天麻新品系“略麻-1號”選育及質(zhì)量評價(jià)△

王海峰，李曉東，付玉平，黃欽，李明，董林林，陳士林

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；2.大理大學(xué) 藥學(xué)院，云南 大理 671000；3.略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心，陜西 漢中 724300

天麻Gastrodia elataBl.是異養(yǎng)蘭科植物，無根、無綠色葉片，須與蜜環(huán)菌伴生[1]。其以干燥塊莖入藥，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和顯著的藥理活性[2]。現(xiàn)代研究表明，天麻主要含有天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、多糖、氨基酸等有效成分[3-4]，具有抗氧化[5]、抗抑郁[6-7]、抗衰老[8]、抗炎[9-11]、抗癲癇、抗驚厥[12-14]、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜[15-16]等藥理作用。2019 年11 月25日，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合下發(fā)了《關(guān)于對黨參等9 種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知》，為天麻食品開發(fā)提供了政策依據(jù)。

隨著市場需求不斷增大，野生天麻被過度采挖，導(dǎo)致其野生種質(zhì)資源日益匱乏，甚至瀕臨滅絕，人工栽培已成為天麻的主要來源[17]。在集中栽培、異地栽培等過程中，天麻種群變異和退化問題嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約天麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[18]。其栽培過程中易遭受雜菌感染或腐爛病等危害，導(dǎo)致表皮潰爛、生長受阻、產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣[19]。因此，選育抗病強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)、退化弱、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種是保障天麻產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。

陜西省略陽縣是我國天麻傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)之一，全縣地存天麻10 000畝（1畝≈666.67 m2）500萬窩，年可產(chǎn)麻種2000 t，商品干天麻超過1000 t。2006年以來，“略陽天麻”先后通過國家食品藥品監(jiān)督管理局《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（以下簡稱GAP）認(rèn)證和國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品認(rèn)證，已成為當(dāng)?shù)氐奶厣еa(chǎn)業(yè)，在脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興工作中發(fā)揮了重要作用。但是，該地區(qū)也面臨栽培品種退化和優(yōu)質(zhì)天麻新品種匱乏的問題，本課題組利用略陽縣豐富的天麻種質(zhì)資源優(yōu)勢，經(jīng)過多年的系統(tǒng)選育，培育出紅天麻“略麻-1 號”（ZYXP-2020-006），并在陜西、湖北等地進(jìn)行推廣。本研究以“略麻-1號”和安徽紅天麻為研究對象，通過對“略麻-1 號”性狀、產(chǎn)量、有效成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，為優(yōu)質(zhì)天麻生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 樣品

野生天麻（RYB-1）、蜜環(huán)菌（Am-23-4）、萌發(fā)菌（GSF-8104）均由陜西漢王略陽中藥科技有限公司提供。“略麻-1 號”和安徽紅天麻均為質(zhì)量200～250 g、無病蟲害、體型完整、頂芽飽滿完整的箭麻。“略麻-1 號”、安徽紅天麻及RYB-1 經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所趙慶賀副研究員鑒定為紅天麻Gastrodia elataBI.f.elata。

1.2 儀器

ME203E/02 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；5425R 型離心機(jī)（德國Eppendorf）；B-220 型恒溫水浴鍋、RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200V 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DGG-9070B 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；FW200 型高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；Arc 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）。

1.3 試藥

對照品天麻素（批號：M11GB148059，純度＞98%）、對羥基苯甲醇（批號：R09D8X50333，純度≥98%）均購于上海源葉生物技術(shù)有限公司；D（+）-無水葡萄糖對照品（批號：1122A0231，純度≥98%）、牛血清白蛋白（BSA，批號：809A052，純度≥96%）、考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液均購于北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、濃硫酸、85%磷酸均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；甲醇（色譜純，北京化工廠）；水為屈臣氏純凈水。

2 方法

2.1 選育過程

RYB-1 采挖于略陽縣白水江鎮(zhèn)的林地（E106°01′14″，N33°26′25″，海拔1 267.26 m），通過人工有性繁殖，對RYB-1 進(jìn)行自交選育，獲得“略麻-1號”種莖（圖1）。選育過程中淘汰箭麻質(zhì)量＜100 g、抽薹生育期＜50 d、每穗蒴果直徑＜30 cm 的天麻繁殖材料，將后代性狀不一致的材料按選育標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行淘汰，將符合目標(biāo)性狀的箭麻再進(jìn)行自交，將2 代箭麻按目標(biāo)進(jìn)行選育，獲得3 代自交選育的穩(wěn)定紅桿品種，將此品種進(jìn)行田間試驗(yàn)，觀察其性狀、生物學(xué)特性、病蟲害發(fā)生情況，并檢測產(chǎn)量、天麻素等藥用成分含量。選育過程中種植地均為砂壤，pH 為6.8，年均降雨量為850 mm，大田栽培，夏季遮陽，田間種植按中藥材GAP進(jìn)行常規(guī)管理。

