沼澤紅假單胞菌的培養優化及植物病害防治研究

顏 綱，鄒 寧，高樂天

魯東大學，山東煙臺 264000

沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris），紅螺菌科，紅假單胞菌屬，屬于光合細菌中紫色非硫細菌屬的代表菌種之一，也是目前應用較廣泛的光合細菌之一。

王蘭等[1]利用沼澤紅假單胞菌和纖細紅螺菌、球形紅假單胞菌的混合菌液處理蝦池養殖廢水，4 d后發現混合菌體對養殖廢水中的COD、氨氮的去除率分別達到了72.59%、89.2%。崔藝久等[2]對沼澤紅假單胞菌的培養基和培養條件進行了優化以獲得類胡蘿卜素，在培養7d后，類胡蘿卜素最大產量達2.863 mg/g。楊素萍等[3]探究了沼澤紅假單胞茜Z菌株光合產氫的主要影響因素，研究結果表明：在標準狀況下，菌株的最大產氨速率可達19.4 mL/（L·h）。

易力等[4]從洛河水域分離篩選得到2株光合細菌，分別為沼澤紅假單胞菌、萬尼氏紅微菌，這2種菌對模式菌株金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有較好的抑制作用，且沼澤紅假單胞菌對大腸桿菌的抑制效果優于萬尼氏紅微菌，后者對金黃色葡萄球菌的抑制效果優于前者。吳希陽等[5]研究發現，沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris，PSB06）對稻瘟病具有良好的防治效果。進一步分離抑菌活性物質，利用蛋白層析分離技術分離得到一個Atp2蛋白。后期試驗證明：Atp2蛋白能干擾稻瘟病病原菌附著胞的形成，從而降低其在水稻寄主上的致病力和侵染力[6-10]。

為了進行大規模、低成本、高產量的生產，對細菌的培養基配方、培養條件等進行探究優化實驗。而在培養過程中實際應用時發現，沼澤紅假單胞菌對冬棗病害具有一定的治療效果，因此，設計其對不同果樹、不同病害的防治實驗，以期獲得對某些植物病害防治效果佳，對環境、人都安全且無毒害的生物防治手段。

1 沼澤紅假單胞菌的培養優化

實驗用到的沼澤紅假單胞菌菌種和原始培養配方由實驗室提供。考慮光合細菌生長需要光，反應容器采用透光性較好的塑料桶（10 L）。實驗用到的藥品原料為市場上容易購買的藥品，這也是為了盡可能貼近實際生產，為大規模培養提供研究基礎。由于是室內自然條件下培養沼澤紅假單胞菌，環境中的溫度、光照強度等因素只能作為實驗過程中的參數進行記錄，不能作為培養條件的優化因素。

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 沼澤紅假單胞菌，由魯東大學藻類工程中心提供。

1.1.2 試劑及儀器 試劑：結晶乙酸鈉、無水氯化鈣、硫酸鎂、葡萄糖、硫代硫酸鈉、次氯酸， 酵母膏、尿素、復合肥1（N-P2O5-K2O)、復合肥2、磷酸二氫銨、硝酸銨。儀器：紫外分光光度計、照度計、燒杯、攪拌棒、10 L塑料桶。

1.2 實驗方法

（1）C源優化實驗：對培養基中的C源(結晶乙酸鈉)進行濃度優化，設置其濃度梯度為3、5、10、20、50、100 g/L的實驗組；（2）N源優化實驗：對培養基中的N源進行種類優化，可供選擇的N源有：尿素、復合肥（N-P2O5-K2O）、硝酸銨、硝酸鈉和磷酸二氫銨；（3）P源優化實驗：對培養基中的P源進行種類優化，可供選擇的P源有；磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨和復合肥。將10 L塑料桶中裝入9 L用次氯酸鈉消毒法進行消毒自來水，加入按照上述培養基方法分別配置的培養基后，以10%的接種量接種沼澤紅假單胞菌菌種，接種后對培養液進行振蕩混勻，立即測量相關參數，主要包括OD560、溫度（水溫）、光照強度、pH值等。以此作為初始數據，之后每天定時進行振蕩搖勻操作和測量實驗數據。

上述實驗完成后發現能使細菌生長較好的N、P源有：磷酸二氫鉀、復 合 肥1（N:P:K=28:6:6）和 復 合 肥2（N:P:K=15:15:15）。對上述N、P源進行濃度優化，以不添加任何N、P的配方為對照組，設置復合肥1組、磷酸二氫鉀組、復合肥2組，分別設置濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L，每個梯度設置3個重復。重復以上培養過程。

1.3 結果與分析

（1）C源優化實驗。由圖1可知，在自然條件下，乙酸鈉的添加量對沼澤紅假單胞菌的生長有影響，其中5、10、20 g/L的濃度較好，添加量為10 g/L時，有最大增長量。單因素分析發現，P=0.000＜0.01，具有極顯著性。因此，可確定C源（乙酸鈉）最佳添加濃度為10 g/L。

圖1 濃度優化實驗細菌的生長曲線

（2）N、P源種類優化實驗。由圖2可知：復合肥組、NH4H2PO4組和KH2PO4組等N、P源都可以促進沼澤紅假單胞菌生長。總體來看，復合肥組的促進效果最 佳，NH4H2PO4次之，NH4H2PO4效果較弱。最終確定P源為復合肥和磷酸二氫鉀。

圖2 氮、磷源種類優化實驗細菌生長曲線

（3）N、P濃度優化實驗。由圖3可知，在自然培養條件下，添加復合肥2（N:P:K=15:15:15）可以明顯促進細菌生長，最終OD560值可以達到1.322。但復合肥濃度達到一定程度后時對菌體生長的促進能力下降。經單因素分析，P=0.000＜0.01，即具有極顯著性，結合生長曲線，最終確定復合肥2的添加濃度為0.5 g/L。

