基于三層高精度滴頭制備一種胃腸道耐受型益生菌菌珠的研究

孫文軒

（上海華寶生物科技有限公司 上海 201821）

益生菌又稱為益生素，具有多種對人體健康有益的生理功能，主要包括抑制致病菌定植、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強腸道上皮屏障功能、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)腸道神經(jīng)系統(tǒng)的功能［1］。益生菌可以通過食用含有益生菌的相關(guān)保健品和益生菌發(fā)酵類產(chǎn)品獲得［2］。據(jù)相關(guān)規(guī)定，在益生菌保健品中的活菌數(shù)最少要達到1×106CFU/mL［3］，而益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用必須滿足有足夠數(shù)量活的益生菌在腸道內(nèi)定植這一前提條件［4］。但是，當(dāng)口服益生菌經(jīng)過消化道時，會在胃酸、膽鹽、消化酶等的影響下失活，導(dǎo)致益生菌在人體的活菌數(shù)量遠低于在人體發(fā)揮生理作用的最小理論值［5］。大多數(shù)腸道益生菌為厭氧型微生物，儲存過程中與氧氣和水分接觸也其活性下降的原因之一。

益生菌微膠囊化是將細菌包埋在腸溶性壁材中，這些壁材在會腸道環(huán)境中降解，但是在胃部環(huán)境中能保持穩(wěn)定［6］，這既增強益生菌對胃部逆環(huán)境的抵抗能力，也可以控制這些細胞在腸道中釋放，顯著提高益生菌到達腸道靶位點的存活率。微囊化包埋還可以給益生菌提供一個厭氧環(huán)境，隔絕氧氣等外界不利因素，提高益生菌在貯存過程中的存活率。

常見的包埋方法有單層包埋法、雙層包埋法及三層包埋法［7］。葛得龍等人［8］以海藻酸鈉和N，O-殼聚糖為壁材，采用靜電液滴法，制備海藻酸鈉-羧甲基殼聚糖微膠囊包埋副干酪乳桿菌與游離的副干酪乳桿菌，微膠囊的胃腸消化的耐受性和耐儲藏性顯著提高。相對于未包埋的菌珠來說，單層包埋法雖然可以顯著提高菌體的消化存活率和儲存穩(wěn)定性，但是也存在干燥損失及包埋率低等不足。雙層包埋是針對單層包埋的不足進行再設(shè)計，在微膠囊中加入凍干保護劑或益生元，以及在微囊表面進行包衣，增強對菌種的保護力度［9］。張瑞采用內(nèi)源乳化法包埋鼠李糖桿菌，制備了“果膠+明膠/乳清分離蛋白雙層微膠囊”，包封率高達89.3%。雙層包埋雖然在一定程度上避免了菌的泄漏，提高干燥過程中的菌活，但是菌粉往往在未達到腸道就已經(jīng)被分解失活，無法實現(xiàn)微囊在腸道的控釋。三層包埋比雙層包埋有更強的耐胃酸性和堅固性。柳永［10］等人采用w-o-w 的三層包埋方式對干酪乳桿菌進行包埋，第一層為包含卡拉膠和益生元的水凝膠，第二層為棕櫚油，第三層為海藻酸鈉、碳酸鈣及黃原膠。該方法制備的益生菌微膠囊具有良好的熱穩(wěn)定性及儲藏穩(wěn)定性，并且實現(xiàn)了益生菌的定性釋放，但是由于三層包埋工藝的復(fù)雜性及包埋層厚度難以控制，導(dǎo)致其難以實現(xiàn)工業(yè)化。

滴丸技術(shù)可通過滴頭擠壓膠液將藥物包裹起來形成微膠囊，常用于脂溶性藥物或益生菌等的包埋，且具有裝量精確、恒定、可操作性強等優(yōu)點［11-12］。利用高精度多重同心圓滴丸技術(shù)，可以輕松實現(xiàn)三層包埋技術(shù)，制備三層包埋的益生菌菌珠。

