飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對瘤胃上皮細胞炎癥因子表達量的影響

嚴 康， 馬曉宇， 楊天宇， 姜茂成， 詹 康， 趙國琦

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009； 2.江蘇省畜牧總站，江蘇 南京 210017)

瘤胃上皮是重要的免疫屏障器官，對抵御瘤胃內(nèi)微生物崩解產(chǎn)生的抗原具有重要的生理意義[1]。高精料日糧飼喂下瘤胃液中抗原肽以及有害物質(zhì)會損害瘤胃上皮屏障功能[2-3]，引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，影響奶牛的健康和生產(chǎn)性能[4]。然而，關(guān)于飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液是如何引發(fā)牛瘤胃上皮細胞(BRECs)炎癥反應(yīng)的研究較少。因此，在高精料日糧飼喂條件下，闡明飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液誘導(dǎo)瘤胃上皮細胞炎癥反應(yīng)的分子機制，可為緩解奶牛瘤胃上皮炎癥等代謝性障礙提供理論依據(jù)。

在奶牛生產(chǎn)中，為提高產(chǎn)奶量，一般會在日糧中添加高精料日糧，但長時間飼喂高精料日糧會誘發(fā)瘤胃內(nèi)革蘭氏陰性菌大量死亡和崩解[5]，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)產(chǎn)生大量脂多糖(LPS)[6]，引發(fā)系統(tǒng)性促炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降[7-8]，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[9]。當LPS與BRECs共培養(yǎng)時，LPS能上調(diào)炎癥因子基因IL-1β、TNF-α以及趨化因子基因CXCL2、CXCL8的mRNA表達量[10]。LPS與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，可識別和啟動LPS觸發(fā)的炎癥反應(yīng)[11-12]。LPS激活TLR4后，TLR4與細胞質(zhì)內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白相互作用[13]，接頭蛋白包括髓樣分化因子(MyD88)和Toll受體相關(guān)的分子[14-15]。TLR4與接頭蛋白相互作用后，誘導(dǎo)IRAK1、IRAK4的招募和激活[16]，并與TRAF6形成復(fù)合體，激活下游蛋白激酶TAK1、IKK[17-18]，最終使NF-κB轉(zhuǎn)錄因子從細胞質(zhì)移位至細胞核，進而引起炎癥反應(yīng)[15]。

飼喂高精料日糧后，奶牛瘤胃液中不僅含有LPS，還含有細菌二肽和細菌三肽[19]。營養(yǎng)代謝異常會破壞消化道天然免疫屏障，如小腸上皮屏障，使細菌小肽通過細胞旁路方式進入小腸固有層或直接進入小腸上皮細胞內(nèi)，引發(fā)小腸上皮炎癥反應(yīng)[20]。細菌小肽誘發(fā)胃腸道炎癥反應(yīng)，嚴重影響奶牛健康、鮮奶質(zhì)量和飼料利用率。有學者指出，大腸桿菌崩解產(chǎn)生的細菌三肽，如甲酰三肽(fMLP)進入小腸內(nèi)腔，引發(fā)小腸上皮的免疫應(yīng)答反應(yīng)[21]。通過fMLP處理小腸上皮細胞，能夠上調(diào)腸上皮細胞轉(zhuǎn)錄因子基因NF-κBmRNA表達，并誘發(fā)促炎癥反應(yīng)[22]。此外，細菌胞壁酰二肽(MDP)和Tri-DAP三肽也能激活轉(zhuǎn)錄因子基因NF-κB。小肽轉(zhuǎn)運蛋白1(PEPT1)轉(zhuǎn)運細菌胞壁酰二肽MDP進入細胞內(nèi)，刺激人結(jié)直腸腺癌細胞Caco-2上皮細胞中IL-8mRNA上調(diào)[23]。MDP能夠識別NOD2受體，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，但不是通過Toll樣受體信號通路[24-25]。Tri-DAP識別NOD1受體，激活RIPK2激酶，與IKK激酶相互作用，激活NF-κB信號通路，上調(diào)TNF-α、IL-6的表達[26]。Tri-DAP激活Caco-2絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，引發(fā)IL-8的mRNA表達[20]。

