復方感冒靈顆粒抗流感相關藥效作用研究△

吳文潔，劉陳，劉黎明，戴玉豪，符國成，龔小兵，陳海剛*，李韶菁*

1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230000；2.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100010；3.華潤三九（郴州）制藥有限公司，湖南 郴州 423000

復方感冒靈顆粒（compound Ganmaoling granules，CGG）是由中藥（traditional Chinese medicine，TCM）和化學藥（chemical medicine，CM）配伍組成的復方制劑，其中中藥部分有山銀花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板藍根、崗梅6 味中藥；化學藥部分則有馬來酸氯苯那敏、咖啡因、對乙酰氨基酚3 種[1]。該復方制劑具有辛涼解表、清熱解毒的功能，用于風熱感冒及溫病之發熱、微惡風寒、頭身痛、口干而渴、鼻塞涕濁、咽喉紅腫疼痛、咳嗽、痰黃黏稠。其臨床用于治療感冒引起的頭痛、發熱、鼻塞、流涕、咽痛等上呼吸道感染疾病。

本課題組基于網絡藥理學對體內暴露的中藥成分進行分析，構建了CGG 成分-靶點-通路-功效的關聯網絡，發現其中藥成分核心靶點對應的功效為解熱、抗炎與抗病毒。為進一步驗證其功效，本課題組對CGG 進行與流行性感冒相關的體內外抑菌、抗病毒、解熱、抗炎等實驗研究，評價并比較CGG 全方、CM 組、TCM 組的藥效作用，為CGG 治療感冒的臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 試藥

馬來酸氯苯那敏（批號：C015-190414，純度：99%）、咖啡因（批號：1012004405，純度：98%）、對乙酰氨基酚（批號：202007119A，純度：99%）均購自中國食品藥品鑒定研究院；藥材山銀花（批號：20201001，產地湖南）、野菊花（批號：20201001，產地安徽）、崗梅（批號：20201002，產地廣東）、三叉苦（批號：20201002，產地廣西）、五指柑（批號：20201002，產地廣西）、南板藍根（批號：20201002，產地廣西）經中國中醫科學院中藥研究所李韶菁研究員鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版項下規定；CGG 流膏（批號：Z2012122）和CGG 成品（批號：2105062N）均由華潤三九（郴州）制藥有限公司提供；磷酸奧司他韋膠囊（批號：M1046，上海羅氏制藥有限公司）；鹽酸莫西沙星片（批號：BJ51319，拜耳醫藥保健有限公司）；阿司匹林維生素C 泡騰片（批號：BT11AV21，拜耳醫藥保健有限公司啟動分公司）；布洛芬顆粒（批號：2003611，哈藥集團世一堂制藥廠）；營養瓊脂培養基（批號：20190418）、營養肉湯培養基（批號：20190516）均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；高活性干酵母（批號：20190102，安琪酵母股份有限公司）；巴豆油（批號：C10936730，上海麥克林生化科技有限公司）；無水乙醇（批號：20181210）、乙醚（AR，純度≥99.5%，批號：20181009）均購于國藥集團化學試劑有限公司；無菌水（批號：R1600，北京索萊寶科技有限公司）；Watsons純凈水（批號：20200102，廣州市屈臣氏有限責任公司）；RNAeasy?病毒RNA抽提試劑盒（批號：113020210318，上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物

無特定病原體（SPF）級ICR 小鼠380 只，體質量13～15、14～16、18～20 g，雌雄各半；SPF 級SD大鼠60只，體質量180～200 g，雌雄各半；均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006；實驗動物的使用在中國中醫科學院中藥研究所動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0041]進行。抗病毒、抑菌實驗動物飼養于ABSL-2 級生物安全室，其他實驗動物飼養于屏障環境。實驗方案實施前獲得中國中醫科學院中藥研究所實驗動物管理和使用委員會的審核與批準，批準號：2021B193。

1.3 菌株

甲型流感病毒鼠肺適應株FM1，購自中國預防醫學科學院病毒學研究所，本實驗室傳代后保存于-80℃冰箱備用。金黃色葡萄球菌標準株26112-9、肺炎鏈球菌標準株31001-9a1、乙型溶血性鏈球菌標準株CMCC（B）32210-5a2-238 購自中國食品藥品檢定研究院中國醫學細菌保藏管理中心。

