糖酵解與線粒體功能障礙的關系及其在肝臟疾病中的潛在價值

顏耿杰， 林 鏞， 蘇會吉， 陳含笑， 班少群， 韋艾凌,， 毛德文， 龍富立

1 廣西中醫藥大學 研究生院， 南寧 530200； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病二區， 南寧 530023

肝臟是控制全身能量代謝的主要器官，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代謝，在體內營養平衡中承擔核心作用。葡萄糖和脂肪酸代謝主要發生在線粒體中。線粒體在肝細胞中數量非常龐大，占細胞體積的18%～20%，且更集中于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)利用位點附近[1]，同時在能量代謝和細胞穩態中發揮多種作用，包括細胞呼吸、氧化磷酸化、活性氧(reactive oxygen species，ROS)平衡和細胞死亡的調節等[2]。然而，在各種不利條件下，葡萄糖和脂質代謝功能受到破壞，如糖酵解、糖異生、脂肪生成和脂肪酸氧化，這些代謝過程均在肝臟中進行。其中，糖酵解對肝臟疾病發生發展的影響近年受到越來越多的研究關注。

1 糖酵解促進肝臟疾病進展

糖酵解是指葡萄糖被催化為丙酮酸，并提供2個還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和2個ATP的過程。丙酮酸可被丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)氧化為乙酰輔酶A，或者通過線粒體中的丙酮酸羧化酶轉化為草酰乙酸。在無氧條件下的丙酮酸通過乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)還原為乳酸鹽，或通過丙酮酸脫羧酶脫羧為乙醛。當肝臟處于病理狀態時，能量代謝將優先從氧化磷酸化轉換為糖酵解，其結果是部分丙酮酸被轉換為乳酸鹽[3]。研究[4]表明，糖酵解過程改變的機制可促進非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)進展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最終進展為肝硬化和肝細胞癌(HCC)的過程與氧化還原失衡和線粒體功能障礙相關。高脂飲食可抑制PDH的活性，并降低肝線粒體清除過氧化物的能力，導致氧化應激和NAFLD的進展。另有研究[5]發現，PDH激酶同工酶4(PDK4)可抑制NASH中PDH的活性，當PDK4在NASH小鼠肝臟中缺乏時，肝脂肪變性可顯著改善。綜上所述，PDH的抑制將破壞氧化還原平衡并促進肝臟疾病的進展，并且PDH的激活可改善氧化還原失衡和脂肪變性。此外，糖酵解活性的增強可促進線粒體ROS的產生，使對氧化還原失衡敏感的M2型丙酮酸激酶(recombinant pyruvate kinase isozymes M2，PKM2)轉移至細胞核中，從而促進IL-6和IL-1β的產生，進而引發炎癥[6]。反之，ROS又可抑制線粒體內膜上的呼吸鏈酶，使甘油醛-3-磷酸脫氫酶和膜鈉通道失活，誘導肝細胞損傷，進一步加重脂質過氧化，導致細胞因子產生和脂質積累，并促進肝臟炎癥和纖維化。而由異常糖酵解引起的線粒體功能障礙與ROS產生軸之間的惡性循環可促進肝細胞凋亡并向肝硬化和HCC進展[7-8]。上述發現均提示，糖酵解異常可促進肝臟疾病的發生發展。