圖3 復合肥2組濃度優化實驗細菌生長曲線

1.4 小結

實驗得知，N、P、C等基礎元素對光合細菌的生長有較大影響，C源乙酸鈉添加濃度在5、10、20 g/L都可較好地促進沼澤紅假單胞菌的生長。基于生產成本的考慮，確定最佳添加濃度為10 g/L。N源種類優化實驗結果表明：沼澤紅假單胞菌可以代謝硝態氮、銨態氮、復合型氮等多種氮源，其中，復合型的N源促進細菌生長的能力更強。在P源種類探究實驗中，復合肥和磷酸二氫銨的添加都可以顯著促進細菌生長，其中復合肥在實驗后期促進效果更好，但前期NH4H2PO4組的促進更明顯、快速。經過濃度優化實驗進一步確定最佳N、P源為復合肥（N：P：K=15：15：15），其對細菌生長都具有較好的促進效果，最佳添加濃度為0.5 g/L。

2 沼澤紅假單胞菌在植物病害防治方面的應用

2.1 實驗材料

2.1.1 菌種 沼澤紅假單胞菌，由魯東大學藻類研究中心提供。由從溫室大棚獲取棗銹病、棗炭疽病、白粉病、根腐病、葉霉病、晚疫病等病害植物部位后分別分離篩選得到病原菌。

2.1.2 試劑及儀器 試劑：結晶乙酸鈉、無水氯化鈣、硫酸鎂、酵母膏、抑菌試紙片（φ=1 mm）。儀器：超凈工作臺、細菌培養箱、移液槍、試管、培養皿、鑷子、接種針、涂布棒、酒精燈。

2.2 實驗方法

從植物患病部位取得帶有病害的組織，從中分離、篩選得到相關病害的病原菌株，將病原菌純化后，與培養一段時間的沼澤紅假單胞菌進行抑菌實驗，利用浸泡過不同處理方式菌液的抑菌試紙片在培養皿上進行抑菌實驗，通過其抑菌圈大小得到沼澤紅假單胞菌對相關病害病原菌的抑菌效果。

2.2.1 病原菌的分離、篩選、純化 患病的植物組織、器官進行研磨或用無菌水進行沖洗、浸泡得到菌懸原液，過濾得到菌懸液。將菌懸液稀釋后涂布到PDA培養基，培養一段時間后鏡檢。得到菌落后進行純化培養，采用劃線法將分離得到的菌落接種到平板上，確定其生長周期情況，確定合適的觀察時間。

2.2.2 制備光合細菌處理液 將沼澤紅假單胞菌發酵培養一段時間后，再分別將其進行相應處理，制成為經高溫滅菌后的菌液、離心后上清液、離心后的菌體經無菌水重懸的菌體、菌原液、無菌水等5種處理的菌液。將抑菌試紙片浸泡在上述5種處理液中半小時待用。

2.2.3 抑菌試驗 將純化后的病原菌接種到定點位置，將浸泡后的抑菌試紙片放置在接種了病害菌株培養基的特定標記區域中，培養一段時間后，鏡檢觀察是否具有抑菌圈并對抑菌圈大小進行測量、分析。

2.3 結果與分析

由表1可知，在植物病害防治實驗中，沼澤紅假單胞菌對棗銹病白粉病、葉霉病、褐腐病等病害的病原菌都具有極顯著的抑菌效果，對棗炭疽病具有顯著的抑制效果、對根腐病具有一定的抑菌效果。其中，發酵原液對棗炭疽病病原菌的抑制效果更好，上清液對棗銹病病原菌的抑制效果優于發酵原液經離心后，重懸菌體的菌液對棗炭疽病、棗銹病、白粉病的病原菌都具有較好的抑制效果，滅火后的菌液對棗銹病病原菌仍具有較好抑制效果，多種處理菌液對根腐病病原菌有一定的抑制效果。

表1 PSB對7種植物病害的抑菌率 %

3 結論

實驗得知，N、P、C等基礎元素對光合細菌的生長有較大影響。最佳C源乙酸鈉添加濃度為5、10、20 g/L；N源優化實驗中，復合肥2（N:P:K=15:15:15）促進細菌生長的效果最好，最佳添加濃度為0.5 g/L；P源優化實驗中，NH4H2PO4組的促進速率最快，復合肥2（N:P:K=15:15:15）的最終濃度最高，最佳添加濃度為0.5 g/L。綜合考慮促進效果及生產成本，確定最終培養基配方是將乙酸鈉濃度改為10 g/L，額外添加復 合 肥2（N:P:K=15:15:15）0.5 g/L。培養條件中，溫度在25℃以上、pH值為7.5～8.0時細胞生長更快。

在植物病害防治實驗中，實驗結果顯示：沼澤紅假單胞菌發酵液對棗銹病、白粉病、葉霉病、褐腐病、晚疫病、棗炭疽病等病害的病原菌都具有較好的抑制效果，對根腐病不具有抑制效果。實驗中還發現不同處理方式的發酵液對不同病害病原菌的抑制效果不同。其中發酵液、離心后的上清液、離心后的菌體重懸液、滅活的發酵液都對棗銹病病原菌、褐腐病病原菌、葉霉病病原菌具有顯著的抑制效果。發酵液、離心后的上清液、離心后的菌體重懸液對棗炭疽病病原菌、白粉病病原菌以及晚疫病病原菌具有較好的抑制效果。