1.4 儀器

-80 ℃超低溫冰箱（中國海爾集團公司）；XSP-9CA型顯微鏡（上海光學儀器一廠）；7 X1型實驗室用打孔器（長征化學試劑公司）；AL104 型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多科技（中國）有限公司]；MC-347型電子體溫計（歐姆龍健康醫療中國有限公司）；JC-WGZ-2XJ（P）型細菌濁度計（青島聚創時代環保技術有限公司）；ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）；HT190R 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

2 方法

2.1 劑量設計

CGG 的臨床用量為一次14 g（含原藥材25 g；含對乙酰氨基酚168 mg、咖啡因12 mg、馬來酸氯苯那敏2.68 mg），一日3 次，即日用量為42 g。CM藥部分為對乙酰氨基酚-咖啡因-馬來酸氯苯那敏（168∶12∶2.68）比例純水混合均勻。TCM 部分稱取金銀花74 g、五指柑296 g、野菊花221 g、三叉苦371 g、南板藍根221 g、崗梅596 g，加水煎煮2次，第1 次加藥材4 倍量的純凈水，煎煮2 h，第2次加藥材3 倍量的純凈水，煎煮1.5 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至體積分數為60%～65%，攪勻，靜置，濾過，濾液濃縮成稠膏，后期按照實驗動物等效劑量以純水稀釋灌胃。

按實驗動物與人體表面積比等效劑量折算，小鼠等效劑量的2 倍折合為CGG 10.92 g·kg-1（以臨床用量一次14 g 計）、TCM 19.50 g·kg-1（以原藥材25 g 計）、CM（對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏分別為131.04、9.36、2.09 mg·kg-1）；大鼠等效劑量的2 倍折合為CGG 7.56 g·kg-1（以臨床用量一次14 g 計）、TCM 13.50 g·kg-1（以原藥材25 g計）、CM（對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏分別為90.72、6.48、1.45 mg·kg-1）。體外實驗以無菌水配制成質量濃度為1000 mg·mL-1的CGG、CM、TCM 組藥樣，隔水煮10 min 滅菌，上清液經0.22μm過濾器濾過。

磷酸奧司他韋膠囊成人每次75 mg，每日2 次，連續服用5 d，按實驗動物與人體表面積比進行折算，小鼠臨床等效劑量的2 倍為39 mg·kg-1。鹽酸莫西沙星片臨床日用量為0.5 g，按實驗動物與人體表面積比等效劑量折算，小鼠等效劑量的2 倍為0.104 g·kg-1。阿司匹林維生素C 泡騰片臨床日用量不超過1.6 g，按實驗動物與人體表面積比等效劑量折算，大鼠等效劑量為的2倍折合為0.144 g·kg-1。布洛芬顆粒臨床日用量不超過0.8 g，按實驗動物與人體表面積比等效劑量折算，小鼠等效劑量的2 倍為0.21 g·kg-1。

2.2 流感病毒實驗

2.2.1 對流感病毒致小鼠病毒性肺炎的影響 取健康SPF 級ICR 小鼠60 只，體質量13～15 g，隨機分為對照組、模型組、CGG 組、CM 組、TCM 組、陽性藥磷酸奧司他韋膠囊組，每組10 只，雌雄各半。除對照組外，其余各組小鼠以乙醚吸入輕度麻醉，用流感病毒鼠肺適應株FM1 溶液（0.05 mL/只）滴鼻感染小鼠，制備小鼠流感病毒性肺炎模型。感染當天開始各組分別灌胃給藥，對照組和模型組灌胃給予同體積的純凈水（按體質量計20 mL·kg-1），每天1 次，連續給藥5 d。第6 天稱小鼠體質量后，乙醚吸入麻醉，解剖，摘取肺稱質量，置于無菌無RNA 酶的離心管中，凍存于液氮中。分別按公式（1）和（2）計算肺指數和肺指數抑制率，結果采用組間比較t檢驗進行統計學處理。

基于美國國家生物技術信息中心（NCBI）和PrimerBank 數據庫獲得流感病毒H1N1 基因序列的上下游引物分別是5′-GACCAATCCTGTCAC CTCTGAC-3′和5′-GGGCATTTGGACAAACGTCT ACG-3′。稱取同質量的不同組肺組織后，使用RNAeasy?病毒RNA 抽提試劑盒提取肺組織樣品中病毒RNA，采用反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法擴增，檢測各組提取的病毒RNA 擴增后的病毒載量，即每微升互補脫氧核糖核酸（cDNA）的拷貝數。

