桑黃子實體中多酚含量測定的方法學研究

孫雨晴，吳偉杰，鐘石，霍進喜，朱儉勛，郜海燕，李有貴*

(浙江省農業科學院 a蠶桑與茶葉研究所，b食品研究所,浙江 杭州 310021)

桑黃是寄生于桑樹等闊葉樹上的大型真菌，具有抗炎、抗腫瘤、調節免疫等多種功效[1-8]。多酚是其發揮抗炎、抗腫瘤活性的重要活性成分[8-10]，因此,多酚含量是桑黃品質及藥用價值的重要指標。但是不同的提取和測定方法測得的桑黃多酚含量差異較大[10-11]，導致桑黃品質好壞的判定標準不統一，不同研究間的結果也難以相互比較。目前桑黃沒有收入藥典，前人對其多酚含量的測定多直接參照其他中藥材，缺乏針對桑黃本身的多酚測定方法學研究。本研究在參考前人研究方法的基礎之上，采用單因素考察實驗，逐一確定桑黃多酚的最佳提取方法，然后考察該提取測定方法的精密度、重復性、回收率、中間精密度等參數，最后利用該方法測定浙江地區不同來源的桑黃樣品多酚含量，為桑黃的多酚含量測定提供方法依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃子實體樣品由海寧宏欣農業生物科技公司、浙江千濟方醫藥科技公司、淳安千島湖桑都食用菌合作社提供。其中桑黃多酚提取方法優化研究中所用桑黃樣品均為海寧宏欣農業生物科技公司提供。

ML-204分析天平(METTLER-TOLEDO，上海)，HH-6恒溫水浴鍋(晶玻實驗儀器公司)，KQ-250E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，Cary60紫外-可見分光光度計(Agilent公司，美國)，UV-2800紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司，上海)。

沒食子酸(批號：C12504577，純度99%)購于上海麥克林生化科技有限公司，甲醇(分析純)購于上海凌峰化學試劑有限公司，乙醇(分析純)購于國藥集團化學試劑有限公司，磷鉬鎢酸(分析純)購于北京華科盛精細化工產品貿易有限公司，碳酸鈉(分析純)購于蘭溪市屹達化工試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品50 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2 標準曲線的繪制

精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液l mL，再分別加水11.5、11、10、9、8、7、6、5 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應的試劑為空白，參照紫外-可見分光光度法，在760 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 供試品溶液的制備

在提取方法的考察實驗中，供試品溶液采用不同考察方法下的操作步驟制備。最優提取方法建立后，精密度、重復性、回收率、中間精密度以及不同樣品含量測定均采用所建立最優提取方法制備。

1.2.4 供試品多酚含量的測定

精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，離心，取上清液，以相應的試劑為空白，在760 nm的波長處測定吸光度。從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的濃度，計算，即得。供試品溶液的多酚濃度超出標準曲線線性范圍時，應稀釋后再測。

1.2.5 粉碎粒度考察

取分別過三號篩、四號篩的粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇100 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.6 提取溶劑考察

取過三號篩的樣品粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入水、50%乙醇、50%甲醇、甲醇100 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用相應溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用相應溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.7 提取方式考察

取過三號篩的樣品粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入50%乙醇100 mL，稱定質量，分別超聲處理30 min、70 ℃水浴回流1 h，冷卻，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.8 液料比考察

取過三號篩的樣品粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入50%乙醇100、150、200 mL，稱定質量，70 ℃水浴回流1 h，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，分別精密量取濾液2、3、4 mL(對應溶劑量，使最后濃度一致)，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.9 提取時間考察

取過三號篩的樣品粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入50%乙醇100 mL，稱定質量，分別加熱回流1、2、3、4、5 h，冷卻，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.10 精密度考察

取過三號篩的樣品粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入50%乙醇100 mL，稱定質量，加熱回流3 h，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取濾液10 mL，置50 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取同一供試品溶液2 mL 6份，按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.11 重復性考察

取過三號篩的樣品粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入50%乙醇100 mL，稱定質量，加熱回流3 h，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.12 回收率考察

取過三號篩的樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入一定量的沒食子酸(分別相當0.5 g樣品含量的80%、100%、120%，各平行操作3份)，加入50%乙醇100 mL，稱定質量，加熱回流3 h，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照方法1.2.4節供試品多酚含量的測定方法測定多酚含量。

1.2.13 中間精密度考察

由不同實驗人員于不同時間取本品粉末約1 g，按重復性考察實驗，平行操作6份，分別于不同儀器上測定。

1.3 10批桑黃樣品的測定

按照重復性考察的方法，測定10批不同生產廠家的桑黃產品多酚含量，每個樣品平行操作2份。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

