半滑舌鰨顆粒酶B基因的克隆和表達分析*

扶曉琴 王 娜 王佳林 陳松林 趙法箴

半滑舌鰨顆粒酶B基因的克隆和表達分析*

扶曉琴1,2王 娜2王佳林2陳松林1,2趙法箴1,2①

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院 江蘇 無錫 214081；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 山東 青島 266071)

顆粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎癥反應必不可少的介質(zhì),可激活半胱天冬酶3，進而誘導靶細胞的凋亡。本研究通過PCR擴增和RACE技術獲得了半滑舌鰨()顆粒酶B基因()的全長cDNA序列，并對其序列特征和表達水平進行了分析。結(jié)果顯示，cDNA全長為923 bp，開放閱讀框長度為780 bp，編碼259個氨基酸(前19個氨基酸殘基為信號肽序列)，5′非編碼區(qū)為49 bp，3′非編碼區(qū)為94 bp。的基因組結(jié)構比較保守，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。CsGzmBl蛋白包含2個N端糖基化位點、1個催化三聯(lián)體“His63Asp112Ser207”、1個“PHSRPYMA”結(jié)構域及6個保守的半胱氨酸。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在半滑舌鰨健康成魚不同組織中均有表達，其中，在脾臟中表達量最高，頭腎、中腎、肝臟和鰓中表達量次之，在肌肉中表達量最低。與對照組0 h相比，在哈維氏弧菌()感染后的不同時間點的脾臟、腸、肝臟、皮膚、鰓和腎臟中的表達水平均有不同程度的上調(diào)。研究表明，基因在半滑舌鰨抵御哈維氏弧菌感染過程中發(fā)揮重要作用。

半滑舌鰨；哈維氏弧菌；顆粒酶B基因；表達分析

半滑舌鰨()是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一，主要分布在我國沿海地區(qū)，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者喜愛，具有良好的市場需求和養(yǎng)殖開發(fā)潛力。然而，高密度集約化養(yǎng)殖以及環(huán)境污染等導致半滑舌鰨多種疾病頻繁暴發(fā)。其中，最嚴重的是由哈維氏弧菌()引起的細菌性疾病，嚴重制約了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(陳政強等, 2012; 于孟君等, 2017; 王雙艷等, 2019)。近年來，以提高魚體抗病力為目標的良種選育，被認為是當下解決半滑舌鰨病害的一種行之有效的方法(Zhou, 2019)。長期以來，魚類免疫機制及抗病分子機制的基礎研究比較薄弱，嚴重阻礙了魚類抗病育種的發(fā)展(陳松林, 2004; 周欣等, 2021)。因此，對半滑舌鰨抗病分子機制的研究迫在眉睫，這將為其病害防治提供重要的理論依據(jù)。目前，關于基因在半滑舌鰨中的研究尚未見報道。因此，本研究對半滑舌鰨基因()的全長cDNA序列進行克隆，采用實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)檢測了該基因在健康半滑舌鰨不同組織中的表達模式，以及哈維氏弧菌感染后不同組織的表達水平，旨在為進一步研究該基因在半滑舌鰨免疫應答中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 正常組織樣品采集 本實驗所用半滑舌鰨均購自山東省海陽市黃海水產(chǎn)公司，在22℃循環(huán)海水中養(yǎng)殖。選取5尾健康、體重為(104.9±4.6) g的半滑舌鰨個體，分別收集鰓、頭腎、肝臟、腸、皮膚、腦、中腎、肌肉和脾臟共9個組織，立即置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)入–80℃保存。

1.1.2 哈維氏弧菌感染與樣品采集 采用Wei等(2018)的方法，對10月齡健康半滑舌鰨進行哈維氏弧菌感染實驗。首先定量培養(yǎng)哈維氏弧菌(Wang, 2017)，然后用無菌PBS將哈維氏弧菌稀釋至終濃度為1.0×104CFU/mL，用于半滑舌鰨腹腔注射實驗，對照組注射等體積的無菌PBS。分別在感染前0 h與感染后12、24、48、72及96 h共6個時間點取樣，每個時間點分別取3尾半滑舌鰨，取其肝臟、脾臟、腎臟，腸、鰓和皮膚共6個組織，放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)入–80℃保存。

1.2 RNA提取與cDNA合成

使用RNA提取試劑盒(Invitrogen, 美國)提取各組織的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。RNA質(zhì)量鑒定合格后，使用Prime ScriptRTreagent kit with gDNA eraser試劑盒(TaKaRa, 日本)合成cDNA。使用SmartTMRACE cDNA amplification kit (TaKaRa, 日本)合成RACE-Ready cDNA。

