基于統計學分析的寒喘祖帕顆粒HPLC指紋圖譜研究△

李柯翱，米爾扎提·麥麥提，張明惠，劉婷，蘇海娣，馬璇*

1.新疆奇沐醫藥研究院（有限公司），新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆維吾爾自治區藥品審評查驗中心，新疆 烏魯木齊 830011

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-300DB 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；AE-100 型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110831-200302、100080-200306、111610-201607、110731-201619，純度分別為91.5%、91.7%、93.1%和96.2%）；乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

寒喘祖帕顆粒（新奇康藥業股份有限公司，編號為S1～S12，批號分別為170860、170851、170931、170849、170862、170853、170863、170932、170861、170864、170956、170957）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸、甘草酸銨、甘草苷、蘆丁對照品適量，用甲醇溶解，稀釋成沒食子酸、甘草苷、甘草酸銨、蘆丁質量濃度分別為0.04、0.04、0.07、0.03 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱量寒喘祖帕顆粒3.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞后稱定錐形瓶質量，超聲30 min 后取出置于試驗臺，靜置至室溫后稱質量，用50%甲醇補足減失的質量，濾過，得續濾液，即得。

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件

Kromasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～30 min，15%～30%A；30～45 min，30%～40%A；45～60 min，40%～60%A；60～70 min，60%～64%A）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：220 nm；進樣量：10 μL。

公司各級管理人員變動頻繁，給“校企一體”教學模式的實施帶來一定困難，新到崗的經理、主管在一段時間后才能熟悉這種培養方式，所以實施過程中會出現一定時期的斷層。這種培養模式使校、企、學三方受益，公司人事變動對實施過程影響是暫時的，經過校企雙方努力，使“校企一體”教學模式得以順利實施。

2.2.2 方法學考察 精密度試驗：稱取寒喘祖帕顆粒1 份按2.1.2 項下方法制成供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件，連續進樣6 次，根據6 次測定結果，得到對應的色譜圖。在對應色譜圖中標示出所有共有峰，以甘草酸銨作為參照峰，計算圖譜中各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，RSD 均小于2%，表明儀器精密度較好。

重復性試驗：稱取同一批次的寒喘祖帕顆粒6份，按2.1.2項下方法制成供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件，6 份供試品溶液分別進樣，得到對應的色譜圖。在對應色譜圖中標出所有共有峰，以甘草酸銨為參照峰，以甘草酸銨的出峰時間及峰面積為1，計算圖譜中各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，RSD均小于3%，表明該方法重復性較好。

穩定性試驗：精密稱取寒喘祖帕顆粒1 份，按2.1.2 項下方法制成進樣供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，得到對應的色譜圖。在對應色譜圖中標示出所有共有峰，以甘草酸銨為參照峰，以甘草酸銨的出峰時間及峰面積為1，計算圖譜中各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，RSD 均小于3%，表明該方法在24 h內穩定。

2.2.3 共有峰的建立及鑒別 按2.1.2 項下方法精密稱取12 批寒喘祖帕顆粒樣品，制成供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件對各批供試品溶液進行測定，將所得的HPLC 色譜圖進行疊加、分析、對比。進一步確定寒喘祖帕顆粒指紋圖譜的共有模式圖，進行共有峰的標記。按2.1 項下方法制備對照品溶液，進樣得到對應的對照品溶液色譜圖，將其與供試品溶液色譜圖進行比對，根據保留時間確定共有峰，從光譜圖中再分析確定各色譜峰的最大吸收波長。本研究采用對照品對比法共計標示出4 個色譜峰，分別為沒食子酸，蘆丁、甘草苷、甘草酸銨。該指紋圖譜中有15 個峰（圖1）；混合對照品圖譜中1、5、7、13 號峰分別為沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨（圖2）；12 批寒喘祖帕顆粒樣品HPLC 疊加圖見圖3。

