鄰甲氧基肉桂酸抗衰老活性及機制研究△

王析瑞，劉永建，劉岑，杜裕，楊洪柳，劉永剛

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

衰老是一個復雜的過程，受體內外多種因素共同影響，并會導致各種其他疾病的發生。如何延緩衰老及減少其相關疾病的發生是人類社會面臨的主要挑戰之一。衰老與氧化應激的關系密不可分。衰老的相關學說之一氧化應激學說認為，氧化性損傷是導致衰老的根本原因，可以通過抗氧化藥物降低體內自由基水平，進而延緩機體衰老[1]。

鄰甲氧基肉桂酸（OMA）是一種合成香料，具有特有的脂香氣及花香，主要用于日化香精，還可用于肥皂、化妝品和洗滌劑等用品的加香[2]。鄰甲氧基肉桂酸酯類是日化護膚品配方中的抗紫外線劑[3]，而其合成的重要原料正是OMA。經過初步篩選，OMA 具有一定的抗氧化活性，且其合成工藝簡單、反應溫和、合成原料與試劑廉價易得、總收率高、具有較高的安全性[4]。OMA 還存在于桂枝中，現代藥理研究表明，桂枝具有良好的抗衰老活性[5-6]。目前國內外學者主要關注桂枝的揮發油部位及復方功效，較少涉及抗衰老活性成分的研究，其活性成分尚不明確。因此，尋找桂枝抗衰老的活性成分對其物質基礎研究具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲）與傳統動物模型相比具有許多優點，如體形小、壽命短、易操作、成本低、遺傳背景清晰、透明度高、具有完全測序的基因組及超過65%與人類相關的基因等[7]。線蟲和哺乳動物之間的一些衰老現象很相似，如脂褐素濃度增加、運動減慢和神經系統退化[8]。而且，由于線蟲身體透明，通過熒光標記可以直接在體內觀察其神經元及亞細胞結構，這些優勢使線蟲廣泛應用于抗衰老疾病的研究中[9-11]。線蟲作為一種模式生物，在鑒定可能有益于延緩衰老的中藥和天然藥物并研究其作用機制方面具有很高的價值[12-13]。

本研究采用線蟲模型，探索OMA 對線蟲體長、脂褐素含量等的影響，并進一步利用線蟲轉基因株系探究OMA抗衰老的潛在作用機制，為其治療衰老等相關疾病的研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

OMA（批號：091128，純度≥98%，武漢遠城科技發展有限公司）；1-苯氧基-2-丙醇、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、蛋白胨、膽固醇、無水乙醇、次氯酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）均購自北京虹湖化工有限公司；碳酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、氯化銨、氫氧化鈉等試劑均購自蘭博利德生物科技有限公司。

1.2 菌株及線蟲

菌株和線蟲均由中國科學院遺傳與發育生物學研究所惠贈；缺陷型大腸埃希氏菌（Escherichia coliOP50）；野生型線蟲株N2；線蟲株TJ356，基因型：zls356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6 (su1006)]，綠色熒光蛋白（GFP）融合衰變加速因子-16（DAF-16）蛋白；線蟲株CF1553，基因型：muls84 [(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6 (su1006)]，GFP 融合超氧化物歧化酶-3（SOD-3）蛋白。

1.3 儀器

Revco PLUS 型-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo公司）；SW-CJ-2FD標準型雙人單面凈化工作臺（蘇州博萊爾凈化設備有限公司）；SPX-250 型生化培養箱（北京科偉永興儀器有限公司）；SMZ745 型體式顯微鏡、D-LH/LC 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；SP8 型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；YXQ-LS-100SⅡ型高溫高壓滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；KQ100VDB 型雙頻數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；BSA124S-CW 型萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SYG-A2-6 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；LX-300 型迷你離心機、VORTEX-7 型迷你混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 加藥培養基及加藥E.coli OP50的配制

為保證線蟲能夠充分暴露于藥物中，培養基及E.coliOP50 中都補充了對應濃度的OMA。用DMSO溶解OMA，配制成100 mmol·L-1母液。將配制好的藥物母液與培養基混合，制成含OMA 63、125、250 μmol·L-1的培養液，倒入培養板中。培養板在室溫下保存，直到瓊脂凝固，然后在4 ℃下保存。用E.coliOP50 溶液對配制好的藥物母液進行稀釋，充分混勻后配制成含OMA不同濃度（63、125、250 μmol·L-1）的食物添加到培養基中。