1.3 CsGzmBl基因全長cDNA的克隆

根據(jù)半滑舌鰨全基因組測序結(jié)果(Chen, 2014)，獲得基因的預測序列(登錄號：XM_008328902.3)，以該序列片段設計引物(表1)，先進行普通PCR擴增，驗證其ORF區(qū)。普通PCR擴增體系：2×ExMix(TaKaRa, 日本) 25 μL，CsPRF1l- ORF-F/R引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補至50 μL。PCR擴增條件：94℃ 4 min；35個循環(huán)(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用DNA膠回收試劑盒(天根，中國)進行純化回收。將純化的片段連接到pEasy-T1載體(全式金，中國)，通過42℃熱激法轉(zhuǎn)入到Trans-T1感受態(tài)細胞中(全式金，中國)，最后挑取單克隆，送華大基因進行測序，成功獲得的ORF區(qū)序列。

以得到的ORF區(qū)序列設計RACE引物(表1)，以合成的RACE-Ready-cDNA為模板，通過降落PCR進行5′-RACE和3′-RACE PCR擴增。第1輪反應體系為10 μL，按照TMhot start (TaKaRa, 日本)說明書加樣。PCR程序：94℃ 30 s；72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 5 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。將第1輪的PCR反應產(chǎn)物稀釋50倍后作為第2輪普通PCR的模板，普通PCR體系和程序均同上所述。擴增完成后，進行分子克隆實驗，并挑取單克隆送測序。成功獲得5′和3′端序列，然后，通過DNAstar軟件進行拼接，最終獲得的cDNA全長序列。

1.4 序列分析

利用在線程序ORFinder (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/)推導基因的氨基酸序列。使用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對不同物種GzmB的氨基酸序列進行同源性搜索。使用ExPASy在線軟件的ProtParam程序(http://au.expasy. org/tools/protparam.html)計算CsGzmB的相對分子質(zhì)量和理論等電點等理化參數(shù)。基于SMART 4.0程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測該蛋白的信號肽序列及功能結(jié)構域。使用在線程序SoftBerry-Psite (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc)預測該蛋白的功能位點。使用Predict Protein (https://www.predictprotein.org/)預測該蛋白的二級結(jié)構。使用在線軟件GSDS 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/index.php)比較不同物種的基因組結(jié)構。使用BioEdit軟件進行脊椎動物GzmB的氨基酸序列比對。使用MEGA 7.0軟件通過NJ法–鄰位相連法構建GzmB的系統(tǒng)進化樹。

1.5 檢測CsGzmBl基因的表達模式

應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測基因在半滑舌鰨健康成魚不同組織以及哈維氏弧菌刺激后免疫相關組織中的表達水平。選用作為內(nèi)參基因，用于qRT-PCR的引物均列在表1中。使用SYBR?Premix ExTM(TaKaRa, 日本)試劑盒，按照說明書在ABI 7500 Fast Real-time (Applied Biosystems, 美國)儀器上進行基因的定量分析。每個樣品設置3個平行，使用2–ΔΔCt方法(Livak, 2001)計算目的基因的相對表達量。所有實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較。當<0.05時為差異顯著(<0.05)；當<0.01時為差異極顯著(<0.01)。

表1 本研究所用的引物

Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 CsGzmBl基因的cDNA序列分析

基因的cDNA全長為923 bp，其開放閱讀框(ORF)為780 bp，5′非編碼區(qū)(UTR)為49 bp，3′UTR為94 bp (在polyA尾部上游5 bp處存在一個多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA))。ORF編碼一個由259個氨基酸殘基組成的蛋白，分子量為29.06 kDa，理論等電點為9.23，總平均疏水系數(shù)為–0.353，脂肪系數(shù)為77.53，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為42.36，表明該蛋白不穩(wěn)定。信號肽預測顯示，該蛋白的N端存在一個由19個氨基酸殘基組成的信號肽。功能位點預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含2個N端糖基化位點(分別為NSSH和NNSK)以及5個二硫鍵。亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，CsGzmBl屬于胞外分泌蛋白(圖1)。

圖1基因的核苷酸與氨基酸序列

Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of

非編碼區(qū)用小寫字母表示，編碼區(qū)用大寫字母表示。2個預測的N端糖基化位點(NSSH和NNSK)用灰色陰影標注。起始密碼子和終止密碼子用紅色加粗字母表示。聚腺苷酸化信號和多聚腺昔氨酸加尾信號分別用方框和下劃線標出。

UTR is in lowercase, and ORF is in uppercase. Two predicted N-glycosylation sites (NSSH and NNSK) are shaded in greys. The start codon and stop codon are red in bold. The polyadenylation signal and polyadenylation tail are boxed and underlined, respectively.