本研究擬探究飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對BRECs炎癥因子、趨化因子和抗氧化指標的影響，以期解析高精料日糧飼喂條件下奶牛瘤胃上皮細胞的炎癥反應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶由Gibco公司提供；青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸由Sigma公司提供；PrimeScriptTM RT Master Mix和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ由TaKaRa公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、總抗氧化物質(zhì)(T-AOC)的檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 奶牛瘤胃上皮細胞培養(yǎng) 奶牛瘤胃上皮細胞來自揚州大學[27]。用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)奶牛瘤胃上皮細胞，待細胞密度達到培養(yǎng)瓶70%生長面積時，用0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化奶牛瘤胃上皮細胞，放置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中溫育3 min，培養(yǎng)瓶中的細胞開始發(fā)亮并從瓶底脫落，拍打細胞培養(yǎng)瓶數(shù)次，直至奶牛瘤胃上皮細胞全部從培養(yǎng)瓶底部脫落，用5 ml含10.00%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至3個瓶底面積為25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 瘤胃液樣品采集 試驗分為2組，分別為對照組(正常飼喂)和高精料組(飼喂高精料日糧)，每組6頭荷斯坦奶牛。試驗?zāi)膛Ｌ幱诿谌橹衅谇覠o臨床疾病，100%全混合日糧TMR飼喂且滿足美國國家科學研究委員會修訂的奶牛營養(yǎng)需要(NRC)要求，每天于8∶00、14∶00和21∶00分別擠奶。飼糧組成、營養(yǎng)成分見表1和表2。每組奶牛飼喂相應(yīng)日糧28 d，誘導(dǎo)高精料組奶牛發(fā)生亞急性酸中毒(SARA)。當高精料組奶牛瘤胃液pH值為5.5～5.8時，對奶牛瘤胃液進行采集。采集時間為晨飼3 h后，用瘤胃液口腔采集器從瘤胃中采集約50 ml瘤胃食糜，并用4層紗布過濾后，轉(zhuǎn)移至50 ml無菌離心管中，立即用便攜式pH計測定瘤胃液pH值，并立即放置于液氮中暫存，然后帶回實驗室保存在-80 ℃超低溫冰箱中。

表1 飼糧組成

表2 飼糧營養(yǎng)成分含量

1.2.3 瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸濃度測定 瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度使用氣相色譜法進行測定。取2.0～3.0 ml瘤胃液經(jīng)12 000g離心10 min后取1.0 ml上清液于1.5 ml離心管中，加0.2 ml 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混勻后在-20 ℃冰箱中過夜。第2 d將樣品進行12 000g離心10 min后，取上清液于0.22 μm水相濾膜過濾后，取1.0 μl進樣進行VFA濃度測定。

1.2.4 瘤胃上皮細胞炎癥因子基因mRNA相對表達量測定 選取試驗組奶牛瘤胃液置于50 ml離心管中，4 ℃ 12 000g離心90 min，小心吸取上清液并轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，再進行4 ℃ 12 000g離心90 min，吸取上清，并用無菌0.22 μm濾膜進行過濾、除菌。試驗分為2個組，分別為對照組(CK)和高精料組(HCRF)。6孔板每孔接2×105個BRECs，CK組在培養(yǎng)基中添加10%正常飼喂奶牛的瘤胃液，HCRF組在培養(yǎng)基中添加10%飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液，分別孵育BRECs 6 h。然后，使用TRIzol試劑盒提取總RNA。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物含有1 μg總RNA和1×PrimeScript RT Master Mix，最終體積為20 μl，反應(yīng)在37 ℃條件下進行15 min。使用SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒進行qRT-PCR試驗。qRT-PCR反應(yīng)混合物包含1×SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ，0.4 μmol/L的上游、下游引物，以及100 ng cDNA模板，最終體積為20 μl，反應(yīng)過程：95 ℃初始變性30 s；然后在95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。本研究所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表3)。試驗設(shè)3個重復(fù)，GAPDH為內(nèi)參基因，基因相對表達量用2-△△Ct法計算。

