甘草粉末粒度分布與其品質的相關性研究△

李錟，王升，田壯，尚興樸，李鵬英，呂朝耕，康傳志，萬修福，周利，郭蘭萍，王瑞杉*

1.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.中國中藥有限公司，北京 102600

甘草始載于《神農本草經》，列為上品，為豆科多年生植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，味甘，性平[1]，可補脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳，能夠調和諸藥，故有“國老”之稱。甘草酸和甘草苷是甘草的主要活性成分，具有鎮(zhèn)咳、消炎、解毒、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、調血脂和抗動脈粥樣硬化等藥理作用[2-3]。另外，甘草具有較強的抗旱、抗寒、耐鹽堿和防風固沙能力[4]，還廣泛應用于食品、飲料和化妝品等行業(yè)[5-6]。隨著國內外市場對甘草資源需求量的增加，野生資源迅速枯竭，目前市場上甘草藥材多為人工種植，由于地理環(huán)境的差異、種植不規(guī)范導致其質量良莠不齊[7]。

傳統(tǒng)觀點認為甘草以粉性為佳[8-9]，《本草品匯精要》稱：“根堅實有而肥者為好”[10]。《本草從新》記載：“大而結者良，出大同，名粉草（彈之有粉出），細者名統(tǒng)草”[11]。甘草粉性通常量化為淀粉含量或顯微鏡下淀粉粒數目，認為淀粉含量越多則甘草品質越好。但關于甘草粉性與淀粉含量、淀粉粒特征的研究表明，甘草淀粉含量與有效成分含量往往呈負相關[12-13]。其中Liu 等[13]研究發(fā)現(xiàn)甘草的粉性與甘草酸、甘草苷的含量，直鏈淀粉與總淀粉的比例及粒徑超過5 μm 的淀粉粒數量呈正相關，與總淀粉含量呈負相關。以“粉性”等傳統(tǒng)性狀鑒別評價甘草品質受到了挑戰(zhàn)，亟需更為準確的方法詮釋甘草粉性的量化標準和科學內涵。

近年來，激光衍射已經成為普遍認可的粉體表征技術，在食品、醫(yī)藥、化工、農業(yè)等領域得到廣泛應用。激光衍射粒度分析儀具有測量速度快、測量過程自動化程度高、衍射譜僅與顆粒大小有關等優(yōu)勢[14]，尤其重要的是激光衍射可以通過表征粒度分布鑒別不同樣品，并解釋樣品的獨特品質。例如，不同種類咖啡產品研磨后咖啡粉粒度分布情況明顯不同，精細咖啡粉在沖泡時可以產生獨特的苦味，而隨著咖啡粉粒徑的增加，產品的口感則逐漸順滑[15]。中藥材活性成分在不同組織中含量存在差異，會導致其粉體粒徑大小、形狀、表面特征等顆粒學性質不完全相同，如易碎組織在粉碎過程中易形成小顆粒，不易粉碎的組織則在大顆粒粉末中較多[16]。因此，可將激光衍射粒度分布檢測技術用于鑒別具有組織特性差異的藥材，也可將粒度分布與藥效成分含量進行關聯(lián)，以期來量化對藥材品質的評價。

本研究以甘草為材料，建立檢測甘草粉末粒度的方法。利用粉末粒度分布表征甘草粉體特征，同時以甘草酸和甘草苷類化合物的含量表征不同產地甘草的品質優(yōu)劣，通過分析甘草粉末粒度分布與甘草有效成分含量之間的相關性，為快速、準確評價甘草品質特征提供理論指導，同時也為粒度分析儀在中藥領域的應用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

實驗樣品收集于新疆、內蒙古、甘肅3 個省（自治區(qū)）21 個產地（縣/市）藥材收購商/合作社，共40份，包括10個甲等、18個乙等、12個丙等，均為秋季采收，3年生樣品，經中國中醫(yī)科學院中藥資源中心王升副研究員鑒定為豆科植物烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。具體信息見表1。

表1 甘草樣品信息

對照品皂苷類化合物22-β-乙酰氧基-甘草酸（1，批號：J24GS147479）、甘草皂苷G2（2，批號：Z29J11H119881）、甘草酸（3，批號：Y30J11Q119843）和黃酮苷類化合物甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷（4，批號：G09J11Y111183）、芹糖甘草苷（5，批號：Z29J11H117017）、維采寧（6，批號：J24GS158679）、甘草苷（7，批號：Z29J11H107681）、黃甘草苷（8，批號：Y30J11Q617243）、芒柄花苷（9，批號：G09J11Y517183）、芹糖異甘草苷（10，批號：J24GS532509）、異甘草苷（11，批號：Y30J11Q117543）均購自云南西力生物技術股份有限公司，純度均大于95%；實驗用乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純；水為實驗室自制超純水。