2.2 多氨基酸序列比對和進化分析

對不同物種的GzmB氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，在脊椎動物GzmB中比較保守的一些功能域及位點也同樣存在于CsGzmBl中。CsGzmBl具有一個典型的絲氨酸蛋白酶家族所特有的“催化三聯(lián)體His63Asp112Ser207”，一個保守的蛋白活性中心，一個保守的前導肽(ED)，一個保守的“PHSRPYMA”序列以及6個保守的半胱氨酸(Cys)(圖2)。保守的Cys分別為Cys 48、Cys 64、Cys 146、Cys 177、Cys 192和Cys 213，其中，Cys 48與Cys 64，Cys 146與Cys 213，Cys 177與Cys 192分別各自形成了二硫鍵。此外，CsGzmBl的Cys 5與Cys 13，Cys 203與Cys 229也分別各自形成了二硫鍵。CsGzmBl 5個二硫鍵位置如圖2所示。

為更明確CsGzmBl的進化地位，選用CsGzmBl與其他物種的GzmB、GzmA及GzmM的氨基酸序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，所有物種的GzmA聚為一大支；CsGzmBl與其他物種的GzmB聚為另一大支，其中，部分物種的GzmM與GzmB聚在一起。在GzmB這一支中，發(fā)現(xiàn)有2個主要的不同分支，其中，所有硬骨魚類的GzmB聚為一支，其他脊椎動物的GzmB聚為一支，這2大支最終匯聚在一起。因此，脊椎動物Gzm氨基酸的同源性符合進化規(guī)則。

圖2 CsGzmBl基因與其他脊椎動物GzmB基因的多氨基酸序列比對

相同氨基酸和相似氨基酸分別用黑色和淺灰色陰影表示。星號表示6個保守的半胱氨酸的位置，三角形表示保守的催化三聯(lián)體，黑色長方形表示保守的蛋白活性中心。不同物種信號肽的位置用白色框標注。CsGzmBl蛋白的二硫鍵由雙箭頭表示，其前導肽由雙線表示。

Identical and similar amino acids are shaded in black and light gray, respectively. Asterisks indicate 6 conserved cysteines, black triangles indicate conserved catalytic triads, and black rectangles indicate conserved protein active centers. The positions of signal peptides of different species are marked with white boxes. The disulfide bond of the CsGzmBl protein is represented by a double arrow, and its activation di-peptide peptide is represented by a double line.

圖3 GzmB、GzmA以及GzmM氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

CsGzmBl用黑色五角星表示。

CsGzmBl was marked with a black five-pointed star.

2.3 GzmB的基因組結(jié)構

以基因的全長cDNA序列與半滑舌鰨全基因組序列進行比對，獲得的基因組DNA序列，將之與的ORF序列進行比較分析，得到的基因結(jié)構。基因由1890個堿基組成，包括5個外顯子與4個內(nèi)含子。外顯子–內(nèi)含子邊界均符合AG/GT拼接規(guī)則，所有的3′末端受體位點具有共同的AG序列，所有的5′末端供體位點部位都有共同的GT序列。將半滑舌鰨與其他物種的基因組結(jié)構進行比較，發(fā)現(xiàn)的基因組結(jié)構比較保守，均是由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成(圖4)。

圖4 CsGzmBl和其他物種GzmB基因的外顯子–內(nèi)含子結(jié)構比較

Exons are in blue rounded rectangles; 5′UTR and 3′UTR are in orange rounded rectangles. Lines indicate the introns. The mRNA and gene accession numbers of different speciesare as follows:: XM_008328902.3, NC_024322.1;(): XM_017478999.1, NC_030425.1;): XM_019268918.2, NC_040028.1;(): XM_020594827.1, NW_018127904.1;(): XM_015052332.1, NW_015113718.1;(): XM_034180280.1, NC_047112.1

2.4 CsGzmBl在不同組織中的表達模式

半滑舌鰨健康成魚鰓、頭腎、肝臟、腸、皮膚、腦、中腎、肌肉、脾臟共9個組織中的表達情況如圖5所示。從圖5可以看出，在這些組織中呈現(xiàn)出不同的表達情況，其中，在脾臟中表達量最高，在頭腎、中腎、肝臟和鰓中表達量次之，在其他組織中表達量較低，在肌肉中表達量最低。