表3 熒光定量PCR引物信息表

1.2.5 奶牛瘤胃上皮細胞抗氧化指標測定 試驗分為2個組，分別為對照組(CK)和高精料組(HCRF)。6孔板每孔接2×105個BRECs，CK組在F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%飼喂正常日糧奶牛的瘤胃液，HCRF組在F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液，分別孵育BRECs 6 h。然后，用含有蛋白酶抑制劑裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白質(zhì)。通過試劑盒檢測細胞內(nèi)SOD、GSH-Px、MDA、H2O2、T-AOC的含量。

1.2.6 統(tǒng)計分析 利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件中的One-Way ANOVA模塊進行單因素方差分析，顯著性檢驗應(yīng)用多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂高精料日糧對奶牛瘤胃發(fā)酵反應(yīng)的影響

表4顯示，與對照組相比，高精料組的奶牛瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪酸濃度以及乙酸、丙酸、丁酸含量極顯著提高(P<0.010)，戊酸含量提高(P=0.070)。與對照組相比，高精料組的奶牛瘤胃液的pH值極顯著下降(P=0.005)，說明飼喂高精料日糧可以誘導(dǎo)奶牛發(fā)生亞急性酸中毒(SARA)。

表4 飼喂高精料日糧對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對奶牛瘤胃上皮細胞炎癥因子基因表達的影響

通過qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-32、p38β、TGF-β的mRNA表達量，GAPDH作為內(nèi)參基因。表5顯示，與對照組相比，高精料組BRECs炎癥因子基因IL-1β、TNF-α的mRNA表達量極顯著上調(diào)，IL-6的mRNA表達量也極顯著上調(diào)，然而，炎癥因子IL-12、IL-32的mRNA表達量并沒有顯著改變。與對照組相比，高精料組p38β和TGF-β的mRNA表達量也沒有顯著變化。說明，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液可以促進BRECs的炎癥反應(yīng)。

表5 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對BRECs炎癥因子基因mRNA相對表達量的影響

2.3 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對奶牛瘤胃上皮細胞趨化因子基因表達的影響

當受到外來抗原刺激時，機體會啟動先天免疫反應(yīng)來積極響應(yīng)感染。由于飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液中含有細菌死亡崩解產(chǎn)生的細菌小肽，本研究假設(shè)飼喂高精料日糧后，奶牛瘤胃上皮能夠積極響應(yīng)瘤胃液中細菌小肽對BRECs的感染，因此，通過qRT-PCR來檢測BRECs初始炎癥反應(yīng)相關(guān)趨化因子基因的mRNA表達量。表6顯示，飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液能夠顯著上調(diào)BRECs中CCL型的CCL2、CCL20的mRNA表達量，但CCL28的mRNA表達量并未顯著上調(diào)(P>0.05)。此外，與對照組相比，高精料組的BRECs中CXCL型的CXCL8、CXCL9的mRNA表達量極顯著上調(diào)(P<0.01)，CXCL2的mRNA表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，CXCL14的mRNA表達量未顯著上調(diào)(P=0.09)。說明，飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液能夠增加大部分CCL型和CXCL型趨化因子基因的mRNA表達量，進而積極響應(yīng)飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液中細菌抗原的感染。

2.4 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對奶牛瘤胃上皮細胞Toll信號通路的影響

模式識別受體主要包括2種，即細胞膜表面的Toll樣受體(TLR)和胞漿內(nèi)NOD受體。Toll樣受體信號通路的激活在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TLR能夠識別各種病原體中的保守基序，迅速激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，促使機體生成炎癥因子和趨化因子。與對照組相比，高精料組TLR2、TLR4基因的mRNA表達量顯著降低。TLR4與許多細胞質(zhì)內(nèi)的接頭蛋白(包括CD14、MD2、MyD88)相互作用。TLR4與接頭蛋白的相互作用，會引起、導(dǎo)致白介素-1 受體相關(guān)激酶的募集和激活，并與TRAF6形成復(fù)合體。結(jié)果(表7)表明，飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液并未顯著改變CD14、MD2、MyD88以及下游信號通路IRAK1激酶、TRAF6連接酶基因的mRNA表達量，說明飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液促進BRECs炎癥反應(yīng)可能不是通過Toll樣受體信號通路，而是通過其他信號通路實現(xiàn)的。

