Box-Behnken響應面法優(yōu)化六神曲兩優(yōu)勢菌協(xié)同發(fā)酵工藝△

王舒玉，阮明月，栗園林，詹雪艷

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488

六神曲（MMF），又名神曲、六曲，是目前廣泛應用于臨床配伍的發(fā)酵類中藥。其多由面粉、麥麩、苦杏仁、赤小豆按一定比例混合，加入青蒿、辣蓼、蒼耳草的水煎液，在適宜的溫濕度下發(fā)酵一定天數(shù)而成，具有消食和中、健脾暖胃的功效[1]。

六神曲并未被歷版《中華人民共和國藥典》收載，其制備工藝可參考部頒標準和地方炮制規(guī)范。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，是否添加麥麩、赤小豆是否進行預發(fā)酵、青蒿等3 種中藥的比例、發(fā)酵溫濕度等部頒標準與各地方規(guī)范差異較大，無統(tǒng)一標準，市場上不同產地或同一產地不同廠家的六神曲質量差異也比較明顯[2-4]。

傳統(tǒng)的六神曲發(fā)酵是在非密閉的自然條件下進行，微生物的種類和數(shù)量受到環(huán)境、原料、溫濕度等條件影響，容易造成發(fā)酵結果不一致，不同批次間六神曲的穩(wěn)定性不好，且自然發(fā)酵過程中存在其他微生物，如黃曲霉、雜色曲霉等[5]。黃曲霉和雜色曲霉經過代謝后會產生有害的代謝產物，影響六神曲的食用安全性。陳彥琳等[6]對六神曲發(fā)酵過程中的霉菌、酵母菌和細菌進行動態(tài)監(jiān)測，觀察其演替變化，發(fā)現(xiàn)扣囊復膜孢酵母Saccharomycopsis fibuligera和米根霉Rhizopus oryzae從發(fā)酵開始17 h 后成為優(yōu)勢菌種，直至發(fā)酵結束[6]。

本研究擬在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第19 冊中六神曲組方基礎上，利用米根霉、扣囊復膜孢酵母協(xié)同六神曲的自然發(fā)酵過程，以蛋白酶活力和淀粉酶活力為評價指標，通過Box-Behnken 響應面法優(yōu)化篩選六神曲兩菌協(xié)同發(fā)酵工藝。

1 材料

1.1 儀器

KS 3000 i control 型控溫搖床［艾卡（廣州）儀器設備有限公司］；JJ-1A 型數(shù)顯增力電動攪拌器（金壇區(qū)西城新瑞儀器廠）；JA2003B 型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；ME155DU型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Epoch型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；DZF-6030A 型真空干燥箱、LHS-50CL 型恒溫恒濕箱、DKZ 型系列電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；96 孔細胞培養(yǎng)板（美國康寧公司）。

1.2 試藥

麥芽汁培養(yǎng)基（麥芽浸粉130.0 g·L-1、氯霉素0.1 g·L-1，杭州百思生物技術有限公司，批號：20211013）；酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（胨10 g·L-1、酵母浸出粉5 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1，北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20201102）；干酪素、可溶性淀粉、三氯乙酸、無水碳酸鈉（上海麥克林生化有限責任公司，批號分別為C10548279、C10650260、C10839900、C10753779）；福林酚試劑（北京酷來搏科技有限公司，批號：SL312125100）；氫氧化鈉［阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：C10542411］；3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：20210131）。

麥麩產自江蘇省宿遷市；面粉（金沙河面業(yè)集團有限責任公司，批號：BXT20211022）；青蒿、辣蓼、蒼耳草、苦杏仁、赤小豆均購自河北省安國市，經北京中醫(yī)藥大學楊瑤珺教授鑒定，青蒿為菊科植物黃花蒿Artmisia annuaL.的干燥地上部分，辣蓼為蓼科植物Polygonum flaccidumMeissn.的全草，蒼耳草為菊科植物Xanthium sibiricumPatr.的地上部分，苦杏仁為薔薇科植物東北杏Prunus mandshurica（Maxim.）Koehne 的干燥成熟種子，赤小豆為豆科植物赤小豆Phaseolus calcaratusRoxb.的干燥成熟種子；六神曲（實驗室自制）；商品六神曲（北京市某中藥飲片廠，批號分別為1706049、1707055、1708001、1807037、1808010、1907001、1907002、1907003、1907067）。