2.2 線蟲的培養

無菌環境下，在培養基中接種E.coliOP50 50 μL后，放置于生化培養箱中1 d后可用于培養線蟲。線蟲在培養基上生長發育，培養于22 ℃恒溫培養箱。根據實驗需要，3～4 d 轉1 次板，避免線蟲過于擁擠或處于饑餓狀態而進入dauer時期，同時還需要保證線蟲的干凈，防止霉菌、細菌及螨蟲等污染。

2.3 OMA抗衰老活性研究

2.3.1 線蟲體長測定 將經過同步化生長至L4期的線蟲分為對照組和OMA 不同濃度組，分別置于含OMA 0、63、125、250 μmol·L-1的培養板中，給藥處理24 h后，將線蟲挑至滴加1滴M9溶液（磷酸二氫鉀+磷酸二氫鈉）的載玻片上，再滴加1滴0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，將玻片放置于倒置顯微鏡上，對至少60條線蟲進行拍照，利用倒置顯微鏡自帶軟件測量線蟲體長。

2.3.2 線蟲頭部擺動能力測定 線蟲分組及處理同2.3.1項下，給藥處理3 d 后，將線蟲轉移到不含E.coliOP50 的培養基上。線蟲頭部擺動方向改變，其轉向必須轉過其身體朝向方向，記為1 次數據。在體視顯微鏡下觀察并記錄線蟲在20 s 內的頭部擺動次數。每組實驗計數20條線蟲。

2.3.3 線蟲脂褐素含量測定 線蟲分組及處理同2.3.1項下，給藥處理5 d 后，將線蟲挑至滴加1 滴M9溶液的載玻片上，再滴加1滴0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，在熒光顯微鏡下觀察線蟲，固定曝光時間和強度，設置激發波長為380 nm，發射波長為420 nm，拍攝不同組的熒光圖片。之后使用Image J軟件處理圖片，統計不同組線蟲體內脂褐素的熒光強度，每組實驗至少計數60條線蟲。

2.3.4 線蟲氧化應激實驗 將經過同步化生長至L4 期的線蟲分為對照組和OMA 63 μmol·L-1組，分別置于含OMA 0、63 μmol·L-1的培養板中，給藥處理3 d后，將各組線蟲轉移至含有0.1%雙氧水（H2O2）的線蟲培養板中，于體視顯微鏡下進行觀察，記錄每小時死亡線蟲的數量，直到所有線蟲死亡。每組實驗至少計數60條線蟲。

2.3.5 線蟲熱應激實驗 線蟲分組及處理同2.3.4項下，給藥處理3 d 后，將線蟲轉移到37 ℃培養箱中進行觀察，記錄每小時死亡線蟲的數量，直到所有線蟲死亡。每組實驗至少計數60條線蟲。

2.4 OMA抗衰老作用機制研究

2.4.1 TJ356 線蟲DAF-16 蛋白核轉位實驗 TJ356線蟲是GFP 融合DAF-16 蛋白的線蟲。在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光即可統計DAF-16 蛋白分布情況。將同步化后的TJ356線蟲卵分為對照組和OMA不同濃度組，分別置于含OMA 0、63、125、250 μmol·L-1的培養板中。給藥處理3 d 后，將線蟲挑至滴加1 滴M9 溶液的載玻片上，再滴加1 滴0.5% 1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線蟲并拍攝熒光圖片。統計各組的線蟲總數及線蟲發生核轉位占線蟲總數的比例。每組實驗至少計數30條線蟲。

2.4.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達實驗 CF1553線蟲是一種GFP 標記SOD-3 蛋白的線蟲，在熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光強度即可直接反映出SOD-3蛋白的表達情況。將同步化后的CF1553線蟲卵分為對照組和OMA 不同濃度組，分別置于含OMA 0、63、125、250 μmol·L-1的培養板中。給藥處理3 d后，將線蟲挑至滴加1滴M9溶液的載玻片上，再滴加1滴0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線蟲并拍攝熒光圖片。然后使用Image J軟件處理圖片，統計不同組線蟲全身的熒光強度。每組實驗至少計數30條線蟲。

2.5 統計學處理

使用SAS 9.4 統計軟件進行統計分析，通過單因素方差分析對觀察到的差異進行統計顯著性評估，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 OMA抗衰老活性研究