目前，市面上大部分益生菌制劑及公開的益生菌微囊包埋技術(shù)始終有一個共性難題還未解決，就是產(chǎn)品在加工、儲藏和使用過程中活菌數(shù)下降和活性降低的問題，并且缺乏對益生菌胃腸道靶向遞送的關(guān)注［13］。益生菌微囊化包埋作為提高益生菌儲存穩(wěn)定性和胃酸耐受性及腸道靶向釋放細胞的方法，越來越受到人們的重視，成為當(dāng)今研究的熱門課題。

本研究擬采用同心滴丸技術(shù)，以復(fù)合凝膠為壁材，以固態(tài)脂質(zhì)為保護層，包裹包含益生菌的油性懸浮液，制備一種可以抵抗胃腸消化和耐存儲的益生菌菌珠，可以解決益生菌貯存和服用過程中活性、數(shù)量及效價損失嚴(yán)重的問題，并實現(xiàn)微膠囊的靶向釋放，具有廣泛的應(yīng)用價值。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌購自中國金華，葵花籽購自當(dāng)?shù)爻校瑔巍㈦p甘油脂肪酸酯，棕櫚油購自益海嘉里，MRS瓊脂培養(yǎng)基、明膠、海藻酸鈉購自阿拉丁，胃蛋白酶、脂肪酶、胰酶、膽鹽購自Sigma，濃鹽酸、氯化鈣、氯化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

高精度同心滴丸機（滴頭自制）、厭氧培養(yǎng)箱（YQX-T）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（ZDX-35BI）、超凈工作臺（SW-CJ-1D）、恒溫振蕩器（SHZ-82）、渦旋振蕩器（XH-C）、數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋（HCJ-4A）、電子分析天平（AL204）。

2 實驗方法

2.1 益生菌珠的制備

2.1.1 高精度同心滴丸機

采用高精度同心滴丸機制備益生菌珠，滴丸機基本結(jié)構(gòu)如圖1 所示，其中，1、2、3 分別連接著盛放含有益生菌的液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)及膠液的儲料罐，為液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)、膠液的入口，由物料泵將各相物料泵入滴頭；結(jié)構(gòu)4為三相同心滴頭，由內(nèi)到外分別是液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)和膠液；結(jié)構(gòu)5 為冷卻循環(huán)系統(tǒng)，菌珠在該段冷卻成型；結(jié)構(gòu)6為冷卻液保護套。

圖1 三層同心滴丸設(shè)備滴頭示意圖

2.1.2 液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)及膠皮相的制備

先按比例稱取適量明膠、海藻酸鈉溶于滅菌水中，65℃水浴加熱攪拌3h至完全溶解后保溫除去氣泡，制備成膠液待用。將單、雙甘油脂肪酸酯作為分散劑按比例加入葵花籽油中，于60℃水浴下加熱攪拌30min至完全溶解，冷卻至37℃左右后加入1%（w/w）的副干酪乳桿菌凍干菌粉，經(jīng)分散機5000rpm分散3min，制備成均勻的液態(tài)菌油相保溫備用。將44℃棕櫚油在50℃水浴中攪拌溶解作為固態(tài)脂質(zhì)相50℃保溫待用。

2.1.3 益生菌珠的制備

將液態(tài)菌油、固態(tài)油相和膠皮相分別置于高精度同心滴丸設(shè)備的儲料罐中，調(diào)節(jié)機械參數(shù)：膠液罐溫度為65～70℃，固態(tài)脂質(zhì)罐溫度為45～50℃，液態(tài)菌油罐溫度30～35℃，滴頭溫度為50～60℃，制冷溫度為6～7℃，液態(tài)菌油泵、固態(tài)脂質(zhì)泵和膠液泵的轉(zhuǎn)速比為5：4：2。三相物料經(jīng)過如圖1 所示的三層同心圓滴頭流出后，由脈沖裝置快速切割成益生菌珠，再通過6～7℃冷卻循環(huán)系統(tǒng)對菌珠進一步冷卻和定型，將成型的益生菌珠置于氯化鈣溶液中交聯(lián)30min后過濾，用蒸餾水清洗3次除去多余的鈣離子，即得到濕膠囊。將濕膠囊置于溫度為25℃、相對濕度為40%的恒溫恒濕環(huán)境下進行干燥，即得三層包埋結(jié)構(gòu)的益生菌珠，從內(nèi)到外依次是液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)保護層和膠皮外殼。