圖1 “略麻-1號”選育流程

2.2 品種測試

按中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南天麻》（NY/T 2593—2014）[20]規(guī)定進(jìn)行，測試周期為箭麻開始萌動(dòng)，經(jīng)過抽薹、開花到成熟的生長過程。在室內(nèi)進(jìn)行以筐栽人工授粉方式種植，溫度為20～25 ℃，相對濕度為60%～80%。選取與測試品種接近的品種作為對照品種，根據(jù)“略麻-1號”形態(tài)特性選擇近似品種安徽紅天麻作為對照。選育品種及對照組每個(gè)品種均種植60個(gè)。

2.3 田間試驗(yàn)

以五龍洞鎮(zhèn)中川壩（N33°30′40.19″、E106°51′13.07″，海拔1000 m，土壤pH 6.7，砂壤土）為實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行天麻大田栽培試驗(yàn)。3 月初室內(nèi)育種，開展品種測試，5月大田栽培。大田栽培步驟：1）先做畦，畦寬約0.7 m，長度依據(jù)地形規(guī)劃，按上下2層共10根棒為1窩（約0.5 m2）標(biāo)準(zhǔn)（每窩天麻蒴果10 個(gè)，600 mL 蜜環(huán)菌和萌發(fā)菌瓶各1 瓶，櫟類青岡樹10根，直徑6 cm，長50 cm，有魚鱗口，大小比較均一）；2）拌種，將萌發(fā)菌與天麻種子輕輕攪拌均勻；3）播種，將拌好的含天麻種子的萌發(fā)菌葉均勻地撒在鋪滿濕樹葉的畦底，再將5 根樹棒均勻放上，間距4～6 cm，在樹棒兩側(cè)與魚鱗口處均勻擺放蜜環(huán)菌數(shù)節(jié)，覆蓋濕砂土，同樣方法種植第2 層，最后將砂土填成龜背狀，按照中藥材GAP 進(jìn)行常規(guī)管理。選育品種與對照品種每20 m2小區(qū)作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)品種3 個(gè)重復(fù)。種植150 d 后，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取3 窩觀察種莖生長狀況。17個(gè)月后隨機(jī)選取3窩統(tǒng)計(jì)折干率、有效成分含量及產(chǎn)量，將收集到的新鮮天麻樣品分別洗凈、烘干、趁鮮切薄片，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱（45 ℃）干燥，將烘干的樣品用高速萬能粉碎機(jī)打成粗粉（過三號篩）備用。

2.4 樣品檢測

2.4.1 樣品處理及折干率測定方法 按參考文獻(xiàn)[21]測定天麻折干率，將采挖鮮天麻洗凈，晾干表面水分，測定鮮質(zhì)量，蒸至透心，放冷后置55 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱烘至4～5成干，取出，回潮12 h，繼續(xù)干燥、回潮重復(fù)多次至恒重，按公式（1）計(jì)算折干率。

2.4.2 天麻素和對羥基苯甲醇含量測定 按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版天麻項(xiàng)下高效液相色譜法測定天麻素和對羥基苯甲醇的總量[22]。

2.4.3 多糖含量測定 按參考文獻(xiàn)[23]苯酚-硫酸法測定天麻多糖含量，標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取D（+）-無水葡萄糖對照品10 mg（105 ℃干燥至恒重），加入蒸餾水，制成0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚1 mL，搖勻后加濃硫酸5 mL，搖勻，蒸餾水定容，于40 ℃水浴保溫10 min，冷卻至室溫后測定490 nm 處吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取天麻樣品粉末1.00 g，加入80%乙醇25 mL，60 ℃浸泡2 次，每次30 min，濾過，低溫烘干，加入去離子水200 mL，50 ℃超聲提取40 min，得天麻多糖提取液。將天麻多糖提取液2 mL 稀釋5 倍，吸取0.2 mL 于試管中加蒸餾水至2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，測定490 nm吸光度值。

2.4.4 蛋白質(zhì)含量測定 按參考文獻(xiàn)[24]考馬斯亮藍(lán)染色法測定天麻蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取BSA 100 μL 加入PBS 緩沖液2.4 mL中，稀釋至終質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1。準(zhǔn)備6 支干凈試管，編號。分別吸取0、100、200、300、400、500μL BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次添加磷酸鹽緩沖液（PBS）500、400、300、200、100、0 μL，加入1×G-250染色液5 mL，反應(yīng)3 min后在波長595 nm處測定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液制備及蛋白質(zhì)含量測定：取天麻粉末2.00 g，加入去離子水100 mL，在沸水浴條件下提取2 次，每次126 min，濾過，合并濾液，即得天麻蛋白質(zhì)溶液。精密量取適量稀釋的樣品溶液0.5 mL，加入1×G-250染色液5 mL反應(yīng)3 min后在波長595 nm處測定吸光度值。