米根霉、扣囊復膜孢酵母（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號分別為3084、33177）。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 培養(yǎng)基的制備 取麥芽汁培養(yǎng)基13.01 g，加去離子水100 mL 溶解制得，用以培養(yǎng)米根霉；取酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基3.5 g，加去離子水100 mL溶解制得，用以培養(yǎng)扣囊復膜孢酵母。

2.1.2 種子液的制備 將米根霉接種于麥芽汁培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r·min-1條件下?lián)u培52 h進行活化，再接種于新配制的麥芽汁培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r·min-1的條件下?lián)u培，過程中動態(tài)監(jiān)測菌液的吸光度（A），達到約0.7時停止搖培，備用。

將扣囊復膜孢酵母接種于酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，在30 ℃、150 r·min-1的條件下?lián)u培24 h 進行活化，再接種于新配制的酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，在30 ℃、150 r·min-1的條件下?lián)u培，過程中動態(tài)監(jiān)測菌液的A，達到約0.7時停止搖培，備用。

2.1.3 固體基質的制備 在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第19 冊[7]六神曲處方基礎上準備了發(fā)酵軟材，將制備的軟材以200 g/份接入種子液，壓實制曲。

2.1.4 發(fā)酵自制六神曲 將制備的曲塊用濕潤的紗布包裹，放入恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，待六神曲表面遍布黃衣、聞之有陳腐氣，結束發(fā)酵，取出后低溫50～55 ℃烘干，貯存，備用。

2.2 樣品酶活力測定方法

采用福林酚比色法[8]測定蛋白酶活力，采用DNS分光光度法[9]測定淀粉酶活力。

2.3 發(fā)酵工藝單因素考察

2.3.1 發(fā)酵天數(shù)對酶活力的影響 將米根霉和扣囊復膜孢酵母種子液（1∶1）接種到固體基質中，總接種量為10%，在發(fā)酵溫度32 ℃、相對濕度95%的條件下發(fā)酵3、4、5、6、7 d，以每個樣品的蛋白酶活力和淀粉酶活力為指標，探索不同發(fā)酵天數(shù)對自制六神曲樣品的影響（圖1）。蛋白酶活力和淀粉酶活力均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，蛋白酶活力在第5 天達到峰值，而淀粉酶活力在第4 天達到峰值（P＜0.05），由于六神曲主要是消米、面食積，故以淀粉酶活力為優(yōu)先考慮的指標，自制六神曲的最佳發(fā)酵天數(shù)初步定為4 d。

圖1 發(fā)酵天數(shù)對六神曲酶活力的影響（±s, n=9）

2.3.2 總接種量對酶活力的影響 將米根霉和扣囊復膜孢酵母種子液（1∶1）接種到固體基質中，總接種量分別為1%、5%、10%、15%、20%、25%，在發(fā)酵溫度32 ℃、相對濕度95%的條件下發(fā)酵4 d，以每個樣品的蛋白酶活力和淀粉酶活力為指標，探索不同總接種量對自制六神曲樣品的影響（圖2）。蛋白酶活力隨總接種量的增加呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，在總接種量為15%時達到峰值之后基本持平（P＜0.05）。淀粉酶活力在總接種量1%～10%基本持平，在總接種量15%～20%時達到峰值，之后略有下降（P＜0.05）。綜合蛋白酶和淀粉酶的活力及經濟學角度綜合考量，自制六神曲的最佳總接種量初步定為15%。

圖2 總接種量對六神曲酶活力的影響（±s, n=9）

2.3.3 接種比例對酶活力的影響 將米根霉和扣囊復膜孢酵母種子液分別按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1 接種到固體基質中，總接種量分別為15%，在發(fā)酵溫度32 ℃、相對濕度95%的條件下發(fā)酵4 d，以每個樣品的蛋白酶活力和淀粉酶活力為指標，探索不同接種比例對自制六神曲樣品的影響（圖3）。蛋白酶活力和淀粉酶活力均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，蛋白酶活力在2∶1達到峰值，而淀粉酶活力在1∶2達到峰值（P＜0.05）。以淀粉酶活力為優(yōu)先考慮的指標，自制六神曲的最佳接種比例初步定為1∶2。

