基于多指標(biāo)含量測(cè)定的恒山黃芪特征成分研究△

郭雅璇，李蓉蓉，秦雪梅，李震宇*

1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

黃芪是一種常用的傳統(tǒng)中藥，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血的功效，用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久潰不斂[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版收載的黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。

目前，蒙古黃芪是商品黃芪藥材的主流品種。其中產(chǎn)于北岳恒山山脈毗鄰地區(qū)的蒙古黃芪俗稱恒山黃芪，生長(zhǎng)年限多在5 年以上，是藥用黃芪中的優(yōu)質(zhì)品種，以“條直長(zhǎng)、綿性大、粉性和甜味足”為特點(diǎn)[2-3]。隨著黃芪用量和需求的增加，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅等地，生長(zhǎng)期為2 年的育苗移栽蒙古黃芪成為藥用黃芪的主流商品。由于種植模式不同，雖然兩者都是蒙古黃芪，但外觀性狀表現(xiàn)出明顯的差異[4]。在藥材交易市場(chǎng)中，恒山黃芪的價(jià)格遠(yuǎn)高于2年生移栽黃芪。

針對(duì)這2 種不同生長(zhǎng)方式蒙古黃芪的質(zhì)量差異，已有文獻(xiàn)對(duì)其化學(xué)組成進(jìn)行系統(tǒng)比較[5-8]。本課題組前期研究表明，恒山黃芪的特征成分可能為黃酮類成分[9]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是《中國(guó)藥典》2020年版中黃芪項(xiàng)下的含量測(cè)定指標(biāo)，僅測(cè)定這1 個(gè)成分難以全面評(píng)價(jià)黃芪中黃酮類成分的含量特征。芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷和黃芪異黃烷這幾個(gè)黃酮類成分在黃芪中的含量也較高[9]，并且具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗輻射損傷、神經(jīng)保護(hù)、骨骼保護(hù)、降血糖及血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)等多種藥理作用[10-13]。因此，這些黃酮類成分也應(yīng)納入評(píng)價(jià)指標(biāo)。雖然已有文獻(xiàn)建立了同時(shí)測(cè)定黃芪中多種指標(biāo)成分的高效液相色譜法（HPLC）[14-16]，但這些方法中色譜條件較為復(fù)雜，大多采用梯度洗脫，存在檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、液相梯度變化復(fù)雜進(jìn)而影響方法的重現(xiàn)性等問(wèn)題。

本研究在《中國(guó)藥典》2020 年版中黃芪項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，建立一種同時(shí)測(cè)定5 個(gè)黃酮類成分含量的方法，測(cè)定指標(biāo)除了毛蕊異黃酮葡萄糖苷外，還選擇了芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷和黃芪異黃烷；同時(shí)收集12 批恒山黃芪，并以9 批甘肅、內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)的2 年生栽培蒙古黃芪為參照樣本（以下簡(jiǎn)稱參照黃芪），通過(guò)黃芪5 個(gè)黃酮成分結(jié)合黃芪甲苷的多指標(biāo)含量測(cè)定，進(jìn)一步分析恒山黃芪的特征化學(xué)成分。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（Agilent 公司），包括G7111A 型四元泵、G7117C 型二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；2695 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；HH-ZK4型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agela Technologies公司）。

1.2 試藥

黃芪樣品共21 批，其中1～12 批為恒山黃芪，13～21 批為參照黃芪，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定均為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，其詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 黃芪樣品信息

甲醇（純度≥99%）、甲酸（色譜純）均購(gòu)于天津大茂有限公司；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（純度≥99%，批號(hào)：102944）、芒柄花苷（純度≥99%，批號(hào)：102715）、黃芪紫檀烷苷（純度≥98%，批號(hào)：100760）、黃芪異黃烷苷（純度≥98%，批號(hào)：100762）、黃芪異黃烷（純度≥98%，批號(hào)：100466）均購(gòu)自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；對(duì)照品黃芪甲苷（純度≥98%，批號(hào)：HA012079198，寶雞市辰光生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別取對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷適量，精密稱定。加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.997 0、0.204 0、0.611 4、0.312 9、0.458 5 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)微孔濾膜，即得[1]。

2.3 色譜條件

Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～20 min，20%～40%B；20～40 min，40%B）；柱溫為30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為230、260 nm；流速為1 mL·min-1；分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，在2.3項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在2.3 項(xiàng)下色譜條件下對(duì)黃芪樣品進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算5 個(gè)黃酮類化合物的理論板數(shù)（N）及分離度（R）。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成系列對(duì)照品溶液，按照建立的色譜條件進(jìn)行分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取黃芪樣品粉末制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件，當(dāng)天連續(xù)進(jìn)樣6次和連續(xù)3 d進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取黃芪樣品粉末制備供試品溶液，共制備6份，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量的RSD。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取黃芪藥材粉末制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的黃芪樣品約0.5 g，按黃芪藥材中5個(gè)黃酮類化合物含量的50%、100%、150%分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液，每個(gè)質(zhì)量濃度下平行備樣3 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定5 個(gè)黃酮類化合物的含量，并計(jì)算回收率及RSD。

