不同濃度海藻糖對西門塔爾公牛精子活力的影響

高漢婷，衡軍材，汪聰勇，栗敏杰，李若璽，高留濤

（河南省鼎元種牛育種有限公司，河南 鄭州 450000）

20世紀70年代我國就已經開始牛精液冷凍保存的研究，但是解凍后的精子活力特別是解凍后存活時間的長短已經跟不上目前技術發(fā)展水平的要求，人工授精后返情率和空懷率偏高。大型牛場同期處理后，每一位輸精員要負責上千頭母牛輸精，都會選擇將凍精一次性解凍，從第一頭輸精開始到最后一頭輸精結束要經過好幾個小時，這樣精子存活時間就顯得尤為重要。筆者探討在稀釋液中加入一些特殊的成分，能夠延長精子的存活時間，節(jié)省精子能量，提高精子活力。

海藻糖是一種非還原性糖，它由兩個葡萄糖分子通過糖苷鍵鏈接而成，這種穩(wěn)定性的結構決定了海藻糖穩(wěn)定的自身性質。海藻糖對生物有抗脫水、抗冷凍和抗高滲保護作用，是因為其在惡劣環(huán)境條件下，在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征［1］。海藻糖己普遍應用到大分子生物和細胞的低溫和冷凍保存中，尤其是作為一種非滲透性冷凍保護劑在胚胎、精子和各類體細胞的冷凍保存等方面應用廣泛。

該試驗以新鮮牛精液為試驗材料，添加不同濃度的海藻糖，觀察低溫保存條件下不同存活時間的精子活力的變化，為生產高質量的精子提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

所有樣本均采自河南省鼎元種牛育種有限公司種公牛站的健康公牛精液。

“法官，按我的理解，你的意思是，當著我和我那幾個小孩子的面，無緣無故地殺害我丈夫的這個人是無罪的？法律對他只能這樣了？”“沒錯，兩種說法都一樣。”我回答。

課堂上，由教師主體變成學生主體是“放”。只有放，才能避免教師唱獨角戲，讓學生進入課堂，使課堂變?yōu)椤敖處煛⒔滩暮蛯W生”構成的“三元課堂體系”。道家說：“一生二，二生三，三生萬物。”有了“三元課堂體系”，課堂上才有可能生出充滿活力的萬物，課堂才能出現(xiàn)“漲潮”和“落潮”的起伏，才能散發(fā)出真正的生命活力。

當代青年的文明素養(yǎng)和思想道德建設離不開傳統(tǒng)文化。文化的傳遞性使中國傳統(tǒng)文化得以延續(xù)，任何一個國家的建設都無法脫離本民族的優(yōu)秀傳統(tǒng)文化。我們對于當代青少年的培養(yǎng)也離不開中國傳統(tǒng)文化的引導與熏陶，傳統(tǒng)文化的傳承與創(chuàng)新也有賴于青少年的繼承與發(fā)揚光大。中華傳統(tǒng)文化有利于青少年建立正確的人生觀、價值觀、世界觀。有利于培養(yǎng)青少年以愛國主義為核心的民族精神。傳統(tǒng)文化對于青少年的思想熏陶和人格塑造都有著不可否認的積極作用，能夠幫助青少年豐富文化知識、提升思想境界，學會如何處理好人際關系，對于樹立青少年正確的價值取向有著積極作用。

BIM技術發(fā)以來，參數(shù)化、模型化、可視化和協(xié)同工作是其實際應用的基本特征[1]。將其納入建筑工程項目信息管理實踐，建筑工程項目信息管理的效率和質量得以有效提升，并且，在信息重復、信息誤差等內容的控制方面具有重大影響。當前環(huán)境下，BIM技術已深刻的貫穿于生命周期的各個環(huán)節(jié)，其對于工程質量提升，工程效益獲得具有較為深刻的影響作用。因此在現(xiàn)代工程建設中，在建筑工程項目信息管理中進行深層次的BIM技術應用勢在必行。

主要耗材：新鮮雞蛋、相差顯微鏡、電子天平、恒溫水浴箱、5.0 ml 試管、試管架、載玻片、蓋玻片、血細胞計數(shù)器、移液槍、250 ml燒杯、100 ml量筒。

主要試劑：葡萄糖、Tris、檸檬酸、海藻糖、甘油。

1.2.3 精子活力檢測

1.2 試驗方法

1.2.1 精液稀釋液的配制

1.2.2 精液稀釋和樣品的采集

采用假陰道采精法采集牛精液，并對精液品質進行檢測。用于冷凍保存的新鮮精液指標必須滿足：活力大于65%，精子密度高于6×109/ml，畸形率小于15%。將符合標準的牛新鮮精液用等溫稀釋液進行稀釋，而后分裝于0.25 ml 細管內，平衡2～4 h 后用冷凍儀進行冷凍，最后將細管投入液氮罐中冷凍保存。

