogens

2.6.5 pH對病原菌菌絲生長的影響 7株菌株在pH 4～pH 11內均能生長，但最適pH不盡相同，其中，菌株GHFC54和GHFC2最適生長pH為6，菌株GHZS80、GHZS3和GHFC63最適生長pH為7，菌株GHZS21最適生長pH為8，菌株GHZS8最適生長pH為9；當pH為4時，7株菌株的生長均受到明顯抑制，但菌株GHZS8的生長顯著快于其他菌株（圖9）。

圖9 不同pH對病原菌菌絲生長的影響Fig.9 Effect of different pH on mycelium growth of pathogens

2.6.6 光照對病原菌菌絲生長的影響 7株菌株均在全光照條件下生長最快，全光照處理對菌株GHFC2菌絲生長的影響較其余2種處理明顯；光暗交替處理則對菌株GHFC54生長的影響較大；在全黑暗條件下菌株GHZS3生長最慢，與其他菌株的菌落直徑差異顯著（圖10）。

圖10 不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響Fig.10 Effects of different light conditions on mycelium growth of pathogens

2.7 病原菌的致死溫度測定結果

7株菌株經45 ℃水浴處理10 min后在PDA培養皿上仍能生長，經50、55、60和65 ℃水浴處理10 min后菌株未生長。以1 ℃為梯度在45～50 ℃內對病原菌菌株進行水浴處理，結果顯示7株菌株在50 ℃水浴處理10 min后菌絲不再生長，表明菌株的致死溫度為50 ℃水浴10 min。

3 討論

本課題組在調查中發現廣西賀州市鐘山縣和富川縣煙草品種K326上存在一種真菌性葉斑病害，田間癥狀表現為病斑不規則或近橢圓形，中央灰白色，邊緣棕褐色且有黃綠色暈圈，受害后期病斑易破裂形成穿孔，表面產生小黑點，與常見煙草葉部病害的癥狀有所不同。通過形態特征結合多基因序列分析（ITS、LSU、和），將病原菌鑒定為，這是由引起煙草葉斑病在國內的首次報道。2019年，Crous等報道在巴西是一種植物致病真菌，可引起大豆豆莢炭疽病，隨后He等（2021）報道在我國廣西百色市可引起菊科雜草野茼蒿葉斑病，證實的非寄主專一性。菊科是煙田種類最多的雜草之一（羅戰勇等，2007），野茼蒿是否可作為在煙田中傳播病原體的橋梁以及對除煙草品種K326以外的其他品種煙草的致病性還有待驗證。

本研究中在PDA培養基上生長的正面菌落特征為最內層深灰色，向外棕黃色，最外層黃膚色，與大豆豆莢炭疽病的致病菌株LFN0148和野茼蒿葉斑病的致病菌株YTH-12在PDA培養基上的菌落特征存在一定差異，菌株LFN0148表現出正面中央黑褐色，邊緣醋灰色，菌株YTH-12表現為正面內圈灰白色，外圈橙黃色，產生上述特征差異的原因可能與地域、不同寄主以及培養周期有關。本研究中的分生孢子器、分生孢子大小以及菌絲等的形態特征與Crous等（2019）和He（2021）等的描述基本吻合。本研究在前人對形態特征描述的基礎上增加了對膨大細胞的描述，并對產孢器上的喙狀結構進行測量，大小約為169.130 μm×31.953 μm。

目前，尚無關于生物學特性方面的報道。本研究對7株分離菌株的生物學特性測定結果表明，7株菌株在10～35 ℃內均可生長，菌絲的最低致死溫度為50 ℃水浴10 min，病原菌的生長溫度范圍較廣，適宜菌絲生長的溫度范圍為25～28 ℃。賀州市為典型的亞熱帶季風氣候，日照充足，土壤肥沃（莫水英，2020），4—7月的月平均溫度為18～34 ℃，年平均相對濕度在78%左右，年均降水量1535.6 mm，病原菌的生長特性與該地區的氣候與環境條件相適宜，因此由引起的煙草葉斑病發生流行的潛在風險較高。菌株GHFC54和GHFC2生長最適pH為6；菌株GHZS3、GHZS80和GHFC63生長最適pH為7；菌株GHZS21生長最適pH為8；菌株GHZS8生長最適pH為9，表明喜好在弱酸性至弱堿性環境條件下生長。7株菌株在全光照條件下生長最快，最適碳源為可溶性淀粉，菌株GHZS21、GHZS3和GHFC2的最適氮源為蛋白胨，菌株GHZS80、GHZS8、GHFC63和GHFC54的最適氮源為牛肉浸粉，說明同一病原菌的生物學特性在不同分離菌株上存在差異。本研究初步探討了不同溫度、pH、光照、培養基以及不同碳氮源處理對菌絲生長的影響，存在一定的局限性，但對引起煙草葉斑病的發生和防治提供了理論參考，下一步研究工作將聚集在的侵染機制以及病害防治等方面。

4 結論

引起廣西賀州煙區煙草葉斑病的病原菌為，最適菌絲生長的溫度為25～28 ℃，菌絲的最低致死溫度為50 ℃水浴10 min，該菌喜好在弱酸性至弱堿性、陽光充足且營養豐富的環境條件下生長。根據病原菌的生物學特性，在煙草生產過程中可通過控制煙草種植密度、加強田間管理以及采取化學、生物防治手段對由引起的煙草葉斑病進行綜合防控。