基于生物信息學鑒定與子宮內膜癌免疫微環境相關的預后標記物

程盈盈 趙琪 魯錦志 易村犍

子宮內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一[1]。UCEC發病率居女性生殖系統惡性腫瘤首位，其發病率逐年上升，并呈年輕化態勢。以腫瘤免疫系統為治療靶點，被認為是抗腫瘤藥物研發的一個極具潛力的方向。目前針對UCEC免疫治療的抗PD-1帕姆單抗，經美國食品藥品監督管理局批準已上市[2]。本研究旨在通過生物信息學方法系統地評估UCEC的免疫環境和研究其免疫相關基因。

基于UCEC表達譜數據集評估各腫瘤浸潤免疫細胞(tumor infiltrating immune cells，TIICs)的相對比例，探究其與臨床特征之間的相關性。其次基于大量數據集，采用生物信息學方法證實UCEC免疫微環境的改變，鑒定影響微環境的核心基因并對該基因介導的作用通路進行富集分析。具體實驗設計流程圖見圖1。

圖1 實驗總體設計流程圖

資料與方法

1.資料來源：從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/cart)獲取UCEC患者的基因表達譜數據、基因突變數據和臨床數據。下載406例UCEC組織和19例正常子宮內膜組織的RNA-Seq FPKM數據，以及529例UCEC的SNV突變數據。這些數據包含患者的臨床信息，包括發病年齡、腫瘤病理組織學分級、生存狀態和以天為單位的生存時間。從GenCode平臺(http://www.gencodegenes.org/)中下載人類基因組注釋GTF文件。通過免疫學數據庫和分析網站(ImmPort; https://www.immport.org/shared/genelists)下載了2 498個與免疫相關的基因，該數據庫包含基于各種分子功能的17個免疫類別[3-4]。

2.基于CIBERSORT算法的腫瘤免疫細胞浸潤分析：使用R軟件CIBERSORT包(版本3.6.3)評估UCEC樣本中22種TIICs類型的相對表達水平，即：天然B細胞、記憶B細胞、漿細胞、CD8+T細胞、幼稚CD4+T細胞、CD4+靜息記憶T細胞、CD4+激活記憶T細胞、濾泡性輔助T細胞、調節性T細胞、γδT細胞、靜息自然殺傷細胞、天然殺傷細胞、單核細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、靜息樹突狀細胞、活化樹突狀細胞、靜息肥大細胞、活化肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞。通過CIBERSORT反卷積算法，將UCEC的mRNA矩陣數據與來自CIBERSORT平臺的22種TIICs特征矩陣數據進行比較，分別生成高、低免疫評分組的UCEC組織中的22種TIICs比例矩陣。

3.子宮內膜癌免疫微環境分析：通過ESTIMATE算法對TCGA隊列的mRNA矩陣數據進行腫瘤微環境評分[5,6]，包括基質細胞評分和免疫細胞評分，根據評分中位值水平將其分為高評分組和低評分組，繼而進行差異分析，使用R軟件limma包(版本3.8)Wilcox.Test方法分析數據，篩選符合標準的基因。

4.腫瘤突變負荷分析：使用Perl軟件(版本v5.30.0)計算每個樣本的腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)值，并將UCEC的mRNA矩陣數據按TMB中位值水平分為高TMB組和低TMB組，分析TMB值與生存率的關系。使用Wilcox.Test方法對高、低TMB組的基因進行差異分析，篩選滿足條件的基因。

5.獲取關鍵基因：首先對從腫瘤微環境評分分組和TMB分組所獲得的差異表達基因進行Venn分析(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集基因。然后，從ImmPort數據庫(https://www.immport.org/shared/genelists)[7]檢索免疫相關基因與上述交集基因再次行Venn分析，獲得與UCEC相關的候選基因。最后，基于TCGA隊列UCEC的臨床特征對篩選的基因進行單因素邏輯回歸分析[8]，篩出關鍵基因。推測該基因最可能作為UCEC進展中免疫相關的目標基因。

6.基于泛癌分析的靶基因驗證：在UCSCXena網站下載TCGA數據庫中33種主要的腫瘤轉錄組數據(FPKM)、突變數據(varscan)和臨床數據，使用perl軟件提取CXCL14表達矩陣用于下述分析。具體腫瘤見附件表S1。

提取TCGA中各腫瘤的臨床數據包括無進展間期生存率、生存狀態和生存時間，使用R軟件survival、survminer、forestplot包(版本3.6.3)將CXCL14表達矩陣與各樣本PFI生存數據合并，根據CXCL14表達量中位水平將樣本分為高、低兩組進行K-M分析獲得PFI生存曲線，最后基于Cox風險比例模型描述基因對生存的影響并繪制森林圖。