2.2.2 對流感病毒感染致小鼠死亡的影響 取健康SPF級ICR小鼠170只，雌雄各半，體質量13～15 g，隨機分為對照組（20 只）、模型組、CGG 組、CM組、TCM 組、陽性藥磷酸奧司他韋膠囊組，每組30只，雌雄各半。除對照組外，其余各組小鼠以乙醚吸入輕度麻醉，用流感病毒鼠肺適應株FM1 溶液（0.05 mL/只）滴鼻感染小鼠，對照組滴鼻0.9%氯化鈉溶液。感染當天開始灌胃給藥，對照組和模型組灌胃給予同體積純凈水（20 mL·kg-1），每天1次，連續5 d。觀察14 d內小鼠死亡情況，記錄小鼠存活時間，按公式（3）～（5）計算小鼠存活時間延長率、死亡率及死亡抑制率。小鼠存活時間以t檢驗進行組間比較，死亡率以χ2檢驗進行組間比較。

2.3 抑菌實驗

2.3.1 體內抑菌實驗 取健康SPF 級ICR 小鼠100只，體質量14～16 g，隨機分為模型組、CGG組、CM組、TCM組、陽性藥鹽酸莫西沙星片（104 mg·kg-1）組，每組20 只，雌雄各半。將增菌18 h 的金黃色葡萄球菌臨床分離株，比濁至1.2×109個/mL，再以5%的酵母稀釋100 倍。感染前2 d 各組分別灌胃給予相應藥物，模型組灌胃給予相同體積的純凈水（按體質量計20 mL·kg-1），每天1 次，連續5 d。給藥第3 天腹腔注射金黃色葡萄球菌（0.5 mL/只）造模。于感染24 h 起至感染后72 h 觀察記錄動物死亡情況，并按公式（5）計算死亡抑制率，以χ2檢驗進行統計學處理。

2.3.2 體外抑菌和殺菌實驗 實驗前1 d 將金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌分別接種于肉湯培養基中增菌培養16 h 過夜。實驗時在96孔細胞培養板中，先加肉湯培養基100 μL/孔。于各板第1行分別加CGG、CM、TCM組藥樣100 μL/孔，混勻，每孔分別吸取100 μL 下移第2 行，同樣混勻下移，如此反復，稀釋至5個質量濃度，分別為500、250、125、62.5、31.25 mg·mL-1。平行做陽性對照藥鹽酸莫西沙星片（質量濃度為4 mg·mL-1）及不加菌的藥樣對照及培養基對照。將過夜增菌后的各細菌比濁至麥氏1號管（3.0×108個/mL），稀釋100倍后，分別吸取10 μL 加入培養基對照組、CGG 組、CM組、TCM 組、陽性藥鹽酸莫西沙星組。向各板中補加肉湯100 μL/孔。將各板置于37 ℃培養24 h 后，觀察每組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌生長狀況，無細菌生長的藥物最低濃度管，即為最低抑菌濃度（MIC）。從MIC 孔中分別吸取5 μL 轉種于瓊脂培養板中，置于37 ℃培養24 h 后，鏡下觀察有無細菌生長，以培養皿中計數少于5 個菌落作為最低殺菌濃度（MBC）。

2.4 解熱實驗

選取健康SPF 級SD 大鼠60 只，雄性，體質量180～200 g，進行適應性飼養，實驗前3 d，每天測動物肛溫1次。實驗前禁食16 h，實驗當日晨測動物肛溫2次為基礎肛溫。用15%酵母溶液背部皮下注射致熱（0.02 mL·g-1）。4 h 后測肛溫，升高0.8 ℃以上者用于實驗，隨機分為模型組、CGG 組、CM 組、TCM 組和陽性藥阿司匹林維生素C 泡騰片組，每組12 只。各組分別灌胃給藥，模型組灌胃給予相同體積的純凈水（10 mL·kg-1）。給藥后1、2、3、4 h 各測肛溫1次，以不同時間所測肛溫與基礎肛溫之差值作為體溫變化的指標，以t檢驗進行統計學處理。