標準曲線的回歸方程為y=3.379x+0.034 2，R=0.999 8，表明沒食子酸在25～350 μg線性關系良好。

2.2 粉碎粒度

通過三號篩粉末提取所測得的多酚含量為2.99%，通過四號篩的粉末所測得的多酚含量為2.74%，因此,選擇多酚含量更高的三號篩。

2.3 提取溶劑

結果表明，水、50%乙醇、50%甲醇、甲醇提取所測得的多酚含量分別為0.72%、5.48%、4.76%、3.26%，以50%乙醇為溶劑的提取效率顯著高于其他溶劑，所以選取50%乙醇作為提取溶劑。

2.4 提取方式

常溫超聲處理所測得的多酚含量為5.61%，70 ℃水浴回流處理所測得的多酚含量為7.38%，70 ℃回流處理的多酚含量顯著高于超聲處理，所以選取70 ℃水浴回流處理作為提取方式。

2.5 液料比

提取1 g桑黃樣品加入提取溶劑100、150、200 mL所測得多酚的含量分別為7.37%、7.38%、7.39%，提取溶劑用量對提取效率的影響差異并不顯著，因此,選用更加節省溶劑的100 mL作為提取溶劑的體積，即料液比為1∶100。

2.6 提取時間

提取時間1、2、3、4、5 h所測得多酚的含量分別為7.37%、7.67%、8.32%、8.35%、8.35%，提取效率到3 h以后變化不大，因此,選擇3 h作為提取時間。

2.7 精密度

在單因素考察提取方法后，確定了桑黃粉碎粒度為過三號篩、1 g桑黃粉加入100 mL 50%乙醇水浴加熱回流3 h的桑黃多酚提取方法。在該提取方法下提取的供試品溶液，經磷鉬鎢酸顯色法測定6次，多酚含量分別為8.29%、8.27%、8.27%、8.41%、8.38%、8.27%，相對標準偏差(RSD)為0.76%，表明磷鉬鎢酸顯色法用于測定桑黃多酚精密度良好。

2.8 重復性

同一樣品經同樣提取步驟平行操作6份，測得多酚含量分別為8.44%、8.05%、8.09%、8.00%、8.17%、8.24%，RSD為1.95%，結果表明,該提取和測定方法重復性良好。

2.9 回收率

表1顯示，本方法的加標回收率在97.95%～106.46%，平均回收率102.11%，RSD為2.92%，表明本方法的準確度良好。

表1 沒食子酸加樣回收率(n=9)

2.10 中間精密度

2個實驗人員的12份樣品多酚含量檢測結果(表2)表明中間精密度良好。

2.11 10批浙江省內桑黃樣品多酚含量

在確定了本研究優化的方法具有良好的精密度、重復性、回收率之后，本研究測定了浙江省內10份不同來源或不同批次的人工栽培桑黃子實體切片樣品中的多酚含量。結果顯示，10份樣品多酚含量在3.98%～8.54%(樣品干重百分比)，不同廠家生產的桑黃子實體的多酚含量差異較大，多酚含量最高的是含量最低樣品的2倍多。同一公司不同生產批次的樣品多酚含量也存在差異，但是差異較小(表3)。

表2 中間精密度實驗結果

表3 10批浙江省不同廠家桑黃子實體樣品多酚含量

本研究測定的桑黃樣品多酚含量與其他文獻報道的桑黃多酚含量差異較大。雷萍等[11]將4 g桑黃樣品加入100 mL的70%乙醇55 ℃超聲提取60 min，提取2遍，用Folin-Ciocalteu比色法測定鮑姆桑黃5個品種(均來源于陜西省微生物研究所微生物技術研究中心)子實體，其多酚含量在1.11%～4.05%?！栋不帐≈兴庯嬈谥埔幏?2019年版)》[12]采用方法為0.1 g樣品加入甲醇50 mL超聲處理30 min的提取方法，用磷鉬鎢酸顯色法測得的安徽省內10份桑黃樣品的多酚含量為1.98%～4.77%。與其他文獻中報道的桑黃多酚含量相比，本研究中的桑黃多酚含量明顯提高。造成以上差異的原因，可能與提取方法、桑黃品種及產地、栽培方式等有關。

3 小結

本文開展了桑黃子實體多酚含量測定的方法學研究。多酚測定方法以沒食子酸為標準品，采用磷鉬鎢酸顯色法測定，該法在多酚(以沒食子酸計)含量25～350 μg范圍內線性關系良好。依次考察了桑黃子實體的粉碎粒度、提取溶劑、提取方法、料液比、提取時間等提取條件對多酚含量的影響，最后確定了粉碎粒度為過三號篩、料液比1∶100、50%乙醇70 ℃水浴加熱回流3 h的多酚提取條件。經方法學驗證表明，該桑黃多酚提取測定方法精密度、重復性、回收率、中間精密度均良好。利用該方法測定了來自浙江省內的10批桑黃樣品，其多酚含量在桑黃干重的3.98%～8.54%，其中不同生產廠家桑黃子實體多酚含量差異較大，同一廠家不同批次的桑黃多酚含量差異較小。本研究為桑黃多酚的提取測定提供方法學依據，也為浙江省的桑黃中藥飲片炮制規范中多酚檢測限的制定提供重要依據。