圖3 米根霉和扣囊復膜孢酵母種子液接種比例對六神曲酶活力的影響（±s, n=9）

2.3.4 發(fā)酵溫度對酶活力的影響 將米根霉和扣囊復膜孢酵母種子液1∶2 接種到固體基質中，總接種量分別為15%，在發(fā)酵溫度30、32、35、37 ℃，相對濕度95%的條件下發(fā)酵4 d，以每個樣品的蛋白酶活力和淀粉酶活力為指標，探索不同發(fā)酵溫度對自制六神曲樣品的影響（圖4）。蛋白酶活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在32 ℃達到峰值（P＜0.05），淀粉酶活力在30～32 ℃差異無統(tǒng)計學意義，之后呈上升趨勢，并在35 ℃時達到峰值，之后酶活力下降（P＜0.05）。以淀粉酶活力為優(yōu)先考慮的指標，自制六神曲的最佳發(fā)酵溫度初步定為35 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對六神曲酶活力的影響（±s, n=9）

2.4 Box-Behnken響應面試驗優(yōu)化篩選工藝

2.4.1 Box-Behnken 響應面試驗設計 工藝中多個單因素之間可能會存在交互作用，因此多個單因素的最優(yōu)水平組合的結果未必是最優(yōu)結果。響應面分析法是集數(shù)學和統(tǒng)計學方法于一體的實驗設計方法，用于確定最佳的多因素條件的組合。其中，最常用的是中心復合設計和Box-Behnken 設計，相比于中心復合設計，Box-Behnken 設計可以在相同的因素和水平條件下設計更少的試驗進行結果優(yōu)化，更為高效[10]。因此，本研究擬采用Box-Behnken 響應面法確定最佳發(fā)酵工藝。

以發(fā)酵天數(shù)（A）、總接種量（B）、接種比例（C）、發(fā)酵溫度（D）為影響因素，綜合考慮蛋白酶活力和淀粉酶活力，選擇單因素最優(yōu)水平及兩側與最優(yōu)水平有顯著性差異（P＜0.05）且非酶活力最高點的水平進行Box-Behnken響應面試驗，見表1。

表1 Box-Behnken響應面法優(yōu)化六神曲兩優(yōu)勢菌協(xié)同發(fā)酵工藝的因素水平

2.4.2 篩選結果 借用Design Expert 8.0.6 軟件，以綜合評分（Y）為評價指標，進行Box-Behnken 響應面試驗設計并進行發(fā)酵，之后對發(fā)酵樣品進行蛋白酶和淀粉酶的活力測定，對酶活力數(shù)據進行無量綱化處理后采用SPSSAU 在線進行CRITIC 權重法分權，計算Y[11-12]。CRITIC權重法計算結果顯示，蛋白酶活力和淀粉酶活力權重系數(shù)分別為0.474 2 和0.525 8，結果見表2。

表2 Box-Behnken響應面法優(yōu)化六神曲兩優(yōu)勢菌協(xié)同發(fā)酵工藝的試驗設計與試驗結果

借助Design Expert 8.0.6 軟件對4 個因素和Y進行數(shù)據擬合，得到預測模型Y=1.110 0+0.090 1A-0.079 2B -0.017 7C+0.109 7D -0.067 1AB -0.084 6AC-0.080 1AD+0.004 3BC+0.158 5BD+0.073 1CD-0.357 6A2-0.174 1B2-0.223 4C2-0.274 9D2。模型的F=4.28，P=0.005 1（P＜0.05），說明擬合的二次模型具有統(tǒng)計學意義。以失擬項作為評判模型與試驗差值大小的標準，P=0.178 6，說明該二次模型中不存在失擬因素，可以利用該二次模型來預測最優(yōu)的發(fā)酵工藝。