2.5 黃芪甲苷的含量測(cè)定

對(duì)照品溶液的制備、供試品溶液的制備及HPLC 條件參照《中國(guó)藥典》2020 年版黃芪項(xiàng)下黃芪甲苷的含量測(cè)定[1]，并對(duì)21批樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.6 水分測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）中水分測(cè)定法[17]（通則0832第二法）測(cè)定黃芪樣品中的水分。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)SPSS 21.0 軟件分析黃芪中化合物的含量均值，并對(duì)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布進(jìn)行檢驗(yàn)。采用軟件GraphPad Prime 6 對(duì)恒山黃芪和參照黃芪中的化合物的含量進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，繪制其含量柱狀圖，并對(duì)各化合物的含量進(jìn)行受試者工作特征（ROC）曲線分析。采用Pearson 相關(guān)分析法分析化合物之間的相關(guān)性。將21 批恒山黃芪和參照黃芪中6 個(gè)成分的含量導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 5個(gè)黃芪黃酮測(cè)定方法的建立

3.1.1 色譜條件的確立 在《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定條件基礎(chǔ)上，洗脫時(shí)間延長(zhǎng)至40 min，同時(shí)增加檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，即可同時(shí)測(cè)定5 個(gè)黃芪黃酮成分，且分離良好。其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷在260 nm 下測(cè)定，黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷和黃芪異黃烷在230 nm下測(cè)定（圖1）。

圖1 黃芪中5個(gè)黃酮類化合物的HPLC圖

3.1.2 方法學(xué)考察 專屬性考察結(jié)果表明，供試品溶液中其他成分對(duì)待測(cè)成分無(wú)干擾，分析方法專屬性良好，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 空白溶劑、混合對(duì)照品及黃芪供試品溶液的HPLC圖

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果表明，5 個(gè)黃酮類化合物的N及R均符合《中國(guó)藥典》2020 年版要求。線性關(guān)系考察結(jié)果表明，5 個(gè)黃酮類化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（表2）。

表2 黃芪中5個(gè)黃酮類化合物含量測(cè)定方法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，5 個(gè)黃酮類化合物日內(nèi)精密度的RSD 為0.15%～0.59%，日間精密度RSD為0.32%～1.75%，表明方法精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，5 個(gè)黃酮類化合物含量的RSD 為0.62%～1.94%，表明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，5 個(gè)黃酮類化合物峰面積的RSD 為0.49%～1.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。5個(gè)黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%～0.125%，測(cè)定方法的加樣回收率為96%～107%，均符合《中國(guó)藥典》2020年版的規(guī)定。

表3 黃芪中5個(gè)黃酮類化合物加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.2 不同產(chǎn)地黃芪中黃酮類化合物含量分析

采用上述方法對(duì)21 批黃芪樣品進(jìn)行分析，扣除水分后5 個(gè)黃酮類化合物的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的限度為不低于0.02%，所有黃芪樣品均符合規(guī)定。21 批黃芪樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值分別為0.064%、0.022%、0.021%、0.012%、0.012%。在21 批黃芪樣品中，除芒柄花苷外，其余黃酮類成分的含量波動(dòng)均較大。此外，恒山黃芪中含量最高的黃酮為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，除個(gè)別批次外，芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也均在0.01%以上。

表4 黃芪中水分及6個(gè)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 %

進(jìn)一步采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 對(duì)兩組黃芪中5 個(gè)黃酮類化學(xué)成分的含量是否服從正態(tài)分布進(jìn)行檢驗(yàn)。由于樣本數(shù)（3≤n≤50）較小，選用W檢驗(yàn)判斷是否服從正態(tài)分布。結(jié)果顯示，恒山黃芪、參照黃芪中5 個(gè)黃酮類成分的含量均符合正態(tài)分布（P＞0.05）。進(jìn)一步對(duì)恒山黃芪與參照黃芪進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示恒山黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷的含量顯著高于參照黃芪（P＜0.05），恒山黃芪中的芒柄花苷含量均值高于參照黃芪，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A～E）。

3.3 黃芪甲苷的含量分析

參照《中國(guó)藥典》2020 年版，對(duì)21 批黃芪樣品中的黃芪甲苷進(jìn)行測(cè)定，扣除水分后其結(jié)果見(jiàn)表4?！吨袊?guó)藥典》2020 年版規(guī)定黃芪甲苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的限度為不低于0.08%，除了編號(hào)4 的恒山黃芪低于規(guī)定限度外，其余樣本均符合規(guī)定。21 批黃芪樣品中黃芪甲苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.16%。此外，恒山黃芪（P＞0.05）、參照黃芪（P＞0.05）中黃芪甲苷的含量均符合正態(tài)分布，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪甲苷的含量在兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但恒山黃芪中的黃芪甲苷含量均值高于參照黃芪（圖3F）。

圖3 恒山黃芪與參照黃芪中5個(gè)黃酮類成分及黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（± s）