1.2 儀器

Mastersizer 2000 型激光衍射粒度分析儀（馬爾文帕納科公司）；ACQUITY UPLC H-CLASS 系統(tǒng)，ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），VanGuard預柱（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）均購于美國Waters 公司；FW177 型中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；ML104T/02型電子天平（梅特勒-托利多公司）；Pacific TⅡ型超純水系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；SB-800 DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

甘草樣品干燥，稱取樣品約250 g，于中藥粉碎機粉碎2次、每次1 min，過二號篩[（850±29）μm]。

2.2 甘草粉末粒度檢測

按照儀器默認的土壤設定參數，藍光折射率設為1.336，殘差均小于0.5%，遮光度為1.5%～4.5%。將燒杯中加滿蒸餾水，超聲3 min，排除儀器氣泡，防止影響測量結果。將甘草粉末加入測量燒杯中稀釋至粒度儀測量所需的體積占比（7%～15%），待溶液穩(wěn)定且沒有粉末沉淀時，邊超聲邊進樣測量。

2.3 有效成分含量測定

含量測定參考文獻[17]方法，根據化合物類型（甘草酸類和甘草苷類）分別進行檢測。該方法在包括回收率、重復性及穩(wěn)定性在內的方法學驗證實驗中均表現(xiàn)出良好的可靠性。

2.3.1 甘草酸類3 種皂苷類化合物（1～3）的檢測方法 稱取甘草粉末200 mg于50%甲醇10 mL，25 ℃超聲提取30 min。流動相為乙腈-甲醇（4∶1，A）和0.1%甲酸水溶液（B），洗脫梯度（0～1.0 min，30%A；1.0～8.0 min，30%～40%A；8.0～16.0 min，40%～52%A；16.0～16.2 min，52%～100%A；16.2～17.6 min，100%A）；流速0.40mL·min-1，柱溫55 ℃，進樣量1 μL，樣品盤溫度15 ℃，全波長掃描190～600 nm，定量分析檢測波長254 nm。

對照品溶液的配制：化合物1、2 溶于50%甲醇，化合物3 溶于適量75%甲醇，配制質量濃度為5 mg·mL-1的儲存液。用50%甲醇將化合物1和2稀釋至0.5 mg·mL-1，化合物3 稀釋至2.5 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80 和160 的稀釋因子進行稀釋，以峰面積為Y，各個化合物進樣質量（g）為X，獲得標準曲線。

2.3.2 甘草苷類8種黃酮苷類化合物（4～11）的檢測方法 按2.3.1項下方法提取樣品。流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1.0 min，10%～15%A；1.0～6.0 min，15%～25%A；6.0～8.5 min，25%～30%A；8.5～10.0 min，30%～32%A）；流速為0.30 mL·min-1，化合物10 和11 檢測波長365 nm，化合物4～9檢測波長270 nm。

對照品溶液的配制：化合物4～11均溶于適量50%甲醇至質量濃度為3 mg·mL-1的儲存液，用50%甲醇分別稀釋化合物4～6和8到使用質量濃度0.18 mg·mL-1，化合物7、9～11質量濃度為0.42 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160的稀釋因子進行稀釋，以峰面積為Y，各個化合物進樣質量（g）為X，獲得標準曲線。

2.4 數據分析

使用IBM SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對各化合物含量與甘草粉末粒度的相關性進行統(tǒng)計分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 甘草粉末粒度檢測結果

典型差異甘草樣品檢測結果見表2，計算出粉末樣品中粒徑在0.01～2.00、2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00、250.00～500.00、500.00～1000.00、1000.00～2000.00 μm 的體積占比，即粉末樣品的粒度分布，以此來表征甘草粉末的粉體特征。可見不同產地甘草樣品粒度分布存在明顯差異。

表2 甘草粉末粒度分布 %

40 份甘草粉末樣品的粒徑分布在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm 幾個區(qū)段內的粒子體積占比較大（均值＞10%），且在40 個樣品當 中 2.00～20.00、50.00～100.00、100.00～200.00、500.00～1000.00 μm 幾個區(qū)段內的粒子分布體積的波動較大（波動＞10%），見表2。這些甘草粉末樣品在這些區(qū)段的分布可能與甘草的粉體特征和品質有關聯(lián)。

