雙絨毛膜雙胎生長不一致的非靶向代謝組學研究

宮曉麗 魏瑗 李曉娜 郭一潔 趙揚玉

胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)是產科常見的并發癥之一，國內發病率為6%～13%[1]，可導致圍產期的不良妊娠結局，亦增加成人期代謝性疾病的發生風險。FGR不僅在單胎妊娠中發生，雙胎妊娠時，兩胎兒生長不一致也會表現為一胎兒FGR，單絨毛膜雙胎妊娠(monochorionic double amniotic，MCDA)和雙絨毛膜雙胎妊娠(double chorionic double amniotic，DCDA)診斷標準略有不同，但均存在一胎兒存在生長受限的情況。盡管MCDA發生選擇性胎兒生長受限(selective fetal growth restriction，sFGR)的風險更高，但在排除宮內胎兒死亡和MCDA特異性并發癥后，絨毛膜性質不同的雙胎在產科并發癥、新生兒死亡率和發病率方面并無差異[2]。新生兒發病率和死亡率隨兩胎兒體重差異增加而升高，當體重差異在26%～30%時，相對危險度為2.9，當差異升高到31%～40%時，相對危險度達5.6[3]。DCDA發生生長不一致的原因主要為胎盤灌注不足，研究顯示DCDA中生長受限兒更容易發生胎兒窘迫，且在發生胎兒窘迫前超聲顯示其臍動脈搏動指數(pulsatility index，PI)與單胎生長受限兒的表現一致，均為逐漸增加，而MCDA合并有雙胎輸血綜合征的小胎兒超聲表現為心輸出峰速增加，并無PI的變化[4]。

代謝組學是最接近表型的組學研究手段，能夠直接反映機體因生理或病理情況發生的變化。既往已有多項研究將代謝組學應用于圍產領域來幫助診斷和預測妊娠期并發癥如子癇前期[5-6]，妊娠期糖尿病[7-8]等，從代謝的角度加深對疾病發生機制的理解。而應用于FGR的研究主要集中在單胎妊娠，以及發生在MCDA的sFGR[9-16]，尚無研究關注DCDA雙胎生長不一致。本研究利用基于超高效液相色譜-質譜聯用儀(UPLC-MS)的非靶向代謝組學方法篩選雙胎生長不一致兩胎兒臍血差異代謝物，以期為DCDA胎兒生長異常及FGR的發生機制提供更多線索。

對象與方法

一、研究對象

本研究為回顧性病例對照研究，經北京大學第三醫院醫學倫理委員會批準[(2017)醫倫審第(089-02)號]。本研究納入2017年7月—2020年7月在北京大學第三醫院建檔并規律產檢的雙胎妊娠孕婦。

1.納入標準：DCDA，雙胎均活產，孕婦年齡18～45歲；按照《雙胎妊娠臨床處理指南》[17]篩選雙胎生長不一致病例。生長不一致診斷標準：雙胎中一胎兒估測體重<同胎齡第3百分位數；或一胎兒符合以下3個條件中的至少2個：(1)一胎估測體重<第10百分位數；(2)2個胎兒估測體重差異≥25%；(3)較小胎兒的臍動脈搏動指數>第95百分位數。

2. 排除標準：母體孕期嚴重并發癥或合并癥，如重度子癇前期，早發型子癇前期、妊娠期糖尿病等急慢性病史；胎兒染色體異常或先天性畸形。

二、研究方法

1. 臨床信息采集：(1)孕婦一般資料。主要包括年齡、身高、孕前體重等；(2)孕婦臨床資料。主要包括孕產次、既往疾病史、本次妊娠方式、并發癥、分娩孕周、分娩方式、有無胎膜早破等；(3)胎兒資料。主要包括性別和出生體重。

2. 樣本采集與儲存：采集分娩時兩胎兒臍血2～4 mL于EDTA抗凝管中離心后，移取上層血漿并分裝于1.5 mL離心管中，-80℃冰箱保存至檢測。

3. 非靶向代謝組學研究:

(1)儀器與試劑。液相色譜質譜聯用儀(UPLC-MS)配備有：DionexTMUltiMateTM3000超高效液相色譜(美國Thermo公司)，Q ExactiveTM四極桿軌道離子阱質譜(美國Thermo公司)以及XCalibur質譜數據采集軟件(美國Thermo公司)。BEH Amide(1.7 μm 2.1 mm*100 mm)親水作用色譜柱(美國Waters公司)，Mix-3000 震蕩混勻器(杭州米歐儀器有限公司)，Mikro 220R臺式高速冷凍離心機(德國Hettich公司)，真空離心濃縮儀(美國Thermo公司)，色譜純甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨(美國Fisher Scientific)，氨基酸同位素混合內標(美國CIL公司)。

(2)樣品制備。血漿樣本在4°C冰箱融化30～60分鐘，取100 μL血漿至1.5 mL離心管中，加入300 μL的乙腈，充分振蕩15秒，進行蛋白沉淀。12 000 rpm，4℃，離心10分鐘。取上層液100 μL，加入10 μL內標(內標原液用75%乙腈稀釋5倍，成待加的內標液)。渦旋10秒，置于200 μL內襯管中，待測。

(3)色譜條件。色譜柱：Waters UPLC BEH Amide(1.7 μm, 2.1 mm*100 mm)；流動相：A相為乙腈(含0.1%甲酸，10 mM乙酸銨)和B相為水(0.1%甲酸，10 mM乙酸銨)；洗脫程序見表1。流速：0.3 mL/min；進樣量為1 μL；柱溫：40℃。

表1 樣本洗脫程序

4. 質譜條件：質譜分析采用裝備了熱電噴霧離子源的四極桿軌道離子阱質譜儀(ThermoFisher Scientific Q ExactiveTM)。正離子離子源電壓為3.7 kv。毛細管加熱溫度320 ℃。鞘氣壓力30 psi，輔助氣壓力10 psi。容積加熱蒸發溫度300 ℃。鞘氣和輔助氣均為氮氣。碰撞氣為氮氣，壓力為1.5 mTorr。一級全掃描參數為：分辨率70 000，自動增益控制目標為1 × 106，最大隔離時間50 ms，質荷比(m/z)掃描范圍50～1 500。液質系統由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件控制，數據采集由該軟件操作。

5. 樣本分析質控：為了評價樣本分析過程中儀器系統的穩定性和重復性，應用質控樣本(quality control，QC)和內標監測整個分析過程。QC樣本為所有樣本等體積混合得到，前處理方法同真實樣品。分析過程中，先采用5個空白樣本平衡色譜柱，再用3個質控樣本平衡柱條件；繼而每間隔6～8個樣本插入1個質控樣本，監測整個液質系統的穩定性和重復性。計算質控樣本中提取的代謝特征的變異系數值，變異系數超過30%的代謝特征被刪除。

6. 非靶向代謝組學數據處理：將采集的原始數據，應用Progenesis QI軟件處理，包括原始數據導入、峰對齊、峰提取、歸一化等步驟，獲得保留時間、質荷比和峰強度的三維數據表格文件。色譜提取峰的時間為1至11 min，峰提取的強度限定為模式3。各種加合離子如加氫和加鈉等均去卷積到每一個離子特征。依據80%規則去除得到代謝物特征的零值[18]。應用statTarget基于QC信號進行隨機森林信號偏移校正(random forest signal correction，RFSC)方法[19]，對所有樣本的代謝特征進行校正。采用Simca(Umetrics，版本14.1)統計分析軟件，Pareto scaling數據標準化處理。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)用于比較兩胎兒代謝物的情況。根據PLS-DA模型計算得到變量權重值(variable importance for the projection，VIP)，以VIP>1為篩選標準，結合單變量統計分析Wilcoxon符號秩檢驗、變化倍數(fold change, FC)分析，篩選差異代謝物特征。使用R軟件繪制火山圖，散點圖繪制采用GraphpadPrism 8.3軟件完成。差異代謝物鑒定通過與HMDB、KEGG和mzCloud等數據庫(搜庫一級質譜和二級質譜誤差均為10 ppm)以及標準品的準確質量數、二級譜碎裂規律等比對確定。熱圖及代謝通路富集用MetaboAnalyst 5.0分析獲得。

結 果

一、母體和胎兒一般情況

按照納入和排除標準共篩選出雙胎生長不一致26例，孕婦平均年齡(33.2±4.6)歲，BMI平均為(22.1±2.7)kg/m2，均為初產婦，均通過ART妊娠，分娩平均孕周(36.4±1.6)周。小胎兒平均出生體重為(1 966.8±305.8)g，大胎兒為(2 837.4±410.2)g，兩者有統計學差異(P<0.001)，且小胎兒體重均低于同胎齡第10百分位數；雙胎性別組成：女/女 3例，男/男 8例，男/女 15例。