2 肝臟疾病增強糖酵解

糖酵解對肝臟疾病進展具有促進作用，而肝臟疾病中的病理狀態也影響糖酵解過程。由于代償線粒體中的ATP產生缺陷，糖酵解將隨著肝臟疾病嚴重程度加重而得到不同程度的增強。研究[9]發現，肝硬化患者肝臟中的糖酵解酶，例如己糖激酶(hexokinase 2，HK2)、醛縮酶A和PKM2的基因表達較正常肝臟明顯上調，并且這些基因的表達與HCC的發生風險相關。Li等[10]研究發現HCC中存在有氧糖酵解，且HCC中癌細胞的有氧糖酵解程度得到增強，即使在有氧條件下也優先將葡萄糖代謝成乳酸。上述發現均與氧化磷酸化到糖酵解代謝的轉變有關，氧化磷酸化作為主要的能量產生過程，當線粒體功能障礙時，為了解決氧化磷酸化受損導致的ATP生成失衡，糖酵解速率代償性升高，從而增強葡萄糖消耗和乳酸產生。當葡萄糖水平升高時，相對較高的糖酵解速率能夠產生比氧化磷酸化更多的能量[11]。在大多數正常細胞中，線粒體氧化磷酸化和糖酵解產生的ATP分別約為90%和10%，而癌細胞依靠有氧糖酵解提供高達60%的ATP消耗[12]，并且癌細胞對ATP的需求越大，糖酵解產生的乳酸在細胞中積累得越多。研究[13-14]表明，癌細胞通過LDH-A增強糖酵解產生乳酸以防止其在缺氧環境中發生細胞凋亡，因此有部分學者認為，升高的乳酸有利于癌細胞逃避免疫，并為癌癥轉移提供酸性腫瘤微環境。總而言之，糖酵解在不同肝臟疾病中的活性增強，并與線粒體功能障礙密切相關，這有助于彌補由氧化磷酸化受損而導致的能量缺陷，因此或可通過靶向調節有氧糖酵解中的關鍵因素，如抑制酶HK2、 PKM2或其他調節途徑，尋求肝臟疾病的潛在治療新方法。

3 糖酵解在肝臟疾病治療中的應用前景

3.1 NAFLD 在NAFLD中，肝細胞的許多代謝途徑發生顯著變化，如糖酵解增強、乳酸生成、三羧酸循環、酮體生成減少、線粒體呼吸和ATP合成減少，這些代謝途徑之間存在著密切而復雜的相互作用。其中，糖酵解中的一些相關代謝途徑可能成為NAFLD潛在的治療靶點。最近的研究[15]發現，高脂飲食可以通過LKB1-AMPK途徑下調香葉基香葉基二磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)的表達來增強糖酵解，并導致小鼠原代肝細胞分泌的炎癥因子增加。此外，使用2-脫氧-D-葡萄糖抑制糖酵解可顯著緩解小鼠由于GGPPS缺失而導致的肝臟炎癥和纖維化。Kors等[16]研究發現，敲除小鼠肝臟富含亮氨酸重復序列的家族蛋白X1可以抑制糖酵解，并導致脂肪酸氧化增加和脂肪變性減少，或可作為NAFLD的新型治療靶點。Shannon等研究[17]發現，肥胖小鼠中PDH復合物的活性增強伴隨著PDK4活性降低和PDH磷酸酶同工酶2活性增強，而吡格列酮可使PDH復合物的活性正常化，并抑制丙酮酸進入三羧酸循環中代謝。丙酮酸鹽的另一種代謝途徑是乳酸的產生，在生理條件下，乳酸主要作為心臟、骨骼肌和大腦的能量來源，而肝細胞可將過量的血漿乳酸轉化為葡萄糖，然后帶回血漿。p300/CBP相關因子介導的 LDH-B 的高乙酰化水平可降低肝細胞代謝乳酸鹽的能力，并導致乳酸鹽積累，是NAFLD中乳酸鹽積累的主要原因之一，增加的乳酸不僅加重肝脂肪變性，還可以通過降低組蛋白去乙酰化酶的活性，增加組蛋白H3賴氨酸9的乙酰化，從而提高參與脂肪生成和脂肪酸攝取的基因表達[18]。