3.1.1 線蟲體長測定 利用倒置顯微鏡自帶軟件進行線蟲體長的測定（圖1）。不同濃度的OMA 對線蟲體長的影響見表1。實驗結果表明，OMA 可以抑制線蟲的體長。與對照組相比，隨著濃度的增加，線蟲體長不斷減少，差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖1 測量線蟲體長代表性圖（×40）

表1 OMA對線蟲體長的影響（±s, n=60）

表1 OMA對線蟲體長的影響（±s, n=60）

注：與對照組比較，***P＜0.001；表4同。

3.1.2 線蟲頭部擺動能力測定 不同濃度的OMA對線蟲頭部擺動頻率的影響見表2。實驗結果表明，與對照組相比，不同濃度OMA 組線蟲20 s頭部擺動頻率都有所減少，但差異無統計學意義。

表2 OMA對線蟲頭部擺動頻率的影響（±s, n=20）

表2 OMA對線蟲頭部擺動頻率的影響（±s, n=20）

3.1.3 線蟲脂褐素含量測定 不同濃度的OMA 對線蟲脂褐素沉積的影響見圖2 和表3。實驗結果表明，與對照組相比，不同濃度OMA 組線蟲體內脂褐素含量均顯著降低（P＜0.001）。與OMA 63 μmol·L-1組相比，OMA 125、250 μmol·L-1組線蟲體內脂褐素含量顯著升高（P＜0.001）。OMA 63 μmol·L-1組線蟲體內脂褐素含量最低，對線蟲體內脂褐素沉積的減緩作用最強，因此后續氧化應激及熱應激實驗選擇OMA 給藥濃度為63 μmol·L-1。

圖2 OMA各濃度組線蟲體內脂褐素熒光圖（×40）

表3 OMA對線蟲脂褐素沉積的影響（±s, n=20）

表3 OMA對線蟲脂褐素沉積的影響（±s, n=20）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與OMA 63 μmol·L-1組比較，###P＜0.001。

3.1.4 線蟲氧化應激實驗 線蟲在H2O2應激環境中培養的生存曲線見圖3。OMA 組線蟲生存曲線與對照組相比有一定程度的右移，且差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 氧化應激下OMA對線蟲壽命的影響

3.1.5 線蟲熱應激實驗 線蟲在37 ℃環境中培養的生存曲線見圖4。與對照組相比，在熱應激條件下，OMA 組線蟲在4～6 h 生存率提高，但差異無統計學意義。

圖4 熱應激下OMA對線蟲壽命的影響

3.2 OMA抗衰老作用機制研究

3.2.1 TJ356線蟲DAF-16蛋白核轉位實驗 DAF-16蛋白可調節線蟲的抗逆性和持久性，其核定位對激活下游基因至關重要。OMA 對線蟲DAF-16 核定位的影響見圖5。DAF-16::GFP 的熒光在TJ356 線蟲細胞內的定位主要分為細胞質定位、中間定位及細胞核定位。結果表明，對照組中，DAF-16::GFP 熒光細胞質定位占比為51.75%，中間定位占比為46.49%，細胞核定位占比為1.75%；OMA處理后，63 μmol·L-1濃度組中DAF-16::GFP 熒光細胞質定位占比為26.74%，中間定位占比為51.16%，細胞核定位占比為22.09%；125 μmol·L-1濃度組中DAF-16::GFP熒光細胞質定位占比為13.16%，中間定位占比為60.53%，細胞核定位占比為26.32%；250 μmol·L-1濃度組中DAF-16::GFP 熒光細胞質定位占比為22.22%，中間定位占比為47.22%，細胞核定位占比為30.56%。結果表明OMA 能顯著促進DAF-16向細胞核的遷移。

圖5 OMA各濃度組TJ356線蟲體內GFP熒光圖（×40）

3.2.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達 為了進一步確認OMA 是否會影響DAF-16 的轉錄活性，利用SOD-3::GFP 的轉基因線蟲CF1553 觀察SOD-3 蛋白的表達情況。結果如圖6 及表4 所示，給藥3 d 后，與對照組相比，OMA 各濃度給藥組線蟲的熒光強度均有所增高，250 μmol·L-1濃度組線蟲的熒光強度最高，且差異有統計學意義（P＜0.001）。進一步說明樣品能激活DAF-16 轉錄因子，促進線蟲DAF-16轉錄入核，從而促進SOD-3蛋白表達。