二、代謝組學分析結果

1.數據質量控制評價：樣本分析過程中，每隔6～8個樣本插入1個QC以及使用氨基酸同位素混合內標溶液監測液質系統的穩定性和重復性。氨基酸內標在校正后的相對標準差(relative standard deviation，RSD)為2.6%至10.5%，均低于20%，提示所有樣本分析過程中儀器信號穩定、重復性好。應用statTarget對QC樣本進行校正，圖1(a)計算所有QC樣品中檢測到的代謝物的RSD，校正后所有QC樣品代謝物的RSD均下降，RSD≤10%的代謝物數量增多(由53%提高到95%左右)，使得QC樣品在質控標準范圍內(RSD<30%)可重復檢測，見圖1 (b)。

圖1 (a)代謝物特征校正后RSD分布圖；(b)代謝物特征校正后RSD變化圖

2.雙胎生長不一致臍血代謝組學分析：采用PLS-DA模型的得分圖顯示兩組樣本分開趨勢明顯，提示生長不一致兩胎兒臍血代謝物具有差異，見圖2(a)。以VIP>1、P<0.05、FC>1.2或FC<0.83作為篩選條件，共篩選出318個差異代謝物，結果以火山圖呈現，見圖2(b)，紅色點代表與大胎兒相比，小胎兒臍血中有94個化合物上調，藍色點代表與大胎兒相比，小胎兒臍血中有224個化合物下調，灰色點代表無顯著差異的代謝物。經搜庫及標準品比對，最終鑒定出35個代謝物(表2)。對鑒定出的差異代謝物進一步做聚類分析，用熱圖呈現(圖3)，與大胎兒相比，有25個差異代謝物在小胎兒中表達下調，10個上調。

圖2 (a) PLS-DA得分圖，S代表雙胎生長不一致中體重較小胎兒，L代表體重較大胎兒；(b) 差異代謝物火山圖

圖3 差異代謝物聚類分析熱圖S代表雙胎生長不一致中體重較小胎兒，L代表體重較大胎兒

表2 雙胎生長不一致臍血差異代謝物

應用MetaboAnalyst 5.0對篩選到的差異代謝物進行代謝通路分析和富集分析，見圖4，圓圈越大，紅色越深，代表根據數據確定的代謝物對其相關的代謝途徑有重要影響，胎兒體重相關的差異代謝物主要與蛋氨酸代謝，精胺代謝，甜菜堿代謝、甘油磷脂等代謝通路有關。

圖4 (a)SPMDB數據庫富集分析；(b)通路分析

討 論

DCDA胎兒因起源于2個受精卵，所處母體環境相同，但在遺傳方面具有生長潛能的差異；然而遺傳學的差異可能并非導致生長不一致甚至一胎兒生長受限的主要原因。本研究中生長不一致組的小胎兒體重均低于同孕齡兒應有體重的第10百分位數，提示這一胎兒存在生長受限的情況。因此，本研究結果從代謝角度對FGR的發生機制具有借鑒意義。目前有關代謝組學在DCDA胎兒生長發育中的研究十分有限。本研究首次應用UPLC-MS非靶向代謝組學的分析方法對DCDA雙胎生長不一致臍血差異代謝物進行探索，發現生長受限兒與正常胎兒代謝輪廓存在差異，主要體現在氨基酸代謝、磷脂代謝等，盡管研究樣本不同，但所涉及代謝通路與本團隊前期應用氣相色譜技術在sFGR中的發現一致[20]，提示這些代謝通路對胎兒生長發育起重要作用。