表6 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對BRECs趨化因子基因mRNA表達量的影響

表7 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對BRECs Toll樣受體信號通路的影響

2.5 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對奶牛瘤胃上皮細胞NOD/RIPK2信號通路的影響

PEPT1可以將細菌小肽轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，細菌小肽引起核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD受體與RIPK2相互作用，進而引起奶牛瘤胃上皮細胞炎癥反應(yīng)。NOD受體可以識別細菌小肽，激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。NOD1和NOD2是先天免疫受體，能夠識別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌崩解的細菌小肽。NOD1主要識別革蘭氏陰性菌崩解產(chǎn)生的細菌小肽，而NOD2既能識別革蘭氏陰性菌崩解產(chǎn)生的細菌小肽也能識別革蘭氏陽性菌崩解產(chǎn)生的細菌小肽。表8顯示，與對照組相比，高精料組BRECs中PEPT1的mRNA表達量顯著提高(P<0.05)，但NHE1、NOD1、NOD2、RIPK2的mRNA表達量并無顯著變化。說明，PEPT1可能轉(zhuǎn)運飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液中的細菌小肽進入細胞，引起炎癥反應(yīng)，但還需要進一步證明。

表8 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對BRECs NOD樣受體和RIPK2信號通路的影響

2.6 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對奶牛瘤胃上皮細胞抗氧化性的影響

表9顯示，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液可以極顯著增加BRECs中MDA、H2O2含量，然而，SOD、GSH-Px、T-AOC含量極顯著降低。表明飼喂高精料日糧會對奶牛瘤胃上皮產(chǎn)生損傷作用。

表9 飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液對奶牛瘤胃上皮細胞抗氧化指標的影響

3 討 論

為了提高產(chǎn)奶量，經(jīng)常以高精料日糧飼喂奶牛。然而，長期飼喂高精料日糧會改變奶牛瘤胃微生物的組成和代謝，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸大量積累，降低瘤胃液pH值[28-29]。瘤胃液pH值的急劇下降是目前奶牛養(yǎng)殖業(yè)主要關(guān)注的健康問題之一，會導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)消化紊亂，引發(fā)生產(chǎn)損失。有報道指出，SARA與低纖維、高能量的日糧和pH值有關(guān)[9]。SARA會導(dǎo)致瘤胃內(nèi)LPS產(chǎn)生，甚至從瘤胃轉(zhuǎn)移到血液內(nèi)循環(huán)[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液pH值低于5.8，且持續(xù)時間為1 d約5.1 h，成功誘導(dǎo)奶牛出現(xiàn)SARA[31]。在本研究中，與對照組相比，高精料組的瘤胃液pH值顯著降低，說明SARA被成功誘導(dǎo)。通常情況下，高精料會促進乳酸產(chǎn)生菌的增加，減少瘤胃內(nèi)纖維降解菌的數(shù)量，導(dǎo)致瘤胃液pH值急劇下降[32]。因此，瘤胃液pH值的改變可能是由于飼料從干草到高精料過渡過程中，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的快速發(fā)酵和瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的積累引起的[33]。pH值的降低也可能是由于瘤胃內(nèi)乳酸積累導(dǎo)致的。此外，在本研究中，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸含量和總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧會引起瘤胃內(nèi)丙酸、丁酸含量的升高[34-35]，這與本研究結(jié)果一致。有學者指出，高精料日糧會激活瘤胃上皮鈣信號通路，可能是由于揮發(fā)性脂肪酸在瘤胃內(nèi)大量積累引起的[36-37]。低pH值會降低瘤胃內(nèi)細菌的豐富度和多樣性，在飼喂高精料日糧引起奶牛SARA時，低pH瘤胃環(huán)境會導(dǎo)致細菌死亡和崩解，使其相對豐度降低[38]。因此，飼喂高精料日糧會影響奶牛瘤胃發(fā)酵，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)環(huán)境紊亂。