表4 OMA對CF1553線蟲SOD-3蛋白表達的影響（±s, n=30～60）

表4 OMA對CF1553線蟲SOD-3蛋白表達的影響（±s, n=30～60）

圖6 OMA各濃度組CF1553線蟲體內GFP熒光圖（×40）

4 討論

本研究探討了OMA抗衰老的活性作用及其分子機制。與其他生物體一樣，線蟲表現出許多與年齡相關的變化。隨著年齡的增長，線蟲的活躍性降低，表現出一些不協調的運動，可通過測量其身體彎曲頻率、頭部擺動頻率等檢測這種變化。還有研究發現，線蟲抗氧化能力的提高及壽命的延長往往伴隨著線蟲體長的減小[14-15]。本研究結果表明，OMA 可以抑制線蟲的體長并降低其頭部擺動頻率，其可能會提高線蟲抗氧化的能力并延長線蟲的壽命。其他與年齡相關的變化還包括脂褐素積累增加[16]。脂褐素是一種自身熒光色素，在線蟲體內積累，可以通過熒光顯微鏡檢測。本研究通過檢測給藥5 d后線蟲體內脂褐素熒光強度發現，與對照組比較，OMA 組線蟲體內脂褐素熒光強度均明顯降低，對線蟲體內脂褐素沉積減緩有一定作用。說明OMA可以有效減少衰老引起的有害物質脂褐素的沉積，減少對機體的損傷，具有顯著的延緩衰老的活性。

與衰老相關的信號通路中，胰島素/胰島素樣生長因子-1（IIS）信號通路的研究最為廣泛。DAF-16是作用于IIS信號通路的一種主要的轉錄因子，可調節線蟲的抗逆性和持久性，DAF-16的核定位對激活下游基因至關重要。激活線蟲DAF-16轉錄因子能上調一系列抗脅迫基因的表達，抑制線蟲體內異常的蛋白沉積與錯誤折疊，提高機體的抗脅迫能力，延長線蟲壽命。有研究報道，DAF-16 不僅受IIS 信號通路的調控，還受到許多其他信號通路和調控蛋白的調控。這些調控可以影響DAF-16的表達水平、核定位及轉錄活性，進而影響DAF-16對下游抗脅迫基因如sod-3的調控，調節線蟲的生理活動。

本研究采用線蟲轉基因株系作為動物模型，通過DAF-16 核轉位實驗和SOD-3 融合GFP 熒光檢測實驗探究OMA 抗衰老活性是否依賴IIS 分子信號通路。TJ356株系線蟲攜帶DAF-16::GFP融合蛋白，在正常生長發育條件下，TJ356 株系線蟲周身呈現均勻彌散的綠色熒光，當DAF-16 轉錄因子被激活時，將發生核轉位，綠色熒光細胞質定位轉移為細胞核定位，在熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的點狀綠色熒光[17]。給藥作用3 d 后，OMA 各濃度給藥組線蟲在熒光顯微鏡下能明顯觀察到熒光點，說明OMA能激活DAF-16 轉錄因子，促進線蟲DAF-16 發生核轉位。研究發現，SOD 對過量氧自由基具有清除作用，能減輕氧化應激對機體的損傷[18]，且sod-3是daf-16的直接下游靶基因之一，由daf-16直接調控其轉錄。DAF-16 轉錄活性通過其下游基因sod-3的表達加以驗證。轉基因線蟲CF1553 攜帶SOD-3::GFP融合蛋白，當CF1553 線蟲sod-3基因被激活時，線蟲體內將會大量表達GFP。本研究通過CF1553線蟲SOD-3::GFP 實驗發現OMA 能顯著增強CF1553 線蟲熒光強度，增加SOD-3蛋白表達量。

綜上所述，OMA 具有良好的抗衰老活性，其作用機制可能是通過IIS 途徑激活DAF-16 轉錄因子，促進線蟲體內DAF-16 核轉位，上調SOD-3 表達水平，提高機體抗氧化應激能力延緩線蟲衰老。本研究初步闡釋了OMA抗衰老的作用機制，為其在抗氧化、抗衰老方面的進一步研究提供了一定的理論依據，為后續實驗驗證提供了思路。