2.5 哈維氏弧菌刺激后CsGzmBl基因的表達變化

哈維氏弧菌刺激后，與對照組0 h相比，mRNA的表達水平在脾臟、腸、肝臟、皮膚、鰓和腎臟中均有不同程度的上調(diào)。如圖6所示，在脾臟、腸和鰓中，的表達水平僅在細菌感染48 h后有明顯的上調(diào)趨勢(0.05或0.01)，在其他時間點無明顯變化。在皮膚中，mRNA的表達量在細菌感染72 h后顯著增加(<0.05)，在其余時間點與對照組相比無顯著差異(>0.05)。在肝臟和腎臟中，細菌感染后96 h，的表達水平顯著上升(<0.05)，其余時間點與對照組相比也無顯著差異(>0.05)。

3 討論

本研究通過RACE方法獲得了基因的cDNA全長，并對其序列進行分析，發(fā)現(xiàn)基因具有一些保守的功能域或功能位點。CsGzmBl具有一個序列為“His63Asp112Ser207”的催化三聯(lián)體，催化三聯(lián)體是膚凝乳蛋白酶的典型特征，是形成可實現(xiàn)精確三維定向的支架所必需的部分(Branden, 1991)，在Gzm蛋白家族成員中高度保守(Smyth, 1996)，如大西洋鱈GzmA/K、尼羅羅非魚Gzm及銀鯽Gzm中均具有催化三聯(lián)體“His57Asp102Ser195”(Matsuura, 2014; Praveen, 2006; Wernersson, 2006)。此外，CsGzmBl蛋白還具有一個保守的前導肽ED(GluAsp)，在攜帶翻譯信息的酶轉(zhuǎn)移到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞外顆粒過程中起不可或缺的作用(Praveen, 2004)。大多數(shù)哺乳動物，如馬、人、大鼠及小鼠的GzmB蛋白的N末端都具有一個高度保守的序列“GlyGlu(EG)或Glu-Glu(GG)”的前導肽(Caputo, 1993)。研究表明，Gzm氨基酸激活的前肽后面1～4位(IIGG)與9～16位(PHSRPYMA)高度保守(Trapani, 2001; Piuko, 2007; Pham, 1999)。哺乳動物，如人、大鼠，小鼠及馬Gzm蛋白中均具有這2個保守結(jié)構域，其中，IIGG結(jié)構域是前肽裂解激活蛋白酶所必需的(Smyth, 1995)。本研究中，CsGzmBl前導肽后1～4位為“IVNG”，類似于哺乳動物Gzm蛋白的“IIGG”，第10～16位是保守的“PHSRPYMA”結(jié)構域。

圖5 CsGzmBl mRNA在健康半滑舌鰨成魚不同組織中的表達水平

數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示(=3)。柱狀圖上方的不同字母表示各個組織之間存在顯著性差異(<0.05)。

All data are shown as Mean±SE (=3). Different letters above the bars indicate significant difference at the level of<0.05.

Huang等(2010)報道稱，魚類Gzms與哺乳動物的GzmA/B/K關系更近，可能是因為GzmA/B是更古老的祖先基因。因此，推測GzmB在進化上處于更高地位，而GzmM可能由GzmB進化而來。本研究選擇A和M作為進化分析的組成部分，而最終的進化分析發(fā)現(xiàn)，魚類的GzmM與GzmB聚在一起，證實了此推測。本研究還發(fā)現(xiàn)，所有物種的GzmB始終聚在一起，符合GzmB的同源進化規(guī)則。基因結(jié)構比較發(fā)現(xiàn)，與其他魚類基因均由5個外顯子與4個內(nèi)含子組成。據(jù)報道，家族所有成員的基因結(jié)構極其保守，如鯉、斑馬魚()、尼羅羅非魚及人與基因均由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成(Huang, 2010; Praveen, 2006)。本研究中，的基因結(jié)構符合外顯子和內(nèi)含子法則(Mount, 1982)，但與其他魚類基因相比，基因的長度明顯較短。以上結(jié)果表明，既具備Gzm家族的典型特征，也具有GzmB的特點，進化上與Gzms家族其他成員有明確區(qū)別，因此，該基因?qū)儆谟补囚~類同源基因。