飼喂高谷物日糧引起的SARA會損害奶牛健康，如產(chǎn)生瘤胃炎、代謝性酸中毒、跛行和肝膿腫等[38-40]。此外，谷物誘導(dǎo)的SARA會增加急性時相反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白A的水平，引起全身炎癥反應(yīng)[41-42]。這種全身性炎癥反應(yīng)與日糧引起的瘤胃上皮屏障功能的破壞有關(guān)[5]。因此，本研究采集飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液進行體外試驗，進一步探索其是否會引起B(yǎng)RECs的炎癥反應(yīng)，結(jié)果表明，與對照組相比，高精料組促炎因子基因IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表達量顯著上升。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS的釋放以及pH值的降低可能通過協(xié)同作用破壞瘤胃上皮屏障[43]。上皮屏障被破壞后，促使炎癥因子大量釋放，引起瘤胃上皮局部炎癥反應(yīng)[44-45]。IL-6作為一種多功能細胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、急性時相反應(yīng)和炎癥[46-47]。前人的研究結(jié)果表明，IL-6可以參與腸道組織修復(fù)，阻止IL-6的產(chǎn)生有利于創(chuàng)傷面的愈合[48-49]。因此，BRECs炎癥因子基因的高表達，說明長時間飼喂高精料日糧能引起奶牛瘤胃上皮發(fā)生炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，SARA引發(fā)的炎癥因子基因mRNA表達量增加主要與淀粉類細菌有關(guān)，高精料日糧有利于這類細菌增長，進而增加瘤胃內(nèi)毒素和其他細菌崩解產(chǎn)物在胃腸道的易位，這可能是誘發(fā)反芻動物炎癥的原因[42]。

趨化因子是能誘導(dǎo)免疫細胞發(fā)生定向趨化的細胞因子的總稱，是一類結(jié)構(gòu)、功能相似的小分子蛋白質(zhì)，在細胞遷移、免疫、炎癥等反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。趨化因子可參與調(diào)節(jié)白細胞、淋巴細胞等免疫細胞的募集[50]。根據(jù)半胱氨酸的序列位置將趨化因子分為CXCL、CCL、C和CX3C(C為半胱氨酸，X為任意氨基酸)4大類。CCL型趨化因子主要趨化單核細胞，CXCL型趨化因子主要趨化中性粒細胞。本研究選取趨化因子家族中種類較多的2種亞家族(CCL型趨化因子和CXCL型趨化因子)進行測定。趨化因子在免疫細胞遷移中的作用主要是通過與免疫細胞受體結(jié)合完成的。一種趨化因子可結(jié)合多種趨化因子受體，一種趨化因子受體也能與多種趨化因子相結(jié)合[51]。CCL2是在人體內(nèi)最早被發(fā)現(xiàn)及研究最多的CCL類趨化因子，可通過受體CCR2介導(dǎo)，將免疫細胞遷移至損傷部位引發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)[52]。有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL14可以通過調(diào)節(jié)其他趨化因子受體，在介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮作用[53]。CXCL14可由B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、單核細胞衍生的未成熟的樹突狀細胞等多種細胞分泌產(chǎn)生，并能聚集、激活免疫細胞至炎癥部位殺死靶細胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視及免疫防御作用[54]。在本研究中，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液可顯著提高BRECs中CCL型CCL2、CCL20基因以及CXCL型CXCL2、CXCL8、CXCL9基因的表達。另有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃上皮趨化因子基因表達上調(diào)[34]，這與本研究結(jié)果一致，表明飼喂高精料日糧觸發(fā)了奶牛瘤胃上皮免疫應(yīng)答反應(yīng)，這可能是在飼喂高精料日糧條件下機體對自身的免疫保護。