2.5 抗炎實驗

取健康SPF 級ICR 小鼠50 只，體質量18～20 g，按體質量隨機分組，分別為模型組、CGG 組、CM組、TCM組和陽性藥布洛芬顆粒組，每組10只，雌雄各半。各組分別灌胃給予相應藥物，模型組灌胃給予相同體積的純凈水（20 mL·kg-1），CGG、CM、TCM 組每天給藥1次，連續給藥7 d，陽性藥布洛芬顆粒在第6、7天各給藥1次。末次藥后30 min，每只以2%巴豆油70 μL涂于右耳前后兩面，左耳作對照，致炎后4 h 將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用打耳器（8 mm）在同一部位分別沖下耳片，電子天平稱質量，計算左右耳片的質量差（即耳腫脹值），以t檢驗進行組間比較，并按公式（6）計算抑制率。

2.6 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，實驗數據以（±s）表示，以t檢驗或者χ2檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 流感病毒抑制實驗

3.1.1 對體質量和肺指數的影響 由表1 可知，小鼠感染流感病毒后，模型組小鼠體質量明顯低于對照組（P＜0.01），肺指數值明顯高于對照組（P＜0.01），表明造模成功。

表1 CGG對小鼠流感病毒性肺炎的影響（±s, n=10）

表1 CGG對小鼠流感病毒性肺炎的影響（±s, n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與CGG比較，$P＜0.05；CM組劑量為對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏各131.04、9.36、2.09 mg·kg-1；表2～5同。

CGG、TCM 和磷酸奧司他韋膠囊組小鼠體質量較模型組明顯提高（P＜0.01）；CGG、CM 和TCM組小鼠肺指數值較模型組明顯降低（P＜0.05），與模型組相比差異有統計學意義，表明CGG、CM 和TCM 對流感病毒引起的小鼠病毒性肺炎具有抑制作用；且CGG 效果優于CM、TCM，提示中藥和化學藥發揮了協同作用。

3.1.2 對病毒載量的影響 小鼠感染流感病毒后，模型組肺組織中病毒載量明顯高于對照組（P＜0.01），CGG、TCM、CM 組和磷酸奧司他韋膠囊組可明顯降低肺組織中病毒載量（P＜0.05），與模型組比較差異有統計學意義。結果見表2。

表2 CGG對小鼠病毒性肺炎病毒載量的影響（±s, n=10）

表2 CGG對小鼠病毒性肺炎病毒載量的影響（±s, n=10）

3.1.3 對流感病毒感染致小鼠死亡的影響 小鼠感染流感病毒后，模型組的存活天數平均值為8.0±1.0，CGG、TCM 和磷酸奧司他韋膠囊組小鼠存活時間較模型組明顯延長，與模型組比差異有統計學意義（P＜0.05）；CGG 組小鼠存活時間長于TCM 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表3。

表3 CGG對病毒感染致小鼠存活時間的影響（±s）

表3 CGG對病毒感染致小鼠存活時間的影響（±s）

模型組小鼠死亡率達到100%，CGG 和磷酸奧司他韋膠囊組對流感病毒感染致小鼠死亡率較模型組明顯降低，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表4。

表4 CGG對病毒感染致小鼠死亡率的影響

3.2 抑菌實驗

3.2.1 體內抑菌實驗 腹腔注射金黃色葡萄球菌后，模型組小鼠死亡率可達100%，CGG、CM 組小鼠死亡率低于模型組，但與模型組相比差異無統計學意義。結果見表5。

表5 CGG對細菌感染小鼠死亡的保護作用（n=20）

3.2.2 體外抑菌和殺菌實驗 肉眼觀察陽性藥鹽酸莫西沙星片組（質量濃度為4 mg·mL-1）中金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型鏈球菌均無生長，說明其有抑菌和殺滅菌作用。CGG、TCM 對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌標準株均顯示出抑制和殺滅作用。結果見表6。

表6 CGG的抑菌實驗結果mg·mL-1

3.3 解熱實驗

CGG 和CM 組在給藥后1、2 h 可顯著抑制酵母致大鼠發熱反應，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01），表明CGG 和CM 具有解熱作用。結果見表7～8。

表7 CGG對酵母致大鼠發熱的影響（±s, n=12）

表7 CGG對酵母致大鼠發熱的影響（±s, n=12）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與CGG比較，$P＜0.05；CM組劑量為對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏各90.72、6.48、1.45 mg·kg-1；表8～9同。

3.4 抗炎實驗

CGG、CM、TCM 組的耳腫脹值明顯低于模型組，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；表明CGG、CM、TCM均具有抗炎作用。結果見表9。