氨基酸是胎兒發育和生長的重要前體，為蛋白質、核苷酸和神經遞質的生物合成提供來源。本研究發現蛋氨酸在生長受限兒中上調，此結果與在sIUGR[21]、單胎FGR[12]及體外實驗[14]中的結論一致。蛋氨酸在為人體提供甲基后生成同型半胱氨酸，多項研究報道高同型半胱氨酸血癥與胎兒生長受限有關[22-24]，高濃度的同型半胱氨酸可能會通過誘導過氧化氫和氧自由基的產生導致血管內皮細胞氧化損傷，絨毛血管數量減少，進而抑制胎盤血液灌注。高同型半胱氨酸水平可通過降低內皮細胞對精氨酸的轉運進而降低內皮細胞釋放一氧化氮(NO)[25-26]，而NO能夠抑制胎盤血管內皮素I及血栓素A2來增加血循環量，進而增加營養物質供給[27]。精氨酸作為NO的前體，本研究顯示其在生長受限兒中下調，推測可能在同型半胱氨酸的影響下，與胎盤內皮細胞對精氨酸的轉運能力下降相關。此外，同型半胱氨酸還可以通過調節平滑肌細胞增殖和遷移影響胎盤血管的結構和功能，導致不良妊娠結局[28]。

本研究還觀察到色氨酸的中間代謝產物犬尿酸在生長受限兒中低于正常胎兒，與Dunn[29]，Horgan[14]等人在合并有胎兒生長受限的胎盤組織中的發現一致。本研究發現色氨酸的另一個中間代謝物5-羥吲哚乙酸在生長受限兒臍血中下調，與子癇前期患者的血漿和尿液中濃度降低趨勢一致[30]；子癇前期與FGR均為胎盤源性疾病，胎盤病理改變類似。FGR的胎盤功能不全，母體轉運給胎兒的營養物質有限，不足以滿足胎兒(尤其是大腦)對營養物質的消耗需求。色氨酸作為人體中重要神經遞質5-羥色胺的前體，本研究顯示色氨酸兩條主要代謝途徑中的犬尿酸及5-羥吲哚乙酸在生長受限兒中均下調，提示胎兒可能存在色氨酸缺乏或相關酶活性異常的情況；以及與自閉癥關系密切相關的5-羥色胺合成障礙[31]，研究顯示FGR胎兒發生自閉行為及社會和社會心理功能減退風險更高[32]。

本研究發現膽堿和磷脂類代謝物在生長受限兒中下調。膽堿是體內一種重要有機堿，神經遞質乙酰膽堿和生物膜主要成分磷脂的前體，也可為各種甲基化反應提供甲基，在體內發揮重要作用。動物實驗顯示對胎盤功能受損的孕鼠補充日糧中膽堿，可增加胎鼠的體重[33]；細胞實驗則證實膽堿可減低滋養細胞促炎、促凋及抗血管生成因子的豐度[34]，因此推測膽堿在胎兒及胎盤的生長發育方面發揮積極的作用。然而，在人群的研究中，結論尚不統一。來自西班牙的兩項病例對照研究顯示，與適于胎齡兒相比，膽堿在合并有FGR的胎兒臍血中水平更低[35-36]，與本研究結果一致。來自日本和荷蘭[37-38]的研究則顯示臍血膽堿濃度與出生體重負相關。另有研究顯示臍血膽堿水平與胎兒體重并無關系[39-40]。不一致的結果可能與樣本量、檢測方法、人群構成或統計學方法有關，仍需更多的研究來確認。

對差異代謝物進行通路分析發現，代謝物主要影響半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甜菜堿代謝、磷脂代謝、精胺生物合成等，提示這些代謝通路紊亂可能參與了胎兒生長受限的發生發展。其中，甜菜堿代謝與蛋氨酸代謝都參與一碳代謝，一碳代謝是體內主要甲基供體的來源，表觀遺傳可通過DNA甲基化、組蛋白的修飾等對基因表達進行調控，從而影響胎兒生長。

本研究應用代謝組學的方法篩選與DCDA雙胎生長不一致有關的臍血差異代謝物，排除了外界因素和母體環境影響，有助于對FGR發生機制的理解。然而，研究尚存在不足之處：首先，本研究所采用的非靶向代謝組學技術僅為正離子模式，所獲代謝組信息不夠全面，無法覆蓋有機酸等負離子模式優先檢測的化合物，可能會遺漏對胎兒生長發育重要的小分子代謝物；其次，尚有部分脂質不能確定其具體代謝物名稱，需通過標準品進一步驗證。

目前尚不清楚雙胎生長不一致的發生機制與代謝物的關系，胎盤作為母體和胎兒進行物質交換的器官，對于營養物質的轉運起重要調控作用，弄清雙胎妊娠胎盤如何調控營養物質的轉運和分配將有利于探索生長不一致的發生機制，進而為臨床干預，優化妊娠結局提供更多依據。