計算33種腫瘤體細胞突變樣本(n=10 114)的TMB值，并提取每個樣本(n=10 416)的微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)值，通過spearman方法對CXCL14表達量與TMB值和MSI值進行相關性檢驗，繪制TMB和MSI相關性雷達圖。計算33種腫瘤所有樣本的免疫微環境評分，并結合CXCL14在樣本中的表達量，檢驗CXCL14表達量與免疫微環境的相關性。

7.CXCL14基因富集分析(GSEA)：為研究篩選的關鍵基因潛在的分子機制，進行基因富集分析，包括KEGG分析和GO分析。設定GSEA軟件重復排列數為1000次，P<0.05。

結果

1. UCEC中的腫瘤免疫微環境：TCGA隊列中229例腫瘤樣本和8例正常樣本符合CIBERSORTP<0.05的篩選標準。UCEC組織中濾泡輔助T細胞(P=0.001)、調節T細胞(P<0.001)、M0巨噬細胞(P<0.001)、漿細胞(P=0.052)的比例與正常組織相比差異具有或臨界統計學意義,而相較于正常組織，幼稚B細胞(P=0.005)、CD4+靜息記憶T細胞(P=0.001)、γδT細胞(P<0.001)、單核細胞(P=0.01)、M2巨噬細胞(P=0.04)、靜息肥大細胞(P<0.001)在UCEC組織中低表達(圖2a)。結合患者的生存時間、生存狀態、病理組織學分級及年齡分析，發現調節T細胞(P=0.031)高豐度與患者生存率正相關，調節T細胞(P<0.001)、CD4+靜息記憶T細胞(P<0.001)高豐度與UCEC病理組織學分級負相關，靜息肥大細胞(P=0.015)豐度在年齡≤60歲患者組與年齡>60歲組中差異具有統計學意義，漿細胞(P=0.032)豐度與年齡的關系與靜息肥大細胞相反(圖2b、c、d、e)。此外，免疫微環境基因經差異分析獲得549個上調基因和1個下調基因。

圖2a TIICs在子宮內膜正常組織和癌組織中的分布和豐度差異

圖2b CD4+靜息記憶T細胞豐度與患者病理分級的相關性;圖2c 調節T細胞豐度與患者病理分級的相關性;圖2d 漿細胞豐度與患者年齡的相關性;圖2e 靜息肥大細胞豐度與患者年齡的相關性

2. UCEC腫瘤突變負荷：將UCEC的mRNA矩陣數據TMB值按中位值水平分為高TMB組(n=226)和低TMB組(n=165)，結合生存時間及病理組織學分級分析發現，高TMB值組生存率與低TMB值組相比差異具有統計學意義(P=0.023)，且高TMB值與UCEC患者病理組織學分級呈正相關(P<0.001,圖3)。此外，對UCEC表達譜基因高、低TMB值組進行基因差異分析獲得326個差異基因。

圖3 TMB值與患者病理分級的相關性結果示意圖

3. UCEC免疫微環境中與預后相關的關鍵基因：對腫瘤免疫微環境分組獲得的392個差異基因和TMB值分組獲得的326個差異基因以及在ImmPort數據庫檢索到的2498個免疫相關基因進行Venn分析獲得9個重疊基因(圖4a)。最后，基于上述9個基因表達量的差異篩選出與免疫微環境關系最密切的基因CXCL14，CXCL14的表達量在腫瘤樣本中明顯高于正常樣本(P<0.001)(圖4b)。結合406例UCEC樣本的臨床特征分析發現，CXCL14在年齡≤60歲組中表達量顯著高于年齡>60歲者,其低表達與病理組織學分級正相關(P<0.05,圖4c、d)。

圖4a 基于生物信息學網站獲得免疫微環境、TMB和免疫相關基因的Venn圖;圖4b CXCL14在正常樣本和腫瘤樣本中表達量示意圖;圖4c CXCL14在406例腫瘤樣本中的表達量與年齡的相關性;圖4d CXCL14在406例腫瘤樣本中的表達量與病理分級的相關性;圖4e CXCL14的表達與患者疾病特異生存率的關系；圖4f CXCL14的表達與患者無進展間期生存率的關系。

在UCEC中CXCL14的表達量與疾病特異生存率(disease specific survival,DSS)和無進展間期生存率(progression free interval，PFI)具有相關性。基于R語言limma包，采用Kaplan-Meier法獲得了DSS、PFI生存曲線，發現CXCL14低表達患者的疾病特異生存率明顯低于高表達患者(P=0.028，圖4e)，并且CXCL14高表達患者無進展間期生存率顯著高于低表達者(P=0.042,圖4f)。