反芻動物PEPT1主要分布于胃上皮組織和小腸黏膜[55]。有研究報道，PEPT1介導(dǎo)細菌小肽轉(zhuǎn)運，進入結(jié)腸上皮細胞，通過調(diào)節(jié)IFN-γ活性，激活NF-κB通路，誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧能促進馬腸道中PEPT1mRNA的表達[22]。由此可知，PEPT1可以介導(dǎo)細菌小肽的轉(zhuǎn)運和吸收，激活腸道免疫細胞，促進腸上皮細胞與免疫細胞相互作用，最終導(dǎo)致小腸上皮細胞的炎癥反應(yīng)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧會導(dǎo)致奶牛瘤胃內(nèi)有機酸大量累積和瘤胃液pH值急劇下降，改變瘤胃內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，影響瘤胃微生物區(qū)系多樣性，并誘發(fā)微生物崩解釋放大量細菌小肽和促炎因子[31]。在本研究中，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液顯著上調(diào)BRECs中PEPT1的mRNA表達量，這可能是由于瘤胃液中攜帶大量細菌分解產(chǎn)生的細菌小肽，通過PEPT1可以將這些細菌小肽運輸?shù)郊毎校毦‰牡倪\輸也可能導(dǎo)致瘤胃上皮細胞內(nèi)的細菌產(chǎn)物抗原增加，誘導(dǎo)PEPT1在瘤胃上皮細胞中的表達，進而導(dǎo)致細胞對細菌小肽轉(zhuǎn)運的增加，使細胞內(nèi)的細菌小肽大量積累，激活炎癥信號通路，從而引發(fā)下游的促炎癥反應(yīng)。

細菌小肽可激活細胞內(nèi)的NOD1、NOD2樣受體，并使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶2(RIPK2)并引起泛素化[56]。RIPK2是NOD1和NOD2的下游信號分子。RIPK2在樹突狀細胞和巨噬細胞等細胞中表達，NOD1和NOD2對微生物相關(guān)分子模式的識別導(dǎo)致RIPK2與這些天然免疫受體相互作用，進而通過激活MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達，釋放TNF-α、IL-6、IL-12等促炎細胞因子[57]。有研究證實，RIPK2依賴NOD受體誘導(dǎo)促炎細胞因子的產(chǎn)生[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，與受刺激的RIPK2完整小鼠的巨噬細胞相比，缺乏RIPK2的小鼠中，IL-6、TNF-α炎癥因子基因的mRNA表達量明顯降低[58]。因此，這些研究結(jié)果表明RIPK2是通過NOD1/NOD2介導(dǎo)產(chǎn)生促炎因子的重要信號分子，RIPK2的激活在宿主防御微生物感染中起著至關(guān)重要的作用。

有學者指出，日糧的改變會影響動物機體瘤胃組織的抗氧化能力[59]。飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液可以極顯著增加BRECs中MDA、H2O2含量，然而，SOD、GSH-Px、T-AOC含量極顯著降低，說明飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃液可能影響瘤胃上皮細胞的抗氧化能力，與前人的研究結(jié)果一致。組織中的SOD、GSH-Px、MDA和T-AOC等指標的變化是反應(yīng)機體氧化/抗氧化狀態(tài)的重要指標，其中超氧化物歧化酶是消除動物體內(nèi)自由基損傷的主要防御酶[60-62]，具有清除自由基、提高細胞活力、保持生物膜穩(wěn)態(tài)等功能；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量可直接反映細胞膜脂質(zhì)過氧化的程度[63]。通過本研究結(jié)果證明，飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液會對細胞活力和生物膜穩(wěn)態(tài)造成損傷，并且會加劇細胞膜脂質(zhì)過氧化程度。飼喂高精料日糧的奶牛瘤胃液會影響瘤胃上皮細胞的穩(wěn)態(tài)，致使瘤胃上皮細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝受阻，從而造成代謝紊亂，引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。