3.2 有效成分含量測定結果

3.2.1 標準曲線 各化合物質量濃度及色譜峰面積線性關系良好，見表3。

表3 甘草各化合物標準曲線的回歸方程

3.2.2 有效成分含量 《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定，甘草中甘草酸質量分數不得低于2%、甘草苷質量分數不得低于0.5%，根據測量值，40批甘草中甘草酸不合格率為32.5%，甘草苷不合格率為35.0%。甘草酸不合格的樣品產地主要集中在新疆，包括新疆29 團、30 團、和碩、精河、輪南和伊犁等地的部分樣品，并與等級無明顯相關。甘草苷不合格的樣品產地也主要集中在新疆，尤其以新疆29 團、30 團、輪南、精河、伊犁等地不合格比較嚴重。

諸多產地中甘肅榆中的一等甘草質量最佳，其甘草酸質量分數最高達4.68%、甘草苷質量分數最高達5.14%，在測定的成分中22-β-乙酰氧基-甘草酸、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷均為峰值，且甘草皂苷G2質量分數為0.456 0%，僅次于內蒙古烏拉特前旗GC07-01樣品（0.468 1%），見表4。

表4 甘草中甘草酸及甘草苷類化合物質量分數 %

續(xù)表4

3.3 甘草酸及甘草苷類化合物與甘草粉末粒度的相關性

由表5可知，甘草粒度分布與有效成分的含量具有顯著相關性。在甘草粒徑分布在50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00 μm，粒子分布數越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、維采寧和異甘草苷的含量越低，且在100.00～200.00 μm，粒子分布越多，22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越高；但是在500.00～1000.00 μm，粒子分布越多，甘草苷及異甘草苷的含量越高；在1000.00～2000.00 μm，粒子分布越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、維采寧和異甘草苷的含量均越高，僅22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越低。

提示甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、維采寧和異甘草苷含量與50.00～250.00 μm 的粒子分布呈負相關，而與1000.00～2000.00 μm 分布的粒子呈正相關；甘草苷及異甘草苷的含量與500.00～1000.00 μm 分布的粒子呈正相關。根據3.1 項下結果，40份甘草粉末樣品的粒徑分布 在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm幾個區(qū)段內的粒子分布體積占比較大（均值＞10%），由此可推測，甘草粉末粒徑在50.00～200.00、500.00～1000.00 μm 分布，與甘草質量直接相關。50.00～200.00 μm 分布越少，500.00～1000.00 μm分布越多，同時在更高的粒徑范圍內分布越多，甘草質量可能越好。

4 討論

本研究以甘草為研究對象引入粒度分析儀，分析了甘草粉末的粒度分布，測量結果準確、可靠，適用于將中藥材粉體特征鑒別指標客觀化、量化。通過分析甘草粉末粒度分布與有效成分含量之間的相關性，發(fā)現(xiàn)甘草粉末粒度分布與有效成分的含量具有顯著相關性，將粒度分布同中藥材品質相關聯(lián)，提供客觀的數據支持，為現(xiàn)代中藥鑒定數字化發(fā)展提供了新方法、新思路。

本研究統(tǒng)計甘草粉末樣品粒度分布體積占比大于10% 的區(qū)段，推測甘草粉末粒徑在50.00～200.00 μm 和500.00～1000.00 μm 的分布可用于表征甘草粉體特性，與甘草質量直接相關。相關性分析表明，甘草粉末粒徑在50.00～250.00 μm分布越少，500.00～1000.00 μm 及更高的粒徑范圍內分布越多，甘草質量可能越好。《中國藥典》2020年版（一部）規(guī)定粗粉指能全部通過二號篩[（850±29）μm]，但混有能通過四號篩[（250±9.9）μm]不超過40%的粉末；中粉是指能全部通過四號篩[（250±9.9）μm]，但混有能通過五號篩[（180±7.6）μm]不超過60%的粉末[1]。因此本研究結果表明，甘草粉末（粗粉）中滿足中粉要求（能通過四號篩）的體積占比越大，甘草酸和甘草苷等活性成分含量越低。

自古以來甘草以粉性為佳，但“粉性”科學內涵仍有待發(fā)掘，量化評價方法仍有待建立。本研究除了將粒度分布同甘草品質相關聯(lián)外，采用的技術和方法還可為“粉性”的量化提供參考，對揭示中藥辨狀論質方法學的本質有一定意義。