A組即基礎液：稱取Tris 2.424 g、檸檬酸1.344 g、葡萄糖1.0 g、卵黃15 ml溶于超純水中，攪拌均勻，再加入甘油5 ml，繼續(xù)攪拌均勻，然后放入58℃水中巴氏消毒30 min，等消毒完畢后放入涼水中冷卻，冷卻后加入青霉素10萬國際單位，鏈霉素10萬國際單位在磁力攪拌器上攪拌均勻放入4℃冰箱備用。

配制不同濃度的海藻糖組：在上述配制好的A 組液（基礎液）中加入海藻糖，A 組0 mol/L為對照組，B 組0.1 mol/L、C組0.2 mol/L、D組0.3 mol/L、E組0.4 mol/L 5個濃度梯度。

試驗分組：根據(jù)海藻糖濃度的不同分別設置了A、B、C、D和E5個濃度梯度。

現(xiàn)代農業(yè)是把農業(yè)建立在現(xiàn)代科學的基礎上，利用現(xiàn)代化科學技術、現(xiàn)代工業(yè)來裝備農業(yè)，用智能化來管理農業(yè)，創(chuàng)造一個高產、優(yōu)質、低耗的農業(yè)生產體系。其最終目標是建立發(fā)達、富庶的農業(yè)和創(chuàng)造良好的環(huán)境。其特征包括機械化、科學化、產業(yè)化、信息化和提高勞動者的素質。

24 h以后置于37℃水浴解凍，然后分成3組，第1組立即在顯微鏡下檢測活力，取3支解凍好的細管凍精剪去封口端推入小玻璃管中混勻，取10 μl在37℃恒溫板上等溫預熱的載玻片上滴片，蓋上蓋玻片后置于配有37℃恒溫臺的顯微鏡下放大400倍觀測活力。3 h以后用同樣的方法檢測第2組的活力即3 h活力，再過3 h即檢測解凍后6 h活力。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SAS8.0 軟件進行方差分析，試驗結果以平均值表示。

2 結果

添加不同濃度海藻糖后不同存活時間活力（見下表）。

表 添加不同濃度海藻糖后不同存活時間活力

試驗結果表明B組在各階段活力均優(yōu)于其他組，尤其是各組精液在解凍后3 h、6 h 活力呈現(xiàn)先增后降，在B 組處呈現(xiàn)最佳，活力都顯著高于其他組，且差異顯著（P＜0.05）；E組精子能量損失最少，表明膜保護力最好，但是解凍0 h活力不達標。

3 討論

精液稀釋液的目的是增加精液的含量，通過降低精子能量消耗，補充適量營養(yǎng)和保護物質，抑制精液中有害微生物的活力，以延長精子的壽命，便于保存和運輸。在該試驗中，基礎液中添加不同劑量的海藻糖，雖然都具有相同的成分，但濃度不同，稀釋時對精子的作用也不同，最終導致了不同的冷凍效果。海藻糖的自身性質很穩(wěn)定，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等較差環(huán)境條件下可在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征［1-3］。楊文瑾［4］試驗報道在低溫保存液里分別添加0.028 mol/L、0.014 mol/L、0.046 mol/L 的海藻糖，對牛精液進行低溫保存，結果發(fā)現(xiàn)，海藻糖的劑量越高，精子活力越強。南向斌［5］研究發(fā)現(xiàn)在稀釋液中添加2%、4%、6%、8%、10%的海藻糖，觀察牛精液的冷凍保存效果，結果發(fā)現(xiàn)4%的海藻糖能顯著提高精子的活力與活率。胡建宏等［6］通過添加比例為25%、50%、75%、100%的海藻糖到稀釋液中對豬精子進行冷凍保存，結果發(fā)現(xiàn)，比例為25%的海藻糖稀釋液精子的活率最大。張樹山等［2］對豬精子進行冷凍保存時發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加不同濃度海藻糖，可提高精子的頂體完整率，且精子頂體完整率會隨濃度的升高而增大，但沒有顯著性差異（P＞0.05）。張勇［7］試驗報道稀釋液中分別添加40 mg/100 ml、60 mg/100 ml、80 mg/100 ml與100 mg/100 ml的4組不同濃度的海藻糖，4℃條件下保存雞精液，頂體完整率和畸形率差異均不顯著（P＞0.05）；但是100 mg/100 ml組中精子頂體完整率最高為（88.90±2.84）%，且頂體完整率會隨濃度的增大而增大。該試驗中添加海藻糖后B 組在各階段活力均優(yōu)于其他組，尤其是解凍后3 h、6 h活力隨著海藻糖濃度的增高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在B組處呈現(xiàn)最佳狀態(tài)，其活力顯著高于其他組，說明海藻糖濃度為0.1 mol/L 時精子活力好；而E組3 h精子活力變化不大，說明精子能量損失最少，表明膜保護力最好，進一步表明隨著保存時間的延長，海藻糖的性質越來越好。該試驗結果表明，海藻糖濃度越高，0 h的精子的活率越低，而不含海藻糖的0 h的精子存活時間越短。這可能與海藻糖在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，同時保護質膜的完整性有關，具體機理還需進一步驗證。