關于魚類基因組織表達模式的研究十分有限，僅在幾種魚中有報道鯉中基因在脾臟、鰓及頭腎中高表達(腎臟中最高)，其次是腎臟和腸，在肝臟和皮膚及肌肉中表達量最低(Huang, 2010)。尼羅羅非魚的僅在腎臟和血液中被檢測到，在肝臟、脾臟、鰓及肌肉中均未發(fā)現(xiàn)表達(Praveen, 2006)。在銀鯽中，mRNA在鰓和脾臟中表達量最高，在肝臟中表達量最低(Matsuura, 2014)。雖然魚類基因呈現(xiàn)出不同的組織表達模式，但它總能在免疫相關組織中被檢測到。本研究發(fā)現(xiàn)，mRNA在半滑舌鰨健康成魚9個組織中呈現(xiàn)不同的表達水平，其中，在脾臟中表達量最高，頭腎、中腎、肝臟和鰓中表達量次之，肌肉中表達量最低。綜合表明，基因可能在半滑舌鰨先天性免疫中具有重要作用。

許多研究表明，基因在病毒和細菌感染過程中發(fā)揮重要作用，相關研究在哺乳動物中有大量報道。然而，關于魚類基因在細菌感染后的表達研究十分有限在鯉中發(fā)現(xiàn)GzmA/K可以被SVCV病毒所誘導(Huang, 2010)。鯽魚的基因可以被遲緩愛德華氏菌()所調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌感染后，基因在肝臟、腎臟、脾臟、腸、鰓及皮膚6個組織中均顯著上調(diào)，說明參與半滑舌鰨的免疫防御作用，但其具體的功能和作用機制尚不清楚，還需進一步研究。

圖6 哈氏弧菌感染后脾臟、腸、肝臟、皮膚、鰓和腎臟中CsGzmBl mRNA的表達情況

樣品取自感染后0、12、24、48、72及96 h。數(shù)值以平均值±標準誤表示(=3)。星號表示顯著性差異(**<0.01，*<0.05)。

The samples are tested at 0, 12, 24, 48, 72 and 96 h after infection. All the data are shown as Mean±SE (=3). The asterisk indicates a significant difference (**<0.01, *<0.05).

綜上所述，本研究通過對基因的克隆、序列特征描述以及表達模型分析，初步表明參與半滑舌鰨免疫應答過程，為進一步研究在半滑舌鰨抗病免疫中的作用機制奠定了基礎。

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Characterization and Expression Analysis ofGene in Half Smooth Tongue Sole ()

FU Xiaoqin1,2, WANG Na2, WANG Jialin2, CHEN Songlin1,2, ZHAO Fazhen1,2①

(1. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi, Jiangsu 214081, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao, Shandong 266071, China)

B is an indispensable mediator of the immune inflammatory response, which can induce apoptosis of target cells by activating caspase 3. In this study, we cloned the full-length cDNA oflike gene () and analyzed its sequence characteristics and expression levels. The full-length cDNA ofwas 923 bp, containing a 49 bp 5?UTR, 94 bp 3?UTR, and 780 bp ORF regions encoding 259 amino acid proteins with 19 amino acid signal peptides. The genome structure ofis highly conserved and consists of five exons and four introns. The CsGzmBl protein possesses two N-terminal glycosylation sites, a catalytic triad “His63Asp112Ser207,” a “PHSRPYMA” domain, and six conserved cysteines. qRT-PCR indicated thatwas expressed in different tissues of healthyadults, with the highest expression in the spleen, followed by that in the head kidney, kidney, liver, and gills, with the lowest expression in muscle. After infection with,was up-regulated to varying degrees in six immune-related tissues (spleen, intestine, liver, skin, gills, and kidneys) at different time points compared to the control group at 0 h. These results indicate thatplays an important role in the immune response ofagainstinfection.

;;; Expression analysis

ZHAO Fazhen, Email: zhaofz@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20210518002

*國家自然科學基金(31530078; 31973006)和中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務費(2020TD20)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31530078; 31973006), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD20)]. 扶曉琴，E-mail: qinxiaoqinxiao@163.com

趙法箴，E-mail: zhaofz@ysfri.ac.cn

2021-05-18,

2021-06-08

Q522

A

2095-9869(2022)04-0136-11

http://www.yykxjz.cn/

扶曉琴, 王娜, 王佳林, 陳松林, 趙法箴. 半滑舌鰨顆粒酶B基因的克隆和表達分析. 漁業(yè)科學進展, 2022, 43(4): 136–146

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(編輯 馮小花)