4. CXCL14在33種腫瘤中的表達：對33種腫瘤共11 057例樣本(T=10 327，N=730)的CXCL14表達矩陣進行差異分析，發現CXCL14在子宮內膜癌、宮頸鱗癌等16種腫瘤中的正常組織和癌組織之間的差異表達有意義(P=0.001 "***" ，P=0.01"**" ，P=0.05"*"，P=1" ",圖5a)。采用COX分析方法探究CXCL14在腫瘤中的表達量與總生存時間的相關性，結果表明CXCL14在UCEC等12種腫瘤中的表達與患者總生存時間相關，且CXCL14為低風險基因(圖5b)。

圖5a CXCL14在33種腫瘤中的正常組織和癌組織之間的表達差異;圖5b CXCL14在腫瘤中的表達量與總生存時間的相關性;圖5c 33種腫瘤中CXCL14的表達量與TMB相關性示意圖;圖5d 33種腫瘤中CXCL14的表達量與MSI相關性示意圖

包括UCEC在內的17種腫瘤的CXCL14表達量與TMB值具有相關性；包括UCEC在內的12種腫瘤的MSI值與CXCL14的表達負相關(P=0.001 "***" ，P=0.01"**" ，P=0.05"*"，P=1" ",圖5c、d)。

5.CXCL14富集生物通路：CXCL14基因集低表達富集203例，高表達富集203例。由KEGG分析可知，CXCL14低表達富集會抑制B細胞受體信號通路、錯配修復、DNA復制、泛素介導的蛋白水解作用等通路(圖6)。由富集分析可知，CXCL14在UCEC中是一個保護性基因，其下調會抑制體內正常的免疫反應，從而使癌細胞逃避免疫過程。

圖6 CXCL14在UCEC有關通路中的富集示意圖

討論

研究表明UCEC間質中有大量免疫細胞浸潤[9-10]，免疫細胞浸潤被認為在多種惡性腫瘤的發生發展起著重要作用[5,11]，目前免疫治療在抗腫瘤領域取得了巨大進展。本研究發現，UCEC中浸潤的免疫細胞比例高于正常組織，部分免疫細胞浸潤豐度與患者預后相關，針對這些免疫細胞的靶向治療，有望改善患者預后。

近年來免疫系統療法如免疫檢查點抑制劑等在抗腫瘤領域效果顯著。研究表明腫瘤基因高度突變可誘導產生大量新抗原，從而激活免疫細胞，導致機體產生抑制腫瘤的免疫反應[12]。MSI與腫瘤免疫治療的療效關系密切[13]，多項研究已證實TMB是預估腫瘤免疫治療療效的新興生物標志物[14]。本研究發現UCEC高TMB組生存率明顯高于低TMB組，而TMB值越高病理分級越高，我們推測高級別UCEC患者有望通過免疫治療獲益。

CXCL14是一種高度保守的、穩態的趨化因子，負責免疫細胞的募集和成熟，可作為抗微生物和抗腫瘤因子發揮作用[15]。CXCL14在宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌和頭頸癌等癌癥中經常出現失調，其破壞被證明限制了關鍵的抗腫瘤免疫調節[16]。有研究證實，CXCL14通過抑制腫瘤血管的生成起到抑制腫瘤發展的作用[17]。本研究發現CXCL14在UCEC中的表達量高于正常組織，且CXCL14的表達與病理分級、患者生存率及年齡相關，推測CXCL14表達失調可能與UCEC患者不良預后有關。這提示CXCL14不僅是判斷UCEC預后的重要指標，而且是一個新的潛在靶標。在不同類型腫瘤中CXCL14的表達不一致,如在腎癌、肺癌、頭頸癌、宮頸癌等組織中幾乎不表達或低表達，而在部分前列腺癌和乳腺癌中表達水平卻很高[18]，這與上述泛癌分析結果一致，CXCL14在腫瘤中的表達可能受多種因素影響。

本研究通過探究UCEC相關免疫細胞浸潤狀態，發現其在UCEC進展中與免疫過程具有強烈的相關性，為研究UCEC免疫機制提供了理論支持。結合TCGA和ImmPort數據庫篩選出參與UCEC進展的相關基因，CXCL14是其中之一。CXCL14在腫瘤中低表達會促進原發性免疫缺陷、癌癥發展等，其可作為UCEC有效的免疫相關預后標志物。本研究實驗數據來源于TCGA數據庫，有待進一步實驗來證實。