圖1 寒喘祖帕顆粒HPLC指紋圖譜共有模式圖

圖2 沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液的HPLC圖

圖3 12批寒喘祖帕顆粒的HPLC圖

2.2.4 相似度結果分析 將上述經HPLC 分析測定的12 批寒喘祖帕顆粒樣品得到的不同色譜圖導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件進行分析。在分析時，把其中1 批寒喘祖帕顆粒（批號：170853）的圖譜數據作為參照圖譜，按系統操作，采用平均數法生成對照指紋圖譜R，再進行12批寒喘祖帕顆粒色譜圖的相關分析，獲得12批寒喘祖帕顆粒樣品HPLC 指紋圖譜相似度結果，相似度為0.907～0.997（表1）。由表1可知，寒喘祖帕顆粒各批次間質量相對穩定，產品安全性較好。

表1 12批寒喘祖帕顆粒的相似度結果

2.2.5 樣品含量測定

2.2.5.1 線性關系考察 按2.1 項下方法制成沒食子酸、甘草苷、蘆丁、甘草酸銨質量濃度分別為0.16、0.16、0.16、0.40 mg·mL-1的混合對照品溶液，使用倍比稀釋法，加甲醇分別稀釋2、4、8、16、32倍，得6份質量濃度不同的混合對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄待測成分的色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），以進樣質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，計算線性回歸方程。結果顯示，沒食子酸、蘆丁、甘草苷和甘草酸銨在相應范圍內線性關系良好，見表2。

表2 沒食子酸、甘草苷、蘆丁、甘草酸銨的線性關系

2.2.5.2 方法學考察 精密度試驗：稱取寒喘祖帕顆粒樣品1 份，按2.1.2 項下方法制成供試品溶液。按2.2.1 項下色譜條件，連續進樣6 次，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為1.6%、1.8%、1.7%和1.6%。

重復性試驗：稱取同一批的寒喘祖帕顆粒樣品6份，按2.1.2項下方法制成供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件分別進樣，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨含量的RSD分別為1.8%、2.4%、2.5%和1.4%。

穩定性試驗：精密稱取寒喘祖帕顆粒樣品1 份，按2.1.2項下方法制成供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為1.9%、2.2%、2.1%和1.5%。

加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的同一批寒喘祖帕顆粒6份，按2.1項下方法制成供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，沒食子酸、蘆丁、甘草苷、甘草酸銨平均加樣回收率分別為96.26%、96.13%、95.87%和97.65%，RSD分別為1.9%、2.1%、2.3%和1.8%。

2.2.5.3 含測測定 取12批寒喘祖帕顆粒，按2.2.1項下條件下測定，計算4個成分的含量，結果見表3。

表3 寒喘祖帕顆粒中4個成分質量分數mg·g-1

2.3 化學模式識別分析

2.3.1 聚類分析 采用SPSS 23.0統計軟件對12批寒喘祖帕顆粒色譜數據進行處理，以歐式距離評分作為測量度，進行12批寒喘祖帕顆粒樣品系統聚類分析（圖4）。結果顯示，12 批寒喘祖帕顆粒大致分為3類，Ⅰ類包括S1～S2、S5～S12，Ⅱ類包括S4，Ⅲ類包括S3。聚類分析中聚為一類的表示相似性較好。

圖4 12批寒喘祖帕顆粒的聚類分析結果

2.3.2 主成分分析（PCA）采用SPSS 23.0 先對圖譜中各個共有峰的峰面積標準化處理，然后對12批寒喘祖帕顆粒樣品的15 個共有峰進行PCA，得出相關PCA 特征性及方差貢獻率。前2 個主成分累積方差貢獻率為80.675%，且特征根均大于1，提示這2個主成分能夠代表共有峰的大部分信息。從圖5可以看出，前2 個因子處在較為陡峭的斜率位置上，第3個因子斜率開始變得較為平緩，因此，選擇2個主成分因子進行分析。主成分載荷矩陣見表4，其反映了各變量對主成分的貢獻程度，主成分1 主要反映了4、6、7、8、10、11、13、14 號峰有較高的載荷值，7 號峰為甘草苷，13 號峰為甘草酸銨；主成分2 主要反映了3、5、9、12 號峰的信息，5 號峰為蘆丁。通過成分得分系數矩陣計算綜合得分，可以評價不同批號的整體質量，得分及排名見表5。