糖酵解活性的增強可促進線粒體ROS的產生，過量的ROS將攻擊細胞內大分子化合物，如蛋白質、核酸和脂質等，并導致細胞死亡或誘導細胞凋亡，這也是NAFLD進展為NASH的重要因素之一。線粒體是細胞內ROS的重要來源，線粒體ROS(mtROS)主要在線粒體內膜中電子傳遞鏈的氧化磷酸化過程中產生，當mtROS增加時，由于線粒體功能障礙，諸如線粒體DNA(mtDNA)之類的線粒體損傷相關分子模式被釋放至細胞中或細胞外，mtROS被氧化以促進mtDNA的細胞質轉運，氧化后的mtDNA直接與含有核苷酸結合結構域-、富含亮氨酸重復序列-和NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3結合，刺激IL-1β的產生，加速NAFLD進展[19]。因此，通過抑制mtROS，維持線粒體穩態，或可作為NAFLD的潛在治療手段。一項關于巨噬細胞和NASH的研究[20]發現，膜聯蛋白A5通過直接靶向PKM2促進活性PKM2四聚體的形成，導致糖酵解抑制和線粒體氧化代謝激活，從而觸發巨噬細胞表型轉移和改善NASH，為NASH提供了一種新的治療方法。

3.2 肝纖維化 廣泛的慢性肝損傷，包括病毒性肝炎、膽汁淤積性肝病和NAFLD，可引起慢性肝臟炎癥并最終導致肝纖維化。如果能夠去除致病因子，肝纖維化是可逆的[21]。而當無法去除潛在病因時，早期識別、預防肝纖維化則成為臨床治療的關鍵。肝纖維化的特征在于肝星狀細胞(HSC)的激活、增殖和遷移。活化的HSC進一步促進過量膠原蛋白的形成和細胞外基質(ECM)的積累，導致持續性慢性肝損傷，若不及時加以干預，最終將進展為肝硬化和肝細胞癌。肝臟作為人體最大的代謝中心，探尋肝纖維化相關的代謝途徑改變可能有望發現肝纖維化的新標志物和治療靶點。研究[22]顯示，HSC在活化過程中存在有氧糖酵解，抑制有氧糖酵解中的LDH-A可阻斷HSC收縮。另有研究[23]發現，葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter，GLUT)1和PKM2在臨床患者和小鼠纖維化肝臟樣本中的表達均上調，且來自活化的 HSC外泌體中 GLUT1 和 PKM2表達顯著增加，表明HSC釋放的外泌體與HSC的活化和葡萄糖攝取相關，并通過運輸糖酵解相關蛋白進而影響肝臟非實質細胞(包括靜止型HSC、Kupffer細胞和肝竇內皮細胞)向糖酵解的代謝轉換。最近一項研究[24]發現，局灶性黏附激酶相關非激酶(FAK related non-kinase，FRNK)通過抑制有氧糖酵解，限制HSC的活化、增殖和遷移，并促進HSC凋亡，從而改善肝纖維化，表明FRNK可能是肝纖維化治療的潛在治療候選藥物。Rao等[25]利用特異性卵泡抑素樣蛋白1(follistatin like protein 1，FSTL1)基因敲除小鼠構建肝纖維化模型以探索巨噬細胞FSTL1在肝纖維化中的功能和機制，結果發現，FSTL1促進了PKM2磷酸化和核易位，減少了PKM2泛素化以增強PKM2依賴的糖酵解，并增加了M1極化，在使用PKM2活化劑(DASA-58)后，FSTL1介導的糖酵解和炎癥表現受到部分抑制。關于PKM2在肝纖維化中的作用已被證實，PKM2四聚化可逆轉肝纖維化，誘導PKM2四聚化以降低PKM2二聚體的水平可能是肝纖維化的潛在治療策略[26]。Zhou等[27]在肝纖維化小鼠肝臟中發現轉化生長因子β1(TGFβ1)可通過激活Smad、p38絲裂原活化蛋白激酶和P13K/AKT信號通路，引起HSC中有氧糖酵解的增加，并誘導HSC中的GLUT1表達，促進肝纖維化的發展，而在肝纖維化的小鼠模型中使用GLUT1抑制劑后，肝臟炎癥和肝纖維化的程度明顯降低。Ban等[28]研究發現，木香烴內酯可以抑制HK2的表達，進而抑制HSC活化，表明木香烴內酯抑制糖酵解可能是治療肝纖維化的潛在策略。HSC激活是肝纖維化過程中的核心環節，有氧糖酵解是其代謝標志之一。因此，阻斷糖酵解或將成為肝纖維化的一種新型治療選擇。

