華重樓種子無菌萌發及實生苗培養初探

唐興國，周全，陳銀龍，米敏

(1.臺州市農業科學研究院，浙江 臨海 317000；2.武漢宜稞生態農業有限公司，湖北 武漢 430415)

華重樓是我國傳統名貴藥材，是廣義百合科重樓屬(Paris)多種植物的統稱，以干燥根莖入藥，具有消腫止痛、清熱解毒、涼肝定驚等功效[1]。現代藥理研究表明，重樓所含有的活性成分具有抗癌止血、鎮靜鎮痛、祛痰平喘、止咳抑菌和抗細胞毒等多種功效[2-5]。重樓是云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧、熱毒清等著名中成藥的主要原料藥之一[6-7]，市場需求旺盛。重樓中藥材的市場供應長期依賴野外采挖，由于無節制采挖和生態環境惡化，野生重樓資源日漸枯竭，近幾年國內重樓產新呈逐年衰減趨勢，2019年國內各產區加起來產新不足400 t，市場需求缺口巨大[8-9]。過去幾年，國內每年需從越南、緬甸、尼泊爾、巴基斯坦等國進口重樓用以補充缺口，但進口重樓藥材質量良莠不齊，有效成分含量難以達到新版藥典0.6%的要求[10-11]。隨著國內對重樓藥材品質要求的提高，供需缺口將持續拉大。從長遠考慮，為了保護野生重樓植物資源，也為了穩定市場供給，大力發展重樓人工栽培，以家種重樓藥材替代野外采挖已成為必然選擇。

華重樓(Parispolyphyllavar.chinensis)別名蚤休、七葉一枝花[12]，是2020版中國藥典收載的重樓藥材的基源植物之一[11]。華重樓常規繁育方式有種子繁殖、根莖營養繁殖和組培快繁[13]。自然條件下重樓種子萌芽緩慢、出苗率很低，且種苗質量參差不齊[14-16]；根莖繁殖需大量消耗藥材原料，繁殖系數偏低、成本很高；組培快繁技術可很好保持母株的優良特性，且材料用量少、繁殖效率高，是華重樓繁育技術研究的理想突破方向[13]。

本實驗擬采用華重樓的成熟種子為外植體，重點探討華重樓種子無菌萌發過程中的外植體消毒、實生苗誘導與增殖等問題。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為野生馴化的高稈粉質華重樓當年新鮮種子，母株栽植于臺州市農業科學研究院重樓種質圃，待蒴果淺裂、種子部分外漏時采收。

1.2 方法

1.2.1 外植體的取材及預處理

選擇天氣晴好的上午10點左右采樣，取回的蒴果先用流水反復沖洗，再用洗滌劑清洗去污，然后剝離種子留作外植體。

1.2.2 外植體的消毒

外植體分別以2%、5%、10% NaClO溶液浸泡5、10、15、20 min，共計12個處理，同時以0.1% HgCl2溶液浸泡外植體10 min作為參照。具體操作流程為：將分離為顆粒的華重樓種子用紗布包裹后在自來水中沖洗1 h，再進行表面消毒，之后用無菌蒸餾水沖洗5次，最后用無菌吸水紙吸干表面水分。將經過消毒的種子接入附加0.3 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1 mg·L-11-萘乙酸(NAA)、30 g·L-1蔗糖的MS固體培養基培養28 d，分別統計外植體污染率和存活率。

污染率=已污染外植體總數/接種外植體總數×100%。

存活率=存活外植體總數/接種外植體總數×100%。

1.2.3 實生苗誘導條件的正交試驗優化

以30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1瓊脂的基本培養基 (MS)為基礎培養基，分別以種子前處理方式、培養基中6-BA濃度和NAA濃度為參比因子，設計L9(34)正交試驗，探索適宜于華重樓種子無菌萌發的培養條件，試驗方案見表1。將經過外植體消毒后存活下來確認無污染的華重樓種子分類處理后接入誘導培養基，25 ℃光照培養，40 d后統計芽誘導情況。

表1 實生苗誘導正交試驗因素與水平設計

誘導率=成功誘導出苗的外植體總數/接種外植體總數×100%。

1.2.4 試驗方法

試驗中如未特別說明，培養條件一律控制在溫度25 ℃，光照強度750～1 500 lx，光照10 h·d-1，空氣相對濕度50%～70%。

所有培養基配好后均調pH 5.8，控制溫度121～125 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.5 數據處理