表4 寒喘祖帕顆粒樣品色譜峰主成分載荷矩陣

表5 12批寒喘祖帕顆粒主成分得分、綜合得分及排名

圖5 寒喘祖帕顆粒指紋圖譜PCA特征值的碎石圖

2.3.3 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）將12 批寒喘祖帕顆粒樣品共有峰的相對峰面積導入SIMCA-P 14軟件進行OPLS-DA，結果見圖6。OPLSDA模型得分圖顯示，寒喘祖帕顆粒樣品可很好地聚類為3類，與聚類分析、PCA結果一致。以模型變量重要性投影（VIP）值為指標，將能夠引起組間差異的成分進行分析，VIP圖可反映出每個峰的貢獻程度。VIP值＞1的色譜峰分別為13號峰（1.960 36）、6號峰（1.796 61）、1號峰（1.227 13）、7號峰（1.132 76），是引起寒喘祖帕顆粒批次間差異的主要標志性成分，其是區分樣品最關鍵的色譜峰，對樣品分類作用較大，見圖7。

圖6 12批寒喘祖帕顆粒樣品的OPLS-DA得分圖

圖7 寒喘祖帕顆粒樣品的VIP值結果（±s, n=12）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

寒喘祖帕顆粒中所含化學成分較多，性質也各不相同，為在色譜圖中更多地體現藥材中含有的化學成分信息[4,19]。本研究通過查閱大量文獻，最終選擇了以水與50%甲醇作為溶劑，用這2 種溶劑對樣品進行提取，得到供試品溶液。進樣結果的色譜圖可看出，50%甲醇和水分別為溶劑時，在同樣的色譜條件下所得的HPLC 圖基本一致，而以水提取的樣品不易保存且不易過濾，綜合考慮，最終選擇50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

本研究采用二極管陣列檢測器，在相同色譜條件下，在波長190～800 nm 下進行掃描。分別選擇了200、220、254、273、330、365 nm 波長下的色譜圖進行比較，根據各個波長下呈現出的3D圖譜和對應的波長下的平面色譜圖，可以看出在220 nm 波長條件下所獲得的供試品溶液的圖譜能夠顯示更豐富的信息，且各色譜峰的分離效果也較好，故選擇220 nm作為測定波長。

3.3 色譜條件的選擇

考察了甲醇和乙腈作為流動相時不同梯度和等度對寒喘祖帕顆粒指紋圖譜的影響。在等度分析甲醇與乙腈為流動相時，分離度均較差，為了使各色譜峰有較好的分離效果，選擇梯度洗脫。通過對供試品液相圖譜的對比，乙腈作為流動相時比甲醇作為流動相得到的色譜圖出峰要多，而且通過對比這2 種流動相得到的不同圖譜，發現在各色譜峰之間的分離度方面乙腈優于甲醇，故最終選擇乙腈作為該研究的流動相。

3.4 分析方法評價

本研究建立了寒喘祖帕顆粒的HPLC 指紋圖譜，確定了15 個共有峰，并對12 批樣品進行相似度評價。結果顯示，寒喘祖帕顆粒的HPLC 色譜指紋圖譜具有良好的相似性。此外，本研究通過化學模式識別分析建立了聚類分析、PCA、OPLS-DA 分類模型，這3 種分析方法的結果基本一致。12 批樣品通過聚類分析被分為3類；PCA得到前2個成分因子累積方差貢獻率可達80.675%，第1 主成分的獨立方差貢獻率達到64.524%，主要反映了以甘草中代表性成分甘草苷、甘草酸銨為主的化學成分在質量控制中發揮了主要作用；OPLS-DA 以共有峰VIP 值＞1色譜峰為1、6、7、13 號峰，可能是區分樣品的關鍵色譜峰。其中，1 號峰為沒食子酸、7 號峰為甘草苷、13 號峰為甘草酸銨，上述3 種成分是寒喘祖帕顆粒中的活性成分，對寒喘祖帕顆粒的質量控制起著關鍵作用。

綜上所述，本研究建立的HPLC 指紋圖譜方法穩定可靠、重復性好，并建立化學模式識別分析方法，可為寒喘祖帕顆粒的質量評價與控制提供參考。