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 “略麻-1號”花莖及花的性狀

“略麻-1號”花莖顏色為橙紅色，花莖平均高度為125.10 cm，比安徽紅天麻高33.8%；花莖平均粗度為12.01 mm；花序軸長平均為41.73 cm，比安徽紅天麻高86.29%；花被筒平均長度為10.08 mm，寬度平均為6.57 mm，長寬比平均為1.53，花子房長度平均為9.79 mm。與對照品種安徽紅天麻相比，“略麻-1號”花莖高和花序軸較長（圖2～3）。

圖2 安徽紅天麻和“略麻-1號”花莖

圖3 安徽紅天麻和“略麻-1號”花莖及花的性狀（±s, n=60）

3.2 “略麻-1號”果實(shí)性狀

“略麻-1號”果實(shí)為紅褐色，長度平均為25.17 mm，寬度平均為7.21 mm，長寬比平均為3.49，其長度、寬度比安徽紅天麻分別高25.10%、2.70%；單個(gè)果實(shí)鮮質(zhì)量平均為0.72 g，比安徽紅天麻高63.64%；每株果實(shí)數(shù)量平均為62 個(gè)，比安徽紅天麻多12.72%。與安徽紅天麻相比，“略麻-1號”果實(shí)長且寬，鮮質(zhì)量大，單株數(shù)量多（圖4）。

圖4 安徽紅天麻和“略麻-1號”果實(shí)性狀（±s, n=60）

3.3 “略麻-1號”種莖及箭麻性狀

“略麻-1 號”種莖短粗成子彈狀，色澤黃白色，無蜜環(huán)菌纏繞；箭麻病蟲害少，呈扁平狀或長筒狀，平均長138.41 mm、寬60.93 mm，環(huán)紋清晰。安徽紅桿箭麻較細(xì)長，環(huán)紋較淺，平均長137.04 mm、寬47.50 mm（圖5～7）。

圖5 安徽紅天麻和“略麻-1號”的種莖

3.4 “略麻-1號”品質(zhì)分析

“略麻-1號”折干率適中，為14.31%，其天麻素和對羥基苯甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為0.42%，比安徽紅天麻提高了35.48%。“略麻-1號”多糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.60%、6.07%，與安徽紅天麻差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 安徽紅天麻和“略麻-1號”的箭麻

圖7 安徽紅天麻和“略麻-1號”的長度及寬度（±s, n=60）

3.5 “略麻-1號”產(chǎn)量分析

“略麻-1號”天麻總產(chǎn)量及白麻產(chǎn)量均顯著高于安徽紅天麻。“略麻-1號”平均單窩產(chǎn)量為2 495.50 g，安徽紅天麻平均單窩產(chǎn)量為1 235.55 g，總產(chǎn)量提高了101.97%。“略麻-1號”箭麻、白麻平均單窩產(chǎn)量分別為1 240.50、1 269.00 g，比安徽紅天麻提高了48.92%、180.96%。

4 討論

天麻種植方式一般為無性繁殖和有性繁殖，無性繁殖見效快，但長期無性繁殖易導(dǎo)致天麻種性退化、病害嚴(yán)重，產(chǎn)量及品質(zhì)下降[25-26]；有性繁殖有效克服無性繁殖種性退化問題，同時(shí)為定向培育優(yōu)質(zhì)種麻提供有效途徑[27]。天麻選育過程中，利用有性繁殖技術(shù)并通過雜交或自交育種技術(shù)可培育無退化、產(chǎn)量高、品質(zhì)好的天麻品種[28-29]。天麻蒴果數(shù)越多，單蒴果質(zhì)量越大，種子數(shù)越多[27]，更有利于天麻種子培育和有性繁殖。隨著天麻大面積栽培，病蟲害問題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致天麻品質(zhì)變劣、產(chǎn)量降低甚至絕收[30-31]。因此，選育抗病性強(qiáng)的天麻新品種是防治病害、提高產(chǎn)量的有效途徑之一。高產(chǎn)高含量的天麻新品種也陸續(xù)選育成功，如高產(chǎn)新品種“鄂天麻1號”“鄂天麻2號”[32-33]。

本研究通過人工授粉有性繁殖，多代自交選育獲得優(yōu)質(zhì)新品系“略麻-1 號”，與安徽紅天麻相比，“略麻-1號”花莖高且粗，花序軸長（41.73 cm）且花序多；果實(shí)長且寬、鮮質(zhì)量大（0.72 g）且數(shù)量多；種莖短粗呈子彈狀，色澤黃白色，無蜜環(huán)菌纏繞，無退化現(xiàn)象。“略麻-1號”病蟲害少且總產(chǎn)量提高101.97%，天麻素與對羥基苯甲醇總含量比《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的含量高了68%。結(jié)果表明，“略麻-1號”抗病強(qiáng)、產(chǎn)量高、藥用成分含量高、繁殖力強(qiáng)且種莖無退化現(xiàn)象，為天麻種植提供優(yōu)質(zhì)的種源。“略麻-1號”選育及推廣可為優(yōu)質(zhì)商品天麻提供重要種質(zhì)資源，實(shí)現(xiàn)天麻增產(chǎn)增收，促進(jìn)天麻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。