按照上述方法，分別制備分散有副干酪乳桿菌的液態(tài)油相的三層包埋益生菌珠和不含固態(tài)脂質(zhì)保護層的雙層包埋益生菌珠。

2.2 益生菌珠尺寸的測量

觀察干燥微膠囊的形態(tài)并拍照，通過游標(biāo)卡尺測量100 個益生菌菌珠來評估微膠囊的平均尺寸、固態(tài)脂質(zhì)保護殼層厚度和膠皮層厚度［14］。首先，菌珠測量外徑；然后，小心剝?nèi)ツz皮外衣，測量固態(tài)脂質(zhì)體保護殼層包裹的菌珠的直徑；最后，將剩下的部分平均切開，稱量其中液態(tài)油相的質(zhì)量，根據(jù)其密度，計算出芯液的體積及半徑。因此，固體脂質(zhì)體保護殼層厚度和膠皮膜層厚度的計算公式如下：

式中，Tg為外層膠皮相的厚度（mm）；Tsl為固態(tài)脂質(zhì)保護殼的厚度（mm）；dext為益生菌菌珠的外徑（mm）；d為固態(tài)脂質(zhì)保護殼包裹的菌珠的外徑（mm）；dint為益生菌菌珠的內(nèi)徑，即液態(tài)油相的直徑（mm）。

2.3 益生菌在加工過程中穩(wěn)定性

在菌珠制備過程中，高溫及水分等不良因素會導(dǎo)致益生菌失活。為了探究菌珠在加工過程中對益生菌的保護作用，分別從三層包埋和雙層包埋菌珠的液態(tài)油相及未經(jīng)過滴頭的分散有副干酪乳桿菌的液態(tài)油相中取樣，用含有5%吐溫-80 的生理鹽水連續(xù)稀釋，接種于MRS 瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下厭氧培養(yǎng)48h 計算菌落總數(shù)。

2.4 益生菌珠在體外模擬消化中的穩(wěn)定性

益生菌從口腔攝入后，經(jīng)過胃及小腸環(huán)境后在結(jié)腸定植并發(fā)揮作用。為了探究益生菌珠對模擬胃液及腸液消化的耐受性，本研究采用Minekus［15］的消化模型稍加改進進行體外模擬消化。

2.4.1 消化液的配置

模擬胃部消化液（SGF）的配置：取0.7mL 濃鹽酸，200mg 氯化鈉溶解并定溶于100m 蒸餾水中，并提前45min加入3.2mg/mL胃蛋白酶，于37℃加熱攪拌溶解。

模擬小腸消化（SIF）的配置：取10.94g 氯化鈉，1.835g一水合氯化鈣，溶解并定溶于100mL蒸餾水中。

2.4.2 模擬體外消化

分別取三層包埋、雙層包埋及液態(tài)油相菌液1g加入到15mL 模擬胃部消化液中，調(diào)節(jié)pH 值至2，在37℃、100r/min的條件下水浴震蕩消化2h后，取出胃部消化液，加入1.5mL 模擬小腸消化液、3.5mL 膽鹽（含189mg膽鹽，用5mM PBS緩沖溶液配置），調(diào)節(jié)pH值至7，加入2.5mL 脂肪酶（含60mg 脂肪酶，用5mM PBS 緩沖溶液配置）、2.5mL 胰酶（含60mg 胰酶，用5mM PBS緩沖溶液配置），在37℃、100r/min條件下消化2h，由于脂肪被脂肪酶水解成脂肪酸，而導(dǎo)致消化體系pH值下降，因此，每隔30min將體系pH值調(diào)節(jié)至7.0，分別從胃消化和腸消化結(jié)束后的益生菌菌珠中取樣，進行梯度稀釋后，經(jīng)過MRS 瓊脂培養(yǎng)基在37℃厭氧培養(yǎng)48h 計算菌落總數(shù)，并對每個消化階段結(jié)束后的益生菌菌珠的形貌進行觀察。