Box-Behnken 響應面模型預測的最優(yōu)發(fā)酵工藝：發(fā)酵天數(shù)為5.836 d，總接種量為13.621%，接種比例為1∶2，發(fā)酵溫度為32.437 ℃，Y為1.058。結合實驗操作情況，六神曲兩菌協(xié)同發(fā)酵的最優(yōu)工藝調整為發(fā)酵天數(shù)6 d，總接種量15%，接種比例1∶2，發(fā)酵溫度32.5 ℃。

2.4.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝驗證 在2.4.2 項下確定工藝下進行自制六神曲的發(fā)酵，制備3 批樣品，測定其蛋白酶活力和淀粉酶活力，去量綱化，處理后計算綜合得分，結果見表3。

表3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化六神曲兩優(yōu)勢菌協(xié)同發(fā)酵工藝的驗證試驗結果

由表3可知，在調整后的最優(yōu)工藝下發(fā)酵制備的3批六神曲蛋白酶活力平均值為359 μg·min-1·g-1，RSD為2.1%，淀粉酶活力平均值為25.9 mg·min-1·g-1，RSD 為1.7%，綜合評分的均值為0.963 6 分，RSD為1.8%。3 批自制六神曲蛋白酶與淀粉酶活力的RSD均小于3%，表明基于響應面優(yōu)化得到的六神曲兩菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)穩(wěn)定可控，可用于指導實際六神曲的生產。

2.5 自制六神曲和商品六神曲酶活力比較

在調整后的最優(yōu)工藝下發(fā)酵制備六神曲9 批，與來自北京市某中藥飲片廠的9 批商品六神曲進行蛋白酶和淀粉酶活力的測定，結果見表4～5。

表4 不同批次自制六神曲酶活力

由表4～5 可知，自制六神曲和商品六神曲的酶活力表征的數(shù)值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從樣品性狀來看，自制六神曲呈不規(guī)則小塊、表面微黃色、折斷面呈灰白色或微黃色、質脆、聞之有陳腐氣，符合《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第19 冊中對于六神曲的性狀描述，且批次間差異不大。而商品六神曲外觀上批次間的差異較大，有的表面遍布白衣、折斷面白色，有的表面則遍布黃衣、折斷面呈黃色、質脆、有發(fā)酵氣。測得9 批自制六神曲的蛋白酶活力和淀粉酶活力的RSD 分別為4.6%和1.1%；9 批商品六神曲蛋白酶活力和淀粉酶活力的RSD 分別為45.8%和8.3%。從趨勢來看，自制六神曲的蛋白酶和淀粉酶活力批間穩(wěn)定性較好。因此認為，通過優(yōu)勢菌的接種、溫濕度等發(fā)酵環(huán)境的工藝控制，可以實現(xiàn)制備六神曲的酶活力批次間趨于穩(wěn)定。

表5 不同批次商品六神曲酶活力

3 討論

目前，生神曲制備的地方標準對六神曲的制備工藝沒有統(tǒng)一要求，“適當?shù)臏囟群蜐穸取笔侵父鶕鞯胤阶匀话l(fā)酵過程中實時的溫濕度；發(fā)酵“數(shù)天”是指自然發(fā)酵過程中由于各地的溫濕度不同造成發(fā)酵的進度不同。因此，用發(fā)酵“數(shù)天”和傳統(tǒng)經驗的“白（黃）衣上遍”作為指導。但是，由于工藝條件不一致，導致同一標準自然發(fā)酵的商品神曲不同批次間酶活力不穩(wěn)定。針對這個問題，本研究選擇六神曲的優(yōu)勢菌種米根霉和扣囊復膜孢酵母進行接種，協(xié)同發(fā)酵。相比于傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，該方法加大了優(yōu)勢菌種的比例，提高了批次間淀粉酶、蛋白酶活力的穩(wěn)定性，為促進生六神曲的質量穩(wěn)定性提供了一種可行的發(fā)酵制備方法。

六神曲發(fā)酵過程中的菌群主要是細菌、酵母菌和霉菌。本研究在酵母菌和霉菌中各選擇了1 種優(yōu)勢菌，未選擇細菌。后續(xù)研究可進一步豐富發(fā)酵菌種，探索更多菌種組合的可能性及發(fā)酵過程中不同菌種可能發(fā)揮的協(xié)同作用，為六神曲發(fā)酵制備提供了菌種組合的借鑒。