表9 CGG對巴豆油致小鼠耳腫脹的影響（±s, n=10）

表9 CGG對巴豆油致小鼠耳腫脹的影響（±s, n=10）

4 結論

現代醫學認為感冒為多種病原體引發的急性上呼吸道感染，可引發鼻、咽、喉、扁桃體等黏膜充血水腫，上皮細胞破壞、漿液、黏液及膿液滲出產生鼻塞、咳嗽等上呼吸道炎性癥狀，并有頭痛、惡寒發熱等全身癥狀[2-3]。中醫認為感冒多見肺熱亢盛，可出現肺失宣肅，甚至肺氣郁閉的病理變化，疾病發展至后期又可出現肺之氣陰耗傷或痰瘀阻滯肺絡。中醫治療具有辨證論治的理念與方法：邪犯肺衛時，主以疏表透邪，并注意配合清宣肺熱；肺熱亢盛時，主以清宣肺熱；肺氣郁閉較甚者，則主宣肺、瀉肺[4]。

CGG 是由中藥和化學藥配伍組成的復方制劑，其中對乙酰氨基酚作為最常用的解熱鎮痛藥之一，對發熱、咽痛、全身酸痛等效果明顯，且安全性高；馬來酸氯苯那敏為第一代抗組胺藥，有抗過敏、抗膽堿能作用，能有效緩解咳嗽、噴嚏、流涕等癥狀；咖啡因既能加強解熱鎮痛藥的療效，又能緩解抗組胺藥所引起的嗜睡作用[5]。山銀花具有清熱解毒、涼散風熱的功效[6]；五指柑具有解表清熱、利濕除痰、止咳平喘等功效[7]；野菊花具疏散風熱、消腫解毒的功效[8]；三叉苦可用于治療熱病高熱不退、咽喉腫痛等[9]；南板藍根可用于溫疫時毒、發熱咽痛等病癥[10]；崗梅有清熱解毒、生津活血的功效，主治熱病、燥渴、咳血、喉痛等癥[11]。上述多種成分協同起效，共同作用于機體，具有抗感冒作用。

通常流感病毒感染機體后，機體生存狀態降低，體質量下降，并可引起肺部水腫、炎性滲出、充血等病理改變，這些病理改變均可使肺部質量增加，從而導致肺指數值增高，故通常以肺指數值大小來表示肺部病變的嚴重程度[12]。研究中發現小鼠感染流感病毒后，CGG 給藥組體質量較模型組明顯提高，給藥組肺組織中病毒載量較模型組明顯降低；CGG、CM、TCM 組小鼠的肺指數抑制率分別為19.68%、8.30%、8.54%；各組存活時間較模型組明顯延長，其延長率分別為29.6%、5.4%、12.9%；病毒感染致小鼠死亡抑制率分別為26.7%、0、10.0%。表明CGG 對流感病毒引起的小鼠病毒性肺炎具有抑制作用，且CGG 效果優于TCM、CM，提示TCM和CM發揮了協同作用。

表8 CGG給藥后不同時間對酵母致大鼠發熱的影響（±s, n=12）

感冒還會引起的細菌性呼吸道感染，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型鏈球菌[13-14]的感染，在體內抑菌實驗中，腹腔注射金黃色葡萄球菌后，給藥組小鼠死亡率低于模型組，CGG、CM、TCM 對小鼠的死亡抑制率分別10.0%、15.0%、0，但與模型組相比差異無統計學意義。體外抑菌和殺菌實驗中，CGG 和TCM 對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌標準株均顯示出抑制和殺滅作用。此外，發熱是感冒就診最常見的主訴癥狀之一，解熱實驗中發現CGG、CM組可在給藥后1、2 h可顯著抑制酵母致大鼠發熱反應，表明CGG 和CM 具有解熱作用。抗炎實驗中給藥組耳腫脹值明顯低于模型組，CGG、CM、TCM 組抑制率分別為31.7%、22.6%、26.8%，表明CGG、CM、TCM均具有抗炎作用。

綜上所述，CGG、CM 和TCM 均具有抗流感病毒作用和抗炎作用；CGG、TCM 對金黃色葡萄球菌等顯示出抑制和殺滅作用；CGG、CM 具有解熱作用。CGG 效果優于TCM、CM，提示TCM 和CM 發揮了協同作用。CGG 具有抗病毒、抑菌、解熱、抗炎等功效，可用于治療感冒引起的頭痛、發熱、鼻塞、流涕、咽痛等上呼吸道感染癥狀，本研究為臨床上應用CGG治療感冒提供參考。