2.5 益生菌珠的儲藏穩(wěn)定性

分別將三層包埋和不含固態(tài)脂質(zhì)保護層的雙層包埋菌珠置于4℃及室溫條件下儲存12 個月，每隔一段時間取樣培養(yǎng)，計算益生菌的活菌數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗重復(fù)3次，各組數(shù)據(jù)用SPSS 25軟件進行分析，以P＜0.05 作為差異作為著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，圖表用origin繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 益生菌珠的外觀

如圖2所示，菌珠為大小均勻的白色圓球，其中包含三層保護結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外分別是：負(fù)載益生菌的液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)體保護層及外層膠皮。固態(tài)脂質(zhì)及明膠和海藻酸鈉的雙網(wǎng)絡(luò)凝膠膠皮共同支撐起菌珠的球形結(jié)構(gòu)。菌珠的直徑尺寸如表1 所示，含有固態(tài)脂質(zhì)保護層的三層包埋菌珠的平均直徑和液態(tài)油相芯液的平均直徑分別為（4.37±0.12）mm 和（2.63±0.09）mm 膠皮層、固態(tài)脂質(zhì)保護層的平均厚度分別為0.2mm 和0.66mm。不含固態(tài)脂質(zhì)保護層的雙層包埋益生菌珠的平均直徑和液態(tài)油相內(nèi)芯的平均直徑分別為（3.05±0.07）mm 和（2.57±0.06）mm，膠皮層的平均厚度為0.24mm，該菌珠尺寸適合吞服使用。

圖2 益生菌珠的外觀結(jié)構(gòu)

表1 益生菌珠的尺寸

3.2 益生菌在加工過程中的穩(wěn)定性

測定干燥后菌珠的益生菌活性，結(jié)果如圖3所示，包含固態(tài)脂質(zhì)保護層的三層包埋菌珠的菌活顯著高于不含固態(tài)脂質(zhì)保護層的雙層包埋菌珠，分別為（8.97±0.01）lgCFU/g 和（8.73±0.02）lgCFU/g，菌體存活率為（87.48±2.41）%和（50.39±2.86）%。菌珠制備過程中，液態(tài)油相芯液的溫度為30～37℃，固態(tài)脂質(zhì)保護層的溫度為45～50℃，外層膠皮的溫度為60～75℃。液態(tài)油相中的副干酪乳桿菌在與膠皮層直接接觸時因高溫而失活，在液態(tài)油相芯液與高溫膠皮相之間釋放較低溫的固態(tài)脂質(zhì)作為保護層，避免益生菌與膠皮直接接觸，顯著提高了益生菌的菌活。同時，固態(tài)脂質(zhì)保護層還可以阻擋菌珠浸泡氯化鈣溶液及干燥過程中水分進入菌珠內(nèi)部，降低因水分導(dǎo)致的益生菌失活。

圖3 液態(tài)菌油和益生菌珠在干燥后活菌數(shù)

3.3 益生菌珠在體外模擬消化中的穩(wěn)定性

將負(fù)載有副干酪乳桿菌菌粉的液態(tài)油相芯液及菌珠經(jīng)過模擬胃液和模擬腸液的連續(xù)處理，測定它們在經(jīng)過模擬胃液和模擬腸液消化后的活菌數(shù)和存活率，結(jié)果如圖4和表2所示。經(jīng)過模擬胃液消化后，未經(jīng)包埋的液態(tài)菌油、三層包埋菌珠及雙層包埋菌珠的菌活分別降低為（7.26±0.08）lgCFU/g、（8.89±0.01）lgCFU/g和（8.51±0.03）lgCFU/g。副干酪乳桿菌的對環(huán)境敏感，液態(tài)菌油直接分散在pH=2的模擬消化液中，副干酪乳桿菌在胃酸和胃白酶的作用下基大量死亡［16］，其菌體存活率顯著低于兩組菌珠樣品。對比兩組菌珠經(jīng)過胃消化液后的菌體存活率發(fā)現(xiàn)，三層包埋菌珠在胃酸環(huán)境中的穩(wěn)定性顯著高于雙層包埋菌珠，存活率分別為（82.31±1.42）%和（60.26±4.04）%。菌珠在胃液中發(fā)生溶脹，膠皮表面產(chǎn)生小孔，胃酸滲透凝膠層，三層包埋菌珠由于固態(tài)脂質(zhì)隔絕了環(huán)境中的胃酸，為芯液中的益生菌提供了保護作用。