3.4 相關(guān)性分析

按照《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定，黃芪項(xiàng)下只測(cè)定毛蕊黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷這2 個(gè)指標(biāo)成分，因此通過(guò)Pearson相關(guān)分析現(xiàn)行含量測(cè)定指標(biāo)與其他4 個(gè)黃酮類化合物之間的相關(guān)性（圖4）。相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值在0.8～1.0表示極強(qiáng)相關(guān)，0.6～0.8表示強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.6 表示中等程度相關(guān)，0.2～0.4 表示弱相關(guān)，0～0.2 表示極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)。毛蕊異黃酮葡萄糖苷與黃芪紫檀烷苷（r=0.93）、黃芪異黃烷苷（r=0.86）之間呈極強(qiáng)相關(guān)，與芒柄花苷（r=0.47）、黃芪異黃烷（r=0.56）之間呈中等程度相關(guān)。黃芪甲苷與芒柄花苷（r=-0.56）呈中等程度相關(guān)，與黃芪異黃烷（r=0.27）之間呈弱相關(guān)，與黃芪紫檀烷苷（r=0.02）、黃芪異黃烷苷（r=0.05）無(wú)相關(guān)。此外，《中國(guó)藥典》2020年版的2個(gè)含量測(cè)定指標(biāo)黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷（r=-0.19）呈極弱相關(guān)。因此，按照《中國(guó)藥典》2020 年版方法，單獨(dú)測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷也可以間接反映黃芪紫檀烷苷和黃芪異黃烷苷這2 個(gè)成分的含量高低，但不能反映芒柄花苷、黃芪異黃烷的含量高低。

圖4 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷與其他4個(gè)黃酮類化合物的相關(guān)性分析

3.5 多元統(tǒng)計(jì)分析

為了進(jìn)一步分析恒山黃芪和參照黃芪之間的質(zhì)量差異，以6 個(gè)成分的量為變量進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。在由主成分1（PC1，56.4%）和PC2（27.9%）構(gòu)建的散點(diǎn)圖（圖5A）中可以看出，恒山黃芪大多位于散點(diǎn)圖右半部分，而參照黃芪大多位于散點(diǎn)圖左半部分，說(shuō)明恒山黃芪和參照黃芪的化學(xué)組成可能存在差異。進(jìn)一步進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA（圖5B），模型驗(yàn)證結(jié)果顯示（圖5C），2條回歸線斜率較大，左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的矩陣解釋率參數(shù)（R2）、模型預(yù)測(cè)參數(shù)（Q2）均小于右端，說(shuō)明原始模型的預(yù)測(cè)能力大于任何一次隨機(jī)排列Y變量的預(yù)測(cè)能力，證明模型有效，即恒山黃芪與參照黃芪之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 恒山黃芪和參照黃芪指標(biāo)成分含量的PCA和PLS-DA

3.6 ROC曲線分析

將恒山黃芪和參照黃芪5 個(gè)黃酮類化合物和黃芪甲苷的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 6 進(jìn)行ROC曲線分析。ROC 曲線下面積反映判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，曲線下面積越大說(shuō)明結(jié)果越準(zhǔn)確。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷和黃芪異黃烷苷的曲線下面積分別為0.953 7、0.976 9、0.981 5，均大于0.9，說(shuō)明可用于判別恒山黃芪和參照黃芪，其中黃芪異黃烷苷判別的可信度最高（表5）。

表5 黃芪中5個(gè)黃酮類化合物和黃芪甲苷含量的ROC曲線參數(shù)

4 討論

本研究首先通過(guò)5 個(gè)黃芪黃酮類成分的混合對(duì)照品溶液選擇最佳吸收波長(zhǎng)，結(jié)果顯示，203、210、230 nm 下黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷的響應(yīng)均較高，但203、210 nm 下基線不穩(wěn)定，因此選擇在230 nm 下檢測(cè)；而毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷在260 nm 下響應(yīng)較高，因此選擇在260 nm 下檢測(cè)。在《中國(guó)藥典》2020 年版黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，不改變備樣方法和色譜洗脫條件，僅通過(guò)延長(zhǎng)洗脫時(shí)間并增加1 個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，即可在毛蕊異黃酮葡萄糖苷準(zhǔn)確測(cè)定基礎(chǔ)上增加其他4 個(gè)黃酮類成分的含量測(cè)定。與現(xiàn)有的黃芪黃酮多指標(biāo)含量測(cè)定方法相比檢測(cè)時(shí)間短、液相梯度變化簡(jiǎn)單，5 個(gè)黃酮類成分均在最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，可推廣用于黃芪藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。對(duì)21 批黃芪的含量測(cè)定結(jié)果表明，恒山黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷4 個(gè)黃酮類化合物的含量顯著高于參照黃芪，而芒柄花苷、黃芪甲苷含量略高于參照黃芪，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC 曲線分析表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷和黃芪異黃烷苷判別的可信度較高，可作為恒山黃芪的特征判別成分。在今后的研究中筆者將進(jìn)一步增加黃芪樣品批次，確證恒山黃芪的化學(xué)特征。