3.3 肝細胞癌 早在1956年，德國生理學家奧托·海因里希·瓦爾堡(Otto Heinrich Warburg)發現癌細胞更喜歡通過糖酵解消耗大量葡萄糖，而不是傾向于利用氧化磷酸化，即使在足夠氧氣的條件下也傾向于將葡萄糖轉化為乳酸鹽，這種現象被稱為有氧糖酵解或“Warburg效應”。盡管在有氧糖酵解過程中ATP的產生效率較低，但在不同腫瘤中仍占ATP供應量的50%～70%[29]。此外，在有氧糖酵解過程中產生的中間體可用于腫瘤生物大分子的生物合成，以滿足快速生長的需求，乳酸的產生也提供了一個酸性環境，以幫助癌細胞的侵襲和轉移[30]。HCC中有氧糖酵解的分子機制是一個復雜的過程，既包含細胞質中糖酵解酶活性的改變，也包含細胞核中的遺傳變化，靶向抑制有氧糖酵解中關鍵酶的變化將在很大程度上影響HCC的進展。

HK是有氧糖酵解中的第一種限速酶，可催化葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)。HK有4種亞型，即HK1、HK2、HK3和HK4，但大多數正常組織僅表達HK1。然而，HK2在HCC組織中高度表達[31]，并且相對于其他亞型，HK2在促進有氧糖酵解方面更有效。首先，HK2與線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependentanionchannels，VDAC1)相互作用并結合，促進ATP合成相關酶的活化，以增強ATP的生成，并抑制細胞凋亡(圖1)。其次，當HK2與VDAC1結合時，其不會受到下游產物如G-6-P的抑制作用，從而增強糖酵解過程和提高ATP生成速率[32]。HK2的消耗可抑制糖酵解通量并誘導氧化磷酸化，增強HCC對藥物(如二甲雙胍)的敏感性，此外，HK2抑制劑還可協同增強HCC對索拉非尼的敏感性，從而抑制小鼠的腫瘤生長[31]。因此，基于HK在HCC中的關鍵作用，HK2或將成為開發HCC新療法的靶點。

磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase 1，PFK1)是參與糖酵解的第2種限速酶，可利用ATP催化果糖6-磷酸(F-6-P)轉化為果糖-1,6-二磷酸(FDP)。PFK1有3種亞型，分別為PFK-M、PFK-P和PFK-L，這些亞型的比例在不同組織中可能根據其特定的能量代謝需求而有所不同[33]。完全活化的PFK1以四聚體的形式存在，PFK1四聚體的形成和穩定在很大程度上影響糖酵解通量速率。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶3(PFKFB3)分子是PFK1的變構激活劑，可催化果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)的產生。PFKFB3在HCC糖酵解的調節以及腫瘤生長和轉移中發揮重要作用，PFKFB3可易位至細胞核中，以調節細胞周期依賴性激酶(cyclindependent kinase，CDK)的活性，導致細胞周期阻滯并抑制細胞死亡[34](圖1)。研究[35]發現，在抑制PFKFB3的表達后聯合使用阿司匹林與索拉非尼，可通過誘導HCC細胞凋亡來克服索拉非尼的耐藥性，以增強HCC的治療效果。因此，在尋找化療藥物與糖酵解抑制劑的組合時，運用PFKFB3抑制劑可能成為克服索拉非尼耐藥性的有效手段。