試驗所得數據全部使用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 外植體的消毒

外植體消毒前需完全分離，避免簇擁成團，消毒處理過程中動作輕柔，避免損傷外種皮。消毒試驗詳細結果見表2。

表2 外植體消毒試驗結果

比較K-1～K-4的消毒效果，可以發現：當NaClO濃度為2%時(K-1～K-4)，不同處理時間下消毒效果都不理想，外植體基本全部染菌；當NaClO濃度為5%和10%時(K-5～K-12)，隨著消毒時間延長，外植體染菌情況逐步緩解，但是當消毒時間延長到20 min時，外植體受消毒劑損傷嚴重，后期很難恢復，培養14 d后過半材料變褐凋亡；試驗中采用0.1% HgCl2浸泡10 min進行了對比試驗，發現適宜濃度的HgCl2與NaClO對華重樓種子的消毒效果大致相當。綜合考慮試驗可靠性和安全性，最終確定以5% NaClO浸泡15 min作為后續工作中外植體消毒的首選方法，避免將具有較大毒性和環境危害風險的HgCl2引入實驗體系。

2.2 實生苗誘導條件正交試驗結果

實生苗誘導條件正交試驗結果見表3。將誘導率數據轉換為反正弦值后輸入SPSS 19.0進行方差分析得到表4。

表3 實生苗誘導條件正交試驗結果

表4 各因素水平間差異顯著性比較(SSR檢驗)

從表3可以發現：因素A(種子前處理)間的F=91.841，0.010.05，因素C(NAA用量)間的F=21.159，0.01C>B。進一步進行各因素水平的多重比較，結果記入表4。

表4結果顯示，在重樓種子無菌萌發實驗中，人工剝除外種皮和輔以赤霉素溶液浸泡均對種子無菌萌發有正向促進作用；培養基中適量添加NAA對種子無菌萌發也有明顯影響；而6-BA的不同使用水平在實驗中沒表現出差異。綜合以上分析，可以初步確定重樓種子無菌萌發的較適宜誘導條件為人工剝除外種皮、向培養基中添加0.25 mg·L-1的NAA和0.5 mg·L-1的6-BA。由于上述培養基配方不在正交試驗的9種方案之內，故進行了試驗驗證，結果顯示，剝除外種皮的華重樓種子在此培養基上培養40 d，實生苗誘導率接近70%，且華重樓無菌實生苗在此培養基上連續傳代培養，可由單葉實生苗成功誘導出了多芽球莖和多葉大苗(圖1)。

A—華重樓種子無菌萌發所得實生苗；B—華重樓實生苗繼代后二次分化；C—華重樓實生苗分化出帶有多個芽原基和根原基的小球莖；D—華重樓實生苗由單葉小苗分化形成的多葉大苗。圖1 華重樓無菌實生苗誘導結果

3 小結與討論

隨著野生重樓資源的日趨枯竭，國內重樓中藥材市場的供需失衡現象日漸凸顯。通過發展重樓人工栽培技術，一方面可以穩定市場供給，另一方面也可保護野生重樓資源。而重樓人工栽培技術的關鍵技術瓶頸就在于種苗繁育。相較于種子繁殖和根莖營養繁殖，利用組織培養技術來繁育重樓種苗具有更廣闊的開發前景[13]。通過誘導重樓種子無菌萌發獲得實生苗的周期短，成苗率高，工作中以此為基礎開展重樓組培擴繁技術的深入研究，可一定程度上規避重樓組培工作取材難、外植體消毒難、初代培養脫分化難等問題。因此，系統研究重樓種子無菌萌發技術具有其現實意義。

本試驗在外植體消毒、種子無菌萌發條件優化方面做了一些探索，實驗中發現經過人工剝除外種皮的華重樓種子在后續培養中啟動更快、出苗率更高，且種子褐化少。這對開展重樓組培擴繁技術的相關研究具備一定的參考意義。這種現象與筆者在紫薇幼胚培養過程中觀察到的一些現象有相似之處[17]，究其原因可能與種皮中富含的某些成分會抑制種胚的早期萌發有關。

本實驗得到如下初步結論：隨著表面消毒劑作用濃度升高和作用時間延長，種子活力會逐漸喪失，因此，應考量表面消毒效果與保持種子活力兩者之間的平衡，實驗中0.1% HgCl2浸泡10 min和5% NaClO浸泡15 min均可滿足工作需要，綜合考慮試驗可靠性和安全性，最終選擇以5% NaClO浸泡15 min作為外植體消毒的首選方法，避免將具有較大毒性和環境危害風險的HgCl2引入實驗體系；人工剝除外種皮和輔以赤霉素溶液浸泡均對種子無菌萌發有正向促進作用，向培養基中適量添加6-BA、NAA對種子無菌萌發也有較明顯影響，本實驗確立的誘導重樓種子無菌萌發的培養條件為，人工剝除外種皮、向附加30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1瓊脂的MS培養基中添加0.25 mg·L-1的NAA和0.5 mg·L-1的6-BA。華重樓種子以此方法離體培養40 d，實生苗誘導率接近70%，實生苗在此培養基上連續傳代培養，可由單葉實生苗誘導出了多芽球莖和多葉大苗。