圖4 菌油和菌珠在模擬消化過程中的菌活

表2 益生菌在模擬消化過程中的存活率

模擬腸消化過程中，在消化酶的作用下，菌珠的膠皮被酶解，由于沒有固態(tài)脂質(zhì)的支撐，液態(tài)菌油直接分散在消化液中，副干酪乳桿菌在消化酶和膽鹽的作用下活性降低，小腸消化2h后菌活為（8.18±0.04）lgCFU/g，菌存活率為（28.12±2.43）%。與此相比，三層包埋菌珠的膠皮和部分固態(tài)脂質(zhì)保護層被酶解，但是在固態(tài)脂質(zhì)的支撐下還能保持球形包埋結(jié)構(gòu)，模擬腸消化結(jié)束后菌活為（8.68±0.03）lgCFU/g，菌存活率為（51.58±4.12）%，顯著提高了益生菌在模擬腸消化過程中的穩(wěn)定性。相比于采用凝膠直接包埋液態(tài)菌油的雙層包埋技術(shù)，在液態(tài)菌油和膠皮之間增加一層固態(tài)脂質(zhì)，可以保護液態(tài)油相中的益生菌抵抗部分部分胃酸、消化酶及膽鹽的損害，提高益生菌的在消化過程中的存活率。而且在固態(tài)脂質(zhì)中添加腸道粘附因子和益生元，還可以促進益生菌在腸道的粘附和定植，實現(xiàn)益生菌的靶向釋放和結(jié)腸定植。

3.4 益生菌珠的儲藏穩(wěn)定性

將個菌珠分別置于4℃和常溫下儲藏12 個月，每隔3 個月測定菌珠的活菌數(shù)，結(jié)果如圖5 所示，菌體存活率如表3 所示。無論是在4℃，還是在室溫條件下，隨著儲藏時間的延長，兩種菌珠的菌活均顯著下降，但含有固體脂質(zhì)保護層的三層包埋菌珠的菌活普遍高于雙層包埋菌珠，在4℃儲藏12 個月后，菌活高達（8.78±0.02）lgCFU/g，室溫下儲藏12月后，菌活仍有（8.69±0.02）lgCFU/g。而僅由水凝膠包埋液態(tài)菌油的雙層包埋在4℃和室溫下儲藏12 個月后，菌活分別從（8.67±0.04）lgCFU/g 降 低 為（8.06±0.13）lgCFU/g 和（7.84±0.01）lgCFU/g，儲藏穩(wěn)定性顯著低于三層包埋的菌珠。因為液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)層及凝膠層的協(xié)同屏障作用，可以將益生菌與“水分”“氧氣”等外界不良環(huán)境因素隔絕開，顯著提高益生菌的儲藏穩(wěn)定性［17］。4℃儲藏的菌珠菌活普遍高于室溫下儲藏的菌活，低溫環(huán)境更有利于菌珠的儲藏。

表3 菌珠在儲藏過程中的菌體存活率

圖5 益生菌珠的儲藏穩(wěn)定性

4 結(jié)語

本研究采用高精度同心滴丸技術(shù)包埋副干酪乳桿菌，制備了一種o-o-w三層包埋的益生菌珠，菌珠從里到外分別是液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)體保護層和膠皮相，干燥菌珠的平均直徑為（4.37±0.12）mm，膠皮層的平均厚度為0.20mm，固體脂質(zhì)體保護層的厚度0.66mm，液態(tài)油相內(nèi)芯的平均直徑為（2.63±0.09）mm，其活菌數(shù)為（8.97±0.01）lgCFU/g，顯著高于o-w 雙層包埋菌珠。在傳統(tǒng)的o-w 雙層包埋菌珠中增加固態(tài)脂質(zhì)層，可以顯著降低由于菌珠制備過程中高溫和水分導(dǎo)致的益生菌失活，并且提高益生菌在胃腸道消化及儲藏過程中的穩(wěn)定性，為解決益生菌不耐胃酸和儲藏穩(wěn)定性差的問題提供了一個新思路。