糖酵解過程中的最后一種限速酶是丙酮酸激酶(PK)，其催化磷酸烯醇式丙酮酸產生ATP和丙酮酸。PK具有4種亞型，包括PKL、PKR、PKM1和PKM2，其中PKM2在癌細胞中高度上調，并且與預后不良有關[36]。PKM2有2種形式，一種是位于細胞質中的四聚體，具有較高的催化活性，可以迅速將磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸、增加糖酵解通量和產生更多的ATP；另一種亞型是單體或二聚體，具有較低的催化活性，并且可以易位至細胞核中作為幾種轉錄因子[例如缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)、β-catenin/c-Myc、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)]的共激活劑[37](圖1)。一旦進入細胞核，PKM2可促進靶基因的轉錄，例如HIF-1α靶向表達GLUT、PKM2、LDH-A和血管內皮生長因子A，從而促進癌細胞的生長，正反饋調節糖酵解和血管生成[38]。PKM2的表達水平與HCC的臨床病理特征有關，例如腫瘤的大小、數量和臨床分期，并且PKM2表達水平較高的HCC患者相較于PKM2水平較低的HCC患者表現出更高的復發率[39]。紫草素(shikonin)和原花青素B2可抑制PKM2的表達和有氧糖酵解的發生，從而抑制HCC的生長，表明PKM2有望成為治療HCC的又一治療靶點[40-41]。

注：HK2、PFK1和PKM2是糖酵解過程中的3種限速酶。HK2可催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，并與線粒體外膜上的VDAC1相互作用和結合，從而促進ATP的產生和抑制細胞凋亡。PFK1可催化F-6-P為FDP，其活性受PFKFB3催化產物F-2,6-BP的調節。PKM2不僅能夠催化PEP合成丙酮酸，還能夠移位至細胞核內，與一些轉錄因子如HIF-1α、β-catenin/c-Myc、NF-κB和STAT3共同激活，促進相關靶基因的轉錄。

4 小結與展望

糖酵解與線粒體功能障礙密切相關，由異常糖酵解引起的線粒體功能障礙與ROS產生軸之間的惡性循環促使肝病進一步惡化。在NAFLD肝細胞中，糖酵解顯著增強，導致血漿和肝臟中丙酮酸鹽的水平增加。丙酮酸也可以通過為三羧酸提供中間體轉化為草酰乙酸或乳酸，兩者在NAFLD中均增強。糖酵解活性的增強將促進線粒體ROS的產生，導致NAFLD進展為NASH，抑制mtROS維持線粒體穩態或可作為NAFLD的潛在治療方案，阻止疾病進一步發展。越來越多的證據表明，HSC的活化過程中存在有氧糖酵解，在肝纖維化中，部分相關代謝途徑發生改變，因此通過一些代謝途徑阻斷糖酵解或將成為肝纖維化的一種新型治療選擇。有氧糖酵解在HCC的進展中發揮重要作用，包括增殖、免疫逃避、侵襲轉移、血管生成和耐藥性，通過靶向有氧糖酵解中包含的關鍵酶(例如HK2、PFK或PKM2)以及其他調節途徑對于突破當前HCC治療中的局限性可能具有重要意義。反觀肝衰竭，其核心機制為內毒素、免疫反應和炎癥級聯反應等[42]，并且糖酵解參與其中[43]。筆者所在團隊前期研究[44]發現，解毒化瘀顆粒可通過調節急性肝衰竭大鼠肝線粒體PT孔開放，阻止線粒體通透性轉換，抑制細胞色素C的釋放，影響caspase-3蛋白活性，從而抑制肝細胞凋亡。同時，還可能通過促進PI3K/AKT/mTOR信號通路表達進而有效改善肝細胞氧化應激與線粒體受損[45]。在往后的研究中，可以嘗試以糖酵解與線粒體功能障礙之間的關系為落腳點，探索兩者在肝衰竭疾病進展過程中的代謝途徑變化，開展對肝衰竭進展的把控以及治療靶點的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：顏耿杰負責課題設計，資料分析，撰寫論文；林鏞、蘇會吉、陳含笑、班少群參與收集數據，修改論文；毛德